Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)

Caspase 3活性检测试剂盒(比色法)

简介：

Caspase 3又称CPP32、Yama 、apopain 、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 3 Colorimetric Assay Kit)的检测原理是利用Caspase 3催化底物p -nitroanilide (Ac-DEVD-p NA)产生黄色的游离硝基苯胺p NA(p -nitroaniline)，通过分光光度比色法测定p NA 在400～410nm 处吸光值，从而间接获得caspase 3的活性。

组成：

操作步骤(仅供参考)：

1、 制备标准曲线：

①_x0001_

按照Caspase Lysis buffer ：Assay buffer=1:9的比例配制适量的标准品稀释液。 ②_x0001_ 用标准品稀释液稀释p NA(10mM)，另外设置一管不加p NA 仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。

③_x0001_

取p NA 浓度分别为200μM 、100μM 、50μM 、25μM 、12.5μM 、6.25

μM 、0的标准品各100 μl 加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl 的比色杯，测定405nm 处吸光值即A 405。 ④_x0001_

用每一个标准品的A 405减去不含p NA 的空白对照的A 405，计算出实际

的吸光值。以每个浓度的标准品A 405为x 轴，以对应的p NA 浓度为y 轴，用Excel 制作p NA 浓度对A 405值的标准曲线。

2、 样品裂解：

①_x0001_

悬浮细胞：取实验样品和对照样品，离心收集细胞，小心吸除上清，同

时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次，再次小心吸除上清。按每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer 的比例加入Caspase Lysis buffer ，重悬细胞沉淀冰浴裂解。 ②_x0001_

贴壁细胞：弃细胞培养液，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集至细胞培养

编号 名称

CT0111 50T CT0111 100T Storage

试剂(A): Caspase Lysis buffer 10ml 20ml 4℃ 试剂(B): Assay buffer

10ml 20ml 4℃ 试剂(C): Ac-DEVD-p NA(2mM) 0.25ml ×2 0.25ml ×4 -20℃ 避光 试剂(D): p NA(10mM) 0.25ml ×2

0.25ml ×4

-20℃ 避光

使用说明书

1份

液，离心，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。按照每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，重悬细胞沉淀冰浴裂解。

③_x0001_组织样品：按每3～10mg组织加入Caspase Lysis buffer的比例加入

Caspase Lysis buffer，冰浴上用玻璃匀浆器匀浆并转移至1.5ml离心管中冰浴裂解。

④_x0001_离心取上清至新的1.5ml离心管。立即测定Caspase 3的酶活性或-70℃

保存样品。

⑤_x0001_蛋白定量：由于Caspase Lysis buffer含还原剂不宜采用BCA法，可采

用Bradford法测定蛋白浓度。以蛋白浓度达到1～3mg/ml为佳，否则应增加细胞或组织的量。

3、样品检测：

①按照下表设置96孔板反应体系，溶液应按照顺序依次加入，即Assay buffer→待

测样品→Ac-DEVD-p NA(2mM)，大多数情况下，每个反应体系加入10～15μl待测样品即可，并注意避免产生气泡。

空白对照高酶活性样品低酶活性样品Assay buffer 90μl 85μl 65μl

待测样品0μl 5μl 25μl

Ac-DEVD-p NA(2mM) 10μl 10μl 10μl

总体积100μl 100μl 100μl

②孵育：盖紧96孔板孵育。肉眼可见颜色发生变化时，即可进行A405检测；如果颜

色变化不明显，可适当延长孵育时间甚至过夜。

③待测样品A405分别减去空白对照A405即为样品Caspase 3水解底物产生的p NA

吸光值，根据标准曲线即可获得酶的含量。

④用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不

适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)，进而计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力单位即Caspase 3酶活力单位/mg protein。

计算结果：

①Caspase 3酶活力单位的定义：即当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切

1nmol Ac-DEVD-p NA产生1nmol p NA的caspase 3的酶量。根据p NA标准曲线和样品A405值，可计算出Caspase 3酶活力单位。

②Caspase 3酶活性的另外一种表示方法是Caspase活性增加的百分比即实验处理

组A405/实验对照组A405×100%，简单而可靠，可粗略的反应酶活性情况。

注意事项：

1、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。

2、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检

测体积，尽量采用100μl体积以内的比色杯。

3、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用裂解液稀释样品后重新测定。

4、样品蛋白有效含量过低或Caspase激活水平过低都会导致实际测得的A405过低，应注

意使蛋白浓度尽量达到1～3μg/ml，调整诱导凋亡的时间和条件。

5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

线粒体呼吸链复合物I活性比色法定量检测试剂盒产品说明书

线粒体呼吸链复合物活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 线粒体呼吸链复合物（－辅酶还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶同功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（）氧化后峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（）－辅酶还原酶的特异性活性检测。其用于衰老、能量代谢、蛋白组学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。 技术背景 线粒体呼吸链复合物，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶还原酶（；），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶（；），是线粒体电子传递链中最大的结构成分：含有至多个多肽结构。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的－辅酶还原酶（）。复合物催化线粒体内电子由供体传递到内膜上辅酶受体（泛醌；）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的第一步。基于辅酶底物，在鱼藤酮存在与否的情况下，通过－辅酶还原酶的催化，转化成还原型泛醌（），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（；）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（；），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（波长），由此定量测定－辅酶还原酶的特异活性。其反应系统是： 产品内容 缓冲液（）毫升 反应液（）毫升 阴性液（）毫升 底物液（）微升 专性液（）微升 产品说明书份 保存方式 保存在－℃冰箱里，避免反复冻融；反应液（）含有毒性物质，避免直接用手接触；反应液（）和底物液（），避免光照，有效保证月 用户自备 比色皿：用于比色分析的容器 双波长分光光度仪：用于比色分析 培养箱：用于孵育反应物 实验步骤

色度铂钴标准比色法

色度 （铂钴标准比色法） 方法原理 用氯铂酸钾与氯化钴配成标准系列，与水样进行目视比色。 干扰及消除 如水样浑浊,则放置澄清，也可用离心法或用孔径为0.45滤膜过滤以去掉悬浮物。但不能用滤纸过滤,因滤纸可吸附部分溶解于水的颜色。 仪器 50ML具塞闭塞管，其刻线高度应一致。 试剂 铂钴标准溶液：称取1.246g氯铂酸钾K2PCL6（相当于500铂）及1.000氯化钴 步骤 标准色列的配置: 向50ML比色管中加入0、0.5、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、4.50、5.00、6.00及7.000铂钴标准溶液，用水稀释至标线，混匀。各管的色度依次为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60和70度。密封保存。 水样的测定: 1、分取50.0ML澄清透明水样于比色管中，如水样色度较大，可酌情少取水样，用水稀释至50.0ML。 2、将水样与标准色列进行目视比较。观测时，可将比色管至于白瓷板或白板上，使光线从关底部向上透过液柱，目光自管口垂直向下观察。记下与水样色度相同的铂钴标准色列的色度。 计算 色度=A×50/B 式中： A------稀释后水样相当于铂钴标准比色法的色度 B------水样得体积（ML） 注意事项 可用重铬酸钾代替氯铂酸钾配置标准色列。方法是：称取0.0437g重铬酸钾 和1.000g硫酸钴(CoSo 4.7H 2 O)溶于少量水中，加入0.50ml硫酸，用水稀释至 500ml。此溶液的色度为500度。不宜久存, 如果样品中有泥土或其它分散很散狠细的悬浮物，虽经处理而得不到透明水样时，则只测“表面颜色”。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA 的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，

所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA 的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU 后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。 图1：EdU及BrdU原理示意图（摘至invitrogen说明书） 在一些情况下，细胞活力的检测相当于细胞增殖能力的测定。用于细胞活力检测的方法又很多，这些方法主要采用特殊的试剂来测定细胞的代谢活力，Alamar Blue，MTT及其他四唑盐。它们通过检测细胞的氧化还原活性来检测细胞增殖能力，所以这是一种间接的方法。 Calbiochem的快速细胞增殖试剂盒，或者，严格来说，叫细胞活力试剂盒，采用一

PCR-ELISA端粒酶检测法

PCR-ELISA端粒酶检测法 发布日期:2007-6-27 热门指数:782 收藏 端粒是真核生物染色体末端的特异DNA-蛋白结构，端粒DNA是一系列重复的富含G的DNA序列，这一序列在生物进化中有高度的保守性（人重复序列为TTAGGG）。已确认端粒在保护基因组DNA不被降解、防止染色体有害的结合（如染色体末端融合、重排、染色体移位和染色体缺失）中起重要作用。 由于DNA聚合酶不能复制线性DNA的最末端，多数正常体细胞的端粒末端每经一个复制循环就进行性缩短。这一现象在体内和体外都得到证实，并且可能与高级真核生物的正常体细胞有限的繁殖能力有关。 这一活性可能在与细胞衰老有关的情况中起作用。与体细胞相对照，生殖细胞是永生性的，它需要为将来器官形成保存全部的遗传信息。因此它必须对抗端粒缩短。这一工作通过在基因组染色体的末端添加新的端粒重复序列而完成。 端粒酶是一种核糖核蛋白，它们用自身的RNA成份的互补序列作模板，催化TTAGGG 重复序列加到染色体末端。在大多数永生性细胞株和肿瘤细胞株中也可见端粒酶活性的表达。端粒酶反应超越了细胞的增殖限制，这可能是恶性肿瘤发生的一个先决条件。 传统的端粒酶研究方法是以探针延伸为基础测定端粒酶活性。由于需要大量的样品材料，且检验灵敏度受局限, 这一方法已被端粒重复扩增法（Telomeric Repeat Amplification Protocol, TRAP）所取代。 标准的TRAP测定是通过PCR扩增端粒酶反应的产物，使用放射性标记，经凝胶电泳后，通过放射自显影显示结果。 这里介绍使用非放射性标记的检测端粒酶的新方法：活性光密度酶联免疫测定法。这种方法具有如下特点： 安全，无需使用放射性同位素 一步反应，使用即用的混合物使端粒酶介导的引物延伸和PCR扩增可在一个试管中进行。 应用广泛，扩增后可适用于不同分析法。 灵敏，与放射性同位素TRAP测定相当。 可靠，准确、重复性好。 快速，6-8小时得到结果。 现介绍如下： 1.原理： 本法是建立在Kim等人描述的TRAP方法的基础上的，它将端粒酶介导的衍生产物进行PCR 扩增, 并与后序的ELISA法结合在一起。本法可分如下几步： （1）延伸/扩增： 第一步：端粒酶将端粒重复序列（TTAGGG）加到带有生物素标记的P1-TA引物的3’末端。 第二步：利用引物P1-TS和T2通过PCR扩增这些延伸出的产物，产生出的PCR产物带有特异的端粒酶-6-核苷酸的延伸产物。 （2）ELISA测定： PCR产物变性后与Dig标记的端粒特异的重复检测探针杂交。终产物可经生物素标记的探

蒽酮法测还原糖

总糖的含量的测定（蒽酮法） 一、实验目的 掌握蒽酮比色法测定糖的原理与方法。 二、实验原理 蒽酮比色法是一个快速而简便的测定糖方法。蒽酮可以和游离的己糖或多糖中的己糖基、戊醛糖及己糖醛酸起反应，反应后溶液呈蓝绿色，在620 nm 处有最大吸收。蒽酮可与其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当样品中存有含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈红色。对于以上特定的糖类反应较稳定。 三、实验器材 1.吸管 2.试管 3.分光光度计 4.水浴锅 5.电炉 6.电子分析天平 四、实验试剂 1．蒽酮试剂：取2 g蒽酮溶于1000 ml体积分数为80 %的硫酸中，当时配制使用。 2．标准葡萄糖溶液（0.1 mg/ml）：100 mg葡萄糖溶于蒸馏水并稀释至1000 ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。 3． 6 mol/l HCl溶液。

4．10 % NaOH溶液：称取10 g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100 ml。 五、实验操作 1.制作标准曲线 取干净试管7支，按下表进行操作。 表蒽酮比色法测定糖含量的标准曲线制作 2.样品的处理（见实验四） 取上述实验四的水解液，冷却后用10 % NaOH溶液中和至pH呈中性，然后用蒸馏水定容至100 ml，过滤，取滤液10 ml，用蒸馏水定容于100 ml成稀释1000倍的总糖水解液，用于糖含量的测定。 测定时取1 ml总糖水解液测定还原糖的含量（同标准曲线）。

样品中糖含量的计算： w —糖的质量分数（%）； C —从标准曲线上查出的糖质量浓度(mg/ml)； V —样品稀释后的体积（ml ）； m —样品的质量（mg ）。 ｗ＝ CV ｍ ×100%

细胞沉默调节蛋白1(SIRT1)活性比色法定量检测试剂盒(中文

细胞沉默调节蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂盒（中文版） 主要用途 细胞沉默调节蛋白1 （SIRT1）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过比色探针对硝基苯胺标记人工合 成的乙酰化p53多肽底物，经过SIRT1脱乙酰基后，被位点特异性氨基肽酶水解，释放黄色对硝基苯胺， 即采用比色法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实 验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中SIRT1 的活性定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 人体组蛋白脱乙酰基酶（histone deacetylase；HDAC）家属分成三类共20多个蛋白：种类I（class I）与酵母 Rpd3蛋白同源，包括HDAC1、2、3、8，存在于细胞核中；种类II（class II）与酵母Hda1蛋白同源，包括 HDAC4、5、6、7、9a、9b、10和HDRP/MITR，存在于细胞核和细胞浆里；上述两大种类的蛋白分子催化 结构域含有锌，且曲古菌素A（trichostatin A；TSA）敏感。种类III（class III）为NAD+辅助因子必需，又 称为sirtuins，与酵母Sir2（Silent Information Regulator 2）同源，包括SIRT1至7等，为曲古菌素A（trichostatin A；TSA）不敏感型赖氨酸脱乙酰基酶（lysyl-deacetylase）。催化赖氨酸脱乙酰基反应，以及由NAD+和乙酰（acetyl）基团转化产生的烟酰胺（nicotinamide）和O-乙酰ADP核糖（O-acetyl-ADP-ribose）。SIRT1位于细 胞核内，与酵母Sir2同源性最高。其功能在于调节p53活性和抑制细胞凋亡。基于人工合成的乙酰化p53（379 至382氨基酸位点）多肽底物Ac-Arg-His-Lys-Lys（Ac）具有抗氨基肽酶切离的功能，首先使用比色染料对 硝基苯胺（p-Nitroaniline；p-NA）来标记乙酰化p53多肽底物，其次进行脱乙酰化，最后底物进一步在氨基 肽酶的催化酶解，释放出具有强烈吸光值的黄色对硝基苯胺（波长405nm），由此来定量测定沉默调节蛋 白1的活性。其反应系统为： Sirt1 Ac-Arg-His-Lys-Lys（Ac）-p-NA + NAD →Ac-Arg-His-Lys-Lys-p-NA + nicotinamide + O-acetyl-ADP-ribose 氨基肽酶 Ac-Arg-His-Lys-Lys-p-NA →Ac-Arg-His-Lys-Lys +p-NA 产品内容 裂解液（Reagent A）20毫升 分离液（Reagent B）80毫升 清理液（Reagent C）80毫升 萃取液（Reagent D）5毫升 缓冲液（Reagent E）3毫升 底物液（Reagent F）100微升 终止液（Reagent G）200微升 酶解液（Reagent H）200微升 补充液（Reagent I）500微升 产品说明书1份 保存方式

端粒酶活性检测方法

端粒酶活性检测方法 1.端粒重复序列延伸法 端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适 宜的寡核苷酸链的末端添加6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳可显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法(Telom—eric Repeat Amplification Protoc01．TRAP)。首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成AGGGT]rAG，然后每经过一次转位合成一个GGTTAG的6碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。1994年Kim 创建了该方法，它与DNA聚合酶分析方法相似，如；把核酸提取物、代表脊椎动物端粒重复序列的单链DNA前体(T1’AGGG)4和放射标记的磷酸脱氧核糖一起孵育，然后通过放射自显影检测凝胶上新添加的DNA重复序列。此方法是最早建立的方法，它稳定性好。其缺点是，需要样本量大，敏感性差，检测时间长，不适合临床标本的大量检测，检测时需同位素量较大。此法已基本被淘汰 2.TRAP法及其改进（关键是我们有没有PCR扩增机、电泳自 显影及图像分析） 其基本原理是利用CHAPS去污剂提取端 粒酶后，将反应体系中下游引物CX(5’-(CCATTA)

3CCCTAA-3’]用石蜡层与其他反应隔开，在石蜡层 上利用端粒酶的逆转录酶活性在非端粒核酸．TS(5’．AACCGTCGAGCAGAGTT-3’)引物3’末端合成端粒重 复序列，然后将反应产物进行PCR扩增，石蜡层在 高温时溶化，CX(引物加入到反应体系中，反应体系中含有(a-32P)dGTP或（a-32P）CTP。由于端粒酶每 合成一个TTAGGG就需要RNA模板重新定位，因 此，反应产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示为相隔 6bp的梯状条带，TRAP法由于利用PcR技术对端粒 酶合成的端粒DNA进行扩增，因此能从104个正常 细胞中检出混杂在其中的一个肿瘤细胞，这大大提 高了检测的敏感性、速度和效果。此方法较可靠，目 前应用最多。但TRAP方法的缺点在于：①电泳结 果与端粒酶活性程度呈非线性相关，使得测定端粒 酶相对活性较困难；8h至两天，时间太长 改进法一：TRAP银染法 们利用银离子与DNA结合的原理，把TrAP反应物在聚丙烯酰胺凝胶电泳后进行银染显示梯状条带，此方法的结果与同位素TRAP方法一样可靠、灵敏。 法二：接近闪烁分析法 为了解决聚丙烯酰胺凝胶电泳操作繁琐等问题，有人利用接近闪烁分析技术，在96孔板上进行．TRAP操作，使大规模筛

蒽酮比色法测总糖

[1] 姚立虎,徐茜. 蒽酮比色法测食品总糖含量的简化研究[J]. 食品工业992,03:40-42. 1. 2 试剂 0. 1 mg / mL, 1 葡萄糖标准溶液:准确称取10mg 葡萄糖标准品溶于少量蒸馏水中，溶解后转移至容量瓶中，用蒸馏水定容至100 mL. 蒽酮硫酸溶液:准确称取蕙酮50 mg 于100mL 二烧杯中，加入蒸馏水25 mL, ，缓慢加入98% 质量分数）浓硫酸75 mL, ，边加边搅（于冰水浴中完成），直至蕙酮溶解，冷却至室温后使用（临用新配）。 浓盐酸、浓硫酸、NaOH ，以上试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。 1. 3 方法 1. 3. 1 显色剂（蒽酮硫醇溶液）用量选择。向试管中加入0. 1 mg / mL 葡萄糖标液0. 1 mL, ，并加入蒸馏水至1m L, ，分别加入不同量的显色剂显色测定，以0. 1 mL, 蒸馏水为空 白对照。 1.3.2 显色时间选择。向10 mL 二试管中加入0. 1mg / mL 葡萄糖标液0. 1 mL 二并加入蒸馏水至1mL, ，在冰水浴中缓慢加入9 mL 显色剂摇匀，改变沸水浴时问，冷却至室温后测体系吸光度。 1.3.3 葡萄搪标准曲线的绘制。改变0. 1 mgmL 葡萄糖标准液和蒸馏水的用量，再分别加入9mL 显色剂，进行显色测定。 1.3.4 正交试验确定提取条件。采用正交试验，考查 4 个影响因素（料液比、盐酸浓度、提取时间、水解时问）对实验的影响，因素水平见表 1.

1.3.5 水溶性总搪的提取。取0. 5 g 棉花纤维于150 mL 圆底烧瓶中，加入30 mL, 蒸馏水，在沸水浴中加热60 mLn, 滤出提取液20 mL 于50 mL 烧瓶中，加 5 mol / L 盐酸 5 mL 继续在沸水浴中加热30 mLn ，冷却后，滴加一滴酚酞，用 5 mol / L, 1 的氧氧化钠中和至中性。 1. 3. 6 水溶性总搪的测定。取提取液 1 mL 于10mL 试管中，在冰水浴中缓慢加入9 mL, 蕙酮硫酸溶液摇匀，在沸水浴中加热9 mLn ，冷却后放置30min 测定吸光度。从标准曲线上查得对应的浓度并计算总糖含量。 2 结果与分析 2. 1 吸收曲线 用紫外刊一见分光光度计在500 ~700 nm 波长范围内进行光谱扫描，结果发现在625 nm 处有最大吸收，故本实验采用625 nm 为测定波长。 2. 2 显色剂用量 由图 1 可以看出，当显色剂用量为9 ml 二时吸光度最大，故实验采用显色剂用量为9 m l。

植物查尔酮合成酶(chalconesynthase)活性比色法定量检

植物查尔酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途 植物查尔酮合成酶（chalcone synthase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A缩合反应系统中释放出巯基辅酶A，使用Ellman试剂后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用比色法来测定植物裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种植物组织，包括种子（seed）、叶片（leaf）、根（root）、胚胎叶（cotyledon）、上胚轴（epicotyl）等查尔酮合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 查尔酮合成酶（chalcone synthase；CHS；EC2.3.1.74）是聚酮体合成酶（polyketide synthase；PKS）大家属中的一员，是启动类黄酮（flavonoid）化合物合成通路中第一步关键酶，形成植物系统性获得性抗性（systematic acquired resistance；SAR）的基础。查尔酮合成酶存在于细菌、植物和真菌中。在所有裸子植物（gymnosperm）和被子植物（angiosperm）的各种不同发育阶段中的不同组织中表达。查尔酮合成酶为同源二聚体，分子量为40至4000Kd，由环境压力，包括UV照射、伤口、病原菌袭击等诱导，通过丙二酰辅酶A脱羧基反应（decarboxylation）、与香豆酰辅酶缩合、聚酮体链延展（chain elongation）、中间产物环状化（cyclization）和芳构化（aromatization）产生查尔酮，一种类黄酮化合物前体，作为化学信使，由此生成各种后续继发性代谢化合物，参与抗病原微生物例如异黄酮植物保护素（isoflavonoid phytoalexin）、花青素花色素化、抵御环境压力（UV光保护）、花粉育性（pollen fertility）、抗氧化、共生根系结瘤（symbiotic root nodulation），以及作为抗生素、免疫抑制剂、抗肿瘤和抗真菌的药物作用。还在细菌的囊肿形成和阿米巴细胞分化中产生作用。基于香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A，在敏感性抑制剂木犀草素（Luteolin）存在与否的情况下，受到查尔酮合成酶的作用，缩合产生查尔酮，并释放出巯基辅酶A（CoA-SH），进而与Ellman 试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5,-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析查尔酮合成酶的活性。查尔酮合成酶反应系统为： 产品内容 清理液（Reagent A）毫升 裂解液（Reagent B）毫升 缓冲液（Reagent C）毫升 反应液（Reagent D）毫升 底物液（Reagent E）毫升 专性液（Reagent F）微升 产品说明书1份 保存方式 保存缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）避免光照；有效保证6月

实验8-植物组织中可溶性糖含量的测定(蒽酮比色法)

实验方案 一、实验目的 通过实验，掌握测定萝卜品质的方法 （一）萝卜外部形态的测定 1、实验材料 取鲜样3个∕小区 直尺、蒸馏水、笔、记录本、吸水纸 2、实验方法 ．用自来水将各组萝卜洗净后，再用蒸馏水洗涤，擦干表面水分．每个小区取3个重复，用电子天平称量每株的鲜重，用直尺测量植株的茎长、茎粗、叶长，取平均值作为指标值 实验(二) 植物体内可溶性糖含量的测定（蒽酮法） 一、实验目的 了解蒽酮法测定可溶性糖含量的原理；掌握分光光度计的使用二、实验原理 糖类物质是构成植物体的重要组成成分之一，也是新陈代谢的主要原料和贮存物质。不同载培条件，不同成熟度都可以影响水果、蔬菜中糖类的含量。因此对水果、蔬菜中可溶性糖的测定，可以了解和鉴定水果、蔬菜品质的高低。 蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，蒽酮可以与游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）作用生成蓝绿色的糖醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上述特定的糖类物质，反应较稳定。该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。 三、材料、仪器及试剂

1.材料：植物种子、白菜叶、柑桔 2.仪器：分光光度计；恒温水箱；20ml具塞刻度试管（3支）漏斗；100ml容量瓶；刻度试管；试管架；剪刀；研钵 3.试剂 （1）200μg/ml标准葡萄糖：AR级葡萄糖100mg，蒸馏水溶解，定容至500ml。 （2）蒽酮试剂：1g蒽酮，用乙酸乙酯溶解，定容至50ml，棕色瓶避光处贮藏； （3）浓硫酸 四、实验方法 1.葡萄糖标准曲线的制作 取6支20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均加入0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml 浓H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却至室温，在620nm波长下比色，测各管溶液的光密度值（OD），以标 2. 称取1克白菜叶，剪碎，置于研钵中，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆，然后转入20ml刻度试管中，用10ml蒸馏水分次洗涤研钵，洗液一并转入刻度试管中。置沸水浴中加盖煮沸10分钟，冷却后过滤，滤液收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀备用。 3.糖含量测定 用移液管吸收1ml提取液于20ml具塞刻度试管中，加1ml水和0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入5ml浓H2SO4（注意：浓硫酸遇水会产生大量的热！），盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中10分钟（比色空白用2ml蒸馏水与0.5ml蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温10分钟）。冷却至室温后，在波长620nm下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（μg）。 五、结果计算 样品含糖量（g/100g鲜重）=查表所得糖含量（μg）×稀释倍数×100/样品重（g）×106 六、注意事项

活性硅的测定(钼蓝比色法)

活性硅的测定（钼蓝比色法） 1原理 在PH值为1.1～1.3的溶液中，可溶硅与钼酸铵反应生成硅钼黄，再用氯化亚锡还原生成硅钼蓝，此蓝色的色度与水样中可溶性硅的含量有关。磷酸盐对本方法的干扰可用调整酸度及加草酸或酒石酸的方法加以消除。 当水样中可溶性硅含量小于每升0.5mgSiO2 时，可用硅钼蓝光度法或用正丁醇等有机溶剂萃取浓缩，以提高灵敏度，便于比色。 硅的测定范围：10－500μgSiO2/L和0.5－20mgSiO2/L。 2仪器 具有磨口塞的25ml比色管。 3试剂 3.1 5%(m/V)钼酸铵溶液：用除盐水配制，配制后溶液澄清透明。 3.2 1%氯化亚锡溶液：称取1.19g氯化亚锡(SnCl2 2H2O)于烧杯中，加20ml盐酸溶液(1+1)，加热溶解后，再加80ml纯甘油(丙三醇)，搅匀后将溶液转入塑料瓶中备用。 3.3C(H2SO4)= 5mol/L硫酸溶液：于720ml试剂水中徐徐加入280ml浓硫酸。3.4SiO2储备液的配制 称取0.1000（±0.001）克经700—800℃灼烧过（已研磨细）二氧化硅（优级纯），与（0.7～1.0）克已于270—300℃焙烧过的粉状无水碳酸钠（优级纯）置铂坩埚内混匀，用马弗炉升温至900—950℃，保温20～30min后，把铂坩埚在900—950℃温度下熔融5 min冷却后，将铂坩埚放入硬质烧杯中，用热的超纯水溶解熔融物，放在水浴锅上不断搅拌。待熔融物全部溶解后取出坩埚，以超纯水仔细冲洗坩埚内外壁，待溶液冷却至室温后，移入1L容量瓶中，用超纯水稀

释至刻度,混匀后移入塑料瓶中储存。此液应完全透明，如有浑浊须重新配制。 3.5 SiO2工作液的配制 3.5.11ug/ml的SiO2工作溶液： 吸取100ug/ml的SiO2储备液1.0ml，于100ml的容量瓶中.用高纯水稀释至刻度。 注：SiO2工作溶液应在使用时配制，且储存时间不宜过长。 3.5.20.02mg/ml的SiO2工作溶液： 吸取10ml的SiO2储备液，于50ml的容量瓶中,用高纯水稀释至刻度。 3.6正丁醇（或异戊醇) 4分析步骤 4.1活性硅含量大于每升0.5mgSiO2时，测定方法如下： 4.1.1于一组比色管中分别注入二氧化硅工作液(1ml含0.02mgSiO2)0.25、0.5、1.0、1. 5......ml，用无硅水稀释到10ml。 4.1.2在另一支比色管中注入适量水样并用无硅水补足到10ml。 4.1.3往上述比色管中各加0.2ml 5mol/L硫酸溶液，摇匀。 4.1.4用滴定管分别加入1ml钼酸铵溶液，摇匀。 4.1.5静置5min后，用滴定管分别加入5ml 5mol/L硫酸溶液，摇匀，静置1min。 4.1.6再分别加入2滴氯化亚锡溶液，摇匀。 4.1.7静置5min后进行比色。

细胞增殖及细胞活力检测方法

细胞增殖及细胞活力检 测方法 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

细胞增殖及细胞活力检测方法 目前主要有两种用于检测细胞增殖能力的方法。一种是直接的方法，通过直接测定进行分裂的细胞数来评价细胞的增殖能力。另一种是间接的方法，即细胞活力（cell viability）检测方法，通过检测样品中健康细胞的数目来评价细胞的增殖能力。显然，细胞活力检测法并不能最终证明检测样品中的细胞是否在增殖。如细胞在某一培养条件下会自发启动凋亡程序，但药物的干扰可抑制凋亡的发生；这时若采用细胞活力检测法，显然可以区分两种条件下的细胞数量，但我们并不能从药物干扰组细胞数大于对照组的事实说明药物可促进细胞增殖的结论。所以最直接的证据应该采用方法一。 用于检测细胞增殖能力最经典的方法是用氚标记的胸腺嘧啶核苷处理细胞，再检测DNA 链中氚含量。若细胞具有增殖能力，DNA合成过程中将会采用氚标记的胸腺嘧啶核苷作为合成原料，因此检测细胞DNA链内标记核苷酸的量可判断细胞是否进行DNA的合成。 但更为常用的方法是BrdU检测法。用BrdU预处理的细胞中，BrdU可代替胸腺嘧啶核苷插入复制的DNA双链中，而且这种置换可以稳定存在，并带到子代细胞中。细胞经过固定和变性处理后，可用免疫学方法检测DNA中BrdU的含量（如采用鼠抗BrdU单克隆抗体特异识别BrdU,再采用辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG二抗标记，最后用比色法或荧光的方法进行定量测定），从而判断细胞的增殖能力。 Calbiochem/EMD公司提供一种BrdU检测试剂盒，以微孔板的形式，合并所有清洗、固定、变性的步骤以单一试剂当中。比色检测在一抗二抗标记后在450nm下读数，所有操作在3小时内结束。而且该试剂盒的灵敏度与市场上其他同类产品相比是最强的。1000个细胞以上水平的检测只需用BrdU预孵育2小时，100个细胞则采用过夜预孵育，即可检测细胞的增殖能力。 BrdU法的一个缺点是需要固定和变性等破坏DNA的处理。有些情况下，研究者可能希望在测定细胞增殖能力的同时检测细胞的总DNA含量，然而，在变性条件下，DNA的双链结构将被破坏，DAPI和Hoechest 33342等核酸标记探针就不再能识别DNA，因而也无法估计DNA总量。Molecular Probes公司的Click-iT EdU检测试剂盒可以解决这个问题。这种方法不需要变性步骤，因为荧光探针标记的叠氮化物小分子，而不是庞大的抗体分子，可以很轻易的识别并结合未变性DNA双链中的EdU分子。 采用BrdU方法时，你必须非常小心的去对DNA进行变性，才能一方面使BrdU抗体进入细胞，另一方面又保留足够的双链DNA分子来进行细胞周期的分析。有了EdU后则不同，由于你不再需要变性，这一切都很简单了；另外，常常用于DNA变性的HCl，可能破细胞内坏蛋白的抗原识别位点，因而限制了BrdU检测法中同时检测其他蛋白的应用，但这种情况在EdU法中不存在。

饲料中淀粉的测定(蒽酮比色法)

化验室检测标准 饲料中淀粉的测定（蒽酮比色法）———————————————————————————————————————一、原理 用乙醇溶液去除饲料样品中的可溶性糖，再用高氯酸溶液溶解残留物中的淀粉，使淀粉与其他成分分离，在浓硫酸的作用下，蒽酮与淀粉反应生成蓝绿色的化合物，用分光光度计测定在640 nm 下的吸光度. 二、试剂配制 1.80％乙醇溶液； 2.52％高氯酸溶液； 3.蒽酮试剂(将 0.4 g 蒽酮溶于 100 mL浓硫酸溶液中，现用现配)； 4.淀粉标准液(将 200 mg 淀粉倒入 100mL 烧杯中，加入 5 mL 蒸馏水，加入 65 mL52％高氯酸溶液，搅拌全部溶解，转入 100 mL 溶量瓶中，加水定容，浓度 2 mg／mL；取上述标准淀粉溶液10.00 mL 于 250 mL 溶量瓶中，加水定容，此淀粉溶液的浓度为 80 ug／mL. ) 三．标准曲线 在洁净的试管，分别加入 0.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0 ug 淀粉标准液，每一个浓度2 个重复，加水调整各试管溶液均为 2.00 mL，在冰水中冷却 2 min，加入 6.00 mL 蒽酮－硫酸溶液，摇匀，在冰水中冷却 2 min. 将试管放入沸水中 5 min，各试管显色呈蓝绿色，取出试管，冷却至室温. 用2.00 mL 蒸馏按照上述操作作为空白参比，于 640nm 波长下比色，测定各试管溶液的吸光度. 以吸光度为横坐标，淀粉浓度作为纵坐标，绘制工作曲线，进行曲线拟合，得到吸光度和淀粉浓度之间的回归公式。 四．操作步骤 1.称取 1-2 g 饲料样品于 80 mL 离心管中，可溶性淀粉称取0.5g其中包括 2 个重复，加入 80％乙醇溶液 2 滴使样品湿润。 2.再加入 5 mL 水摇匀，加入 25 mL 热的 80％乙醇溶液, 摇匀后放置 5 min, 以2500 /分钟速度离心 5 min，倾出上清液。 3. 再用 30 mL 80％乙醇溶液提取1次。 4.于上述残留物中加入5 mL水和 30 mL 52％高氯酸溶液，搅拌 10 min，以 2500转/分钟离心 10 min。 5.将上清液转入 100 mL 溶量瓶中，残留物再用 35 mL 52％高氯酸溶液提取，合并提取液，以水定容。 6. 过滤，弃去最初5 mL滤液，吸取4.00 mL滤液于100mL溶量瓶中，加水定容. 取上述淀粉提取液 2.00 mL，测定沸水浴显色后溶液的吸光度. 五．计算公式 淀粉(％)＝G/(8M). 式中：G 为由饲料样品提取液测定的吸光度，由工作曲线回归公式计算出来的淀粉毫克数；M 为饲料样品的质量； 最后换算成每克饲料干物质中淀粉的含量。对于淀粉含量高，而且粗纤维含量低的谷物籽实饲料，推荐使用高氯酸水解－蒽酮比色法，其测定结果差较小，而作步骤快捷简便；对于粗纤维含量高的粗饲料，建议用酶水解法测定，但由于操作步骤繁琐，应尽量减少操作本身造成的实验误差，而且应该选用纯度高、活性强的酶制剂。

Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)

Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法) 产品简介： Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1~11等,均属于蛋白酶家族。Caspase 3又称CPP32、Yama、apopain、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3 可以剪切procaspase 2、6、7和9，可直接特异性剪切许多Caspase底物（如PARP、ICAD等），并在细胞核凋亡过程中起到重要作用。 Jimei Caspase 3活性检测试剂盒（比色法）(Caspase 3 Colorimetric A ssay Kit)的检测原理是利用Caspase 3催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)产生黄色的游离硝基笨胺pNA (p-nitroaniline)，通过测定分光光度比色法测定pNA在400~410nm处吸光值，从而间接获得Caspase 3的活性。 自备材料： 1、水浴锅或恒温箱 2、96孔板 3、酶标仪或分光光度 操作步骤（仅供参考）： 1、制备标准曲线： ①按照Caspase Lysis buffer：Assay buffer=1：9的比例配制适量的标准品稀释液。 ②用标准品稀释液稀释pNA(10mM)，使pNA分别达到200μM、100μM、50 μM、25μM、12.5μM、6.25μM，另外设置一般不加pNA仅含标准品稀释液作为 零管，把以上系列浓度物质作为标准品。 ③取pNA浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、 0的标准品各100μl加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl的比色 杯，测定405nm处吸光值即A405。 ④用每一个标准品的A405 减去不含pNA的空白对照的A405，计算出实际的吸光 值。以每个浓度的标准品A405 为x轴，以对应的pNA浓度为y轴，用Excel制作 pNA浓度对A405 值的标准曲线。 2、样品裂解： ①悬浮细胞：取实验样品和对照样品，1000g 4。C离心5min收集细胞，小心吸除

比色法

运用“HSB模型”测定烤瓷牙色彩的探讨 章加宇丁加根曾永红 [摘要]目的依据孟塞尔（Munsell）HVC颜色系统，运用Adobe Photoshop6.0软件的“HSB模型”，借助于计算机、数码相机探讨一种科学、量化、精确、快速的方法，以弥补肉眼比色不足的缺陷。方法对450例烤瓷冠用数码相机采集被比色牙与标准比色板色片的图片，通过Photoshop6。0软件局部拾色分析，运用“HSB模型”滑杆显示不同色片及被比色牙的H、S、B数值。结合Nickerson 色差公式，应用Office 2000 excel软件，制定快速运算、自动生成总色差表格，从中选取最小总差植的比色色片的色阶，作为被比色牙的色彩。结果随机选取临床色差极小，不易为肉眼所识别的烤瓷冠450颗，运用“HSB模型”比色，439颗色质良好，与邻牙协调；8颗色质稍偏差，细看能区别出修复体；3颗与邻牙有较大差别。结论：依据孟塞尔HVC颜色系统，运用“HSB模型”，借助数码相机，计算机并结合相关软件，对不同颜色进行测定，分析，制表显示总色差值、比色。该方法科学、量化，比色快速、方便。所需材料易取，具有临床应用价值。 关键词：HSB-模型；HVC颜色系统；烤瓷牙比色；计算机；色差值 随着口腔修复技术水平的日益提高，烤瓷冠、桥已成为牙体、牙列缺损的主要固定修复方式。烤瓷牙的色彩是烤瓷修复成功的重要因素之一，比色也就成为修复医生临床操作的重要步骤。由于比色方法，比色环境及比色操作者的个体差异，常规肉眼比色往往造成有些瓷色不很满意，尤其是遇到色阶差别不很明显的自然牙（以下称被比色牙），比色者更是很难识别。过去厂家曾研制推广出比色仪，由于取色头范围的局限性，而且价格昂贵，临床用于比色的单位相对较少。近年来，我科依据Mussel HVC颜色系统（这个表色系统于1905年由美国人Mussel发明，它使用色相环和色票表现物体的色相、亮度、饱和度三要素，反映了物体颜色的心理规律，可分别代表颜色的色相、亮度和饱和度的色知觉特

细胞活性测定

细胞活性测定方法 细胞活性指标通常包括细胞膜对核酸染料的通透性，代谢活性，膜电位等。核酸染料有多种，如EB带有单个自由正电荷，能通过完整细胞膜。而PI，TO—PRO—1，TO-PRO-3等等带一个有四铵基团和两个或两个以上正电荷的染料是不能通过完整细胞膜进入细胞内的。因而吸收了这些多电荷染料的细胞被认为是非活性的。另外，一些酸性染料，如上面提到的台盼兰，曙红等都是膜非通透性。 代谢活性是另一重要指标，它通过细胞内的酶的活性来判定。使用细胞某种酶的底物，它能通过（或是不能通过）完整细胞膜，在细胞内被酶切而产生荧光性，膜不通透性产物，能在细胞膜完好的细胞内存留，在细胞膜不完整的细胞内散失很快。通过检测荧光强度就可知细胞代谢活性。FDA(fluorescein diacetate)和CTC（5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride）是常用的两种底物。前者虽然透过细胞膜的速度较慢，但它的产物基本不往外通透。后者经细胞内脱氢酶催化而具有荧光性，能提供细胞呼吸代谢系统活性和细胞膜完整性信息。 正常细胞的细胞膜两侧维持着一个胞内为负的膜电位为梯度，带正电的亲脂性染料，如Cyanines类能因电梯度而通过细胞的脂双层膜聚积在活细胞内，带负电的亲脂性染料如oxonols会被排除在外。不再维持着膜电位梯度的细胞里，则会吸收更多Oxonols类染料。 用流式细胞仪测量的方法优点是，灵敏，荧光强度精确定量，快速高通量的检测逐个细胞，可同时检测细胞的多个活性指标，提高可信度，结果具有统计意义。缺点是，实验较MTT等复杂，费用较高。 常用的细胞活性测定方法有台盼蓝染色法、克隆（集落）形成法、3H放射性同位素掺入法、MTT法等。其中MTT法以其快速简便，不需要特殊检测仪器、无放射性同位素、适合大批量检测的特点而得到广泛的应用。但MTT法形成的Formazan为水不溶性的，需要加有机溶剂溶解，由于在去上清操作时会有可能带走小部分的Formazan，故有时重复性略差。为了解决这个问题，研究人员又开发了很多种水溶性的四氮唑盐类：如XTT、CCK-8（WST-8）等。 1．MTT法 MTT：化学名：3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲臜的有机溶剂对实验者也有损害。

端粒酶基本原理及技术方法

端粒酶基本原理及技术方法 摘要:近几年研究表明端粒酶与肿瘤的 发生发展密切相关，推测可能是一个广泛的肿瘤标志物。本文就端粒酶活性检测的原理，端粒酶的提取方法，TRAP扩增技术，四种结果分析方法以及如何进行质量控制与半定 量测定进行综述。 端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA组分于1995年 被克隆，其中含有端粒重复序列的模板；蛋白质组分具有RNA依赖的DNA多聚酶活性，结构尚不清楚。端粒酶能以自身RNA的模板区为模板复制合成端粒序列。在胚性细胞等增殖活跃的细胞中具有端粒酶活性，而在正常成熟体细胞中端粒酶失活，同时还发现绝大多数肿瘤细胞都呈端粒酶阳性，而在癌旁组织和正常组织阳性率很低，推测端粒酶可能是一个广泛的肿瘤标志物[1]。因此近几 年端粒酶在各种肿瘤中的研究日益深入，同时促进了检测方法的改进与完善。本文对其

检测方法综述如下。 1基本原理 端粒酶在体外可以以其自身RNA的模板区为模板，在适宜的寡核苷酸链的末端添加 6个碱基的重复序列，用聚丙烯酰胺凝胶电 泳可显示6个碱基差异的梯带。1994年Kim 建立了基于PCR基础上的端粒重复序列扩增法。TRAP反应原理见下图。 首先合成一个18nt的TS做上游引物，端粒酶结合TS末端的GTT并合成agggttag，然后每经过一次转位合成一个ggttag的6 碱基重复序列，端粒酶灭活后，加入一个 24nt的CX做下游引物，经过多次变性-退火-延伸，扩增端粒酶延伸产物。 2基本技术方法 标本来源手术摘除组织，针吸活检组织，胸水，腹水，膀胱或胰管冲洗液，棉拭子所取分泌物和尿液等。 端粒酶的提取方法早期采用超声等物 理破碎的方法在不同细胞中的提取效率差 异较大，此后采用去污剂裂解的方法在少量细胞获取了较稳定的端粒酶提取液。现详述