基于核酸扩增技术的蛋白质荧光检测方法研究

山东大学博士学位论文

目录

摘要……………………………………………………………………………………Ｉ符号与缩写…………………………………………………………………………一ＩＸ

１．１蛋白质概述…………………………………………………………………．．１１．２蛋白质的灵敏检测………………………………………．＇．：…………………２１．２．１纳米材料扩增策略………………：……………………………………３

１．２．２核酸扩增策略…………………………………………………………８１．３本论文解决的科学问题及研究内容…………………………………ｊ……１９１．３．１解决的科学问题………………。……………：………………………１９

参考文献…………………………………………………………………………２１

２．１引言……………………………………………………………………：……３７２．２实验部分……………………………．：……………………………………一３８２．２．１材料与试剂……二…………………………………………………．３８．２．２．２绑定触发的ＳＤＡ反应………………………………………………３９‘２．２．３连接反应……………………………………………………………．．３９

２．２．４ＤＥ—ＲＣＡ反应…………．．：…………………………………………＿．．４０

２．２．６凝胶电泳……………………………………………………………．．４０２．３结果与讨论…………………………………………………………………４０２．３．１“自封闭”适体探针介导的级联扩增策略用于蛋白质灵敏检测的原

２．３．３反应条件优化………………………………………………………．．４３

２．３．４方法的灵敏度考察……………’……………………………………．．４５

。

ｉ

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２．３．５．方法的特异性考察…………………………………………………．．４７

２．３．６精密度和加标回收率考察…………………………………………一４８

２．３．７方法的通用性考察…………………………………………………．．４９２．４结论…………………………………………………………………………………………………．５０参考文献…………………………………………………………………………５１第三章催化组装的三维ＤＮＡｗａｌｋｅｒ及核酸、蛋白质检测研究………………．５７３．１引言…………………………………………………………………………５７３．２实验部分……………………………………………………………………５８３．２．１材料与试剂……………………………………一：……………………５８

３．２．２Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ．ＭＮＢｓ功能化…………………………………………………………５９

ｗａｌｋｅｒ…………………………………．．…………５９

３．２．５凝胶电泳……………………………………：………………………．．５９’３．３结果与讨论：…………………………………………………………………６０３．３．１催化组装的３一ＤＤＮＡｗａｌｋｅｒ运行原理…．．：………………………．６０

３．３．２催化组装的３一Ｄ

３．３．３反应条件优化………………………………………………………．．６１

３．３．４核酸触发下的ｗａｌｋｅｒ反应过程…………………………：…………６２

３．３．５核酸触发的组装ＤＮＡｗａｌｋｅｒ系统的传感性能……………’．．．……．６３

３．３．６核酸触发的组装ＤＮＡｗａｌｋｅｒ系统的精密度和加标回收率………６４

３．３．７蛋白触发的组装ＤＮＡｗａｌｋｅｒ的反应过程…………………………６５’３．３．８蛋白质触发的组装ＤＮＡｗａｌｋｅｒ系统的传感性能…………………６６３．４结论…………………………………………………………………………………………………．６７参考文献…………………………………………………………………………６８

４．１引言…………．．：………………．．ｊ…………………………………．．＿．……………………………．７１４．２实验部分…………………………………………．．：．．：……………………．．７２４．２．１材料与试剂……………：……．．：………………………………………７２

４．２。２仪器………．：………………………………………………………………………………。７３

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５．３．２方法的可行性验证……………………………………………………９７

５．３．３反应条件优化…………………………………………………………９９

５．３．４方法的传感性能……………………………………………………．１０１

５．３．５方法的精密度考察…………………………………………………．１０２

５．３．６活细胞表面膜蛋白检测……………………………………………．１０３５．４结｛念………………………………………………………………………………………………．．１０４参考文献………………………：……………………………………………“．１０５第六章结论与展望……………………………………………………………．．：…１０９６．１结论……………………………………………………：…………………………………………．１０９６．２展望………………………………………………………………………………………………．１１０至炙谓｝……………………………………………………………………………………………………………．１１１博士期间发表论文……………．．：…………………………。……………………一１１３

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Ｃｏｎｔｅｎｔｓ

ＡｂｓｔｒａｃｔｆｉｎＣｈｉｎｅｓｅ）……………………………………．…………………．．ｊ………．………．………．…．ＩＡｂｓｔｒａｃｔｆｉｎＥｎｇｌｉｓｈ）…．…………………………………．………………．……………………．………．…ＶＳｙｍｂｏｌａｎｄＡｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ．……．…．…．……．………．…．．．．．……．．……．．………．．…．…．…．………．．．ＩＸＣｈａｐｔｅｒ１Ｐｒｅｆａｃｅ…．．．．………．……．．……．．…．………．．…．…．．．．…………．…．…．．．…．…．．．…．．．…．…１ｌ。．１Ｓｕｍｍａｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ……．…．．………．．．．．．……．…．…．．．…．……．．．…．……．………．．．１１．２Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ．．…．．…．………．…．．．…．………．…．………．．…．……．…．…２１．２．１Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙｂａｓｅｄｏｎｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．．………．．…．……．．．………．．．３

１．２．２Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｒｏｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙ．．．………．．．……．．………．．…．…．………．…．８１．３Ｔｈｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｐｒｏｂｌｅｍｓｔｏｂｅｓｏｌｖｅｄａｎｄｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｎｔｅｎｔｓｉｎｔｈｉｓｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ…．……．．．…．…．．………．………．．…．．．…．…ｉ…．．．…．．．…．…．．………………．．．……．．．１９１．：；．１Ｔｈｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｐｒｏｂｌｅｍｓｔｏｂｅｓｏｌｖｅｄ．．．…．．．…………．……．．…．……．．…．．．．…．１９

１．：；．２Ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｃｏｎｔｅｎｔｓ．…．……．…．…．…．．……ｉ．．；．．……．．．…．．…．．…．…．．．．………１９Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ．……．．．．．．．．…．…．．…．………．………．………．……．…………．…．．……．．．：…．．…．．．．…．２１Ｃｈａｐｔｅｒ２Ｓｅｌｆ－ｌｏｃｋｅｄａｐｔａｍｅｒｐｒｏｂｅｍｅｄｉａｔｅｄｃａｓｃａｄｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅ．．．．．…．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３７２．１Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ…………………………………………：……………………………＾……………３７２．２ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｅｃｔｉｏｎ．．．．．……．．…．．…………．…．…．…．．…．．．……．．…．．…．．．…．…．．…．．．…．．３８２．２．１Ｍａｔｅｒｉａｌｓａｎｄｒｅａｇｅｎｔｓ…………．……．………．……．．．…．．…．．…．．…．．…．．…．．…．．３８

２．２．２ＢｉｎｄｉｎｇｔｒｉｇｇｅｒｅｄＳＤＡ．…．……．……．．……．……．…………．…．．．…．…．．．．…．…．．３９

２．２．３Ｌｉｇａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３９

２．２．４ＤＥ．ＲＣＡｒｅａｃｔｉｏｎ………………………………………………………………………．４０

２．２．５Ｆ１ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ…………………………………………………………．４０

２．２．６Ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ………．．…．………．．…．……．…．．……．．…．………．．…．．．…．…．．４０２．３Ｒｅｓｕｌｔｓａｎｄｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ．…．．：……．……．…．…．…．．……．．………．．…．．……．…．…．……．．…４０

２．３．１Ｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｔｈｅｓｅｌｆ－ｌｏｃｋｅｄａｐｔａｍｅｒｐｒｏｂｅｍｅｄｉａｔｅｄｃａｓｃａｄｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｔｒａｔｅｇｙｆｏｒｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎ．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．４０

２．３．２Ｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｐｒｏｐｏｓｅｄｍｅｔｈｏｄ．…．…．．……．………．．…．．．：．．．．……．．．４１

２．３．３Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔ＿ｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ…………．．．．……．…．…．．．…．．…．．…．．４３

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