毕业论文实验步骤

5.1.1实验过程

5.1.1.1SM-GA-BSA抗原的制备

5.1.1.1.1SM与BSA的初始比对偶联效果的影响

1、pH9.6的碳酸盐缓冲液的配制；称取碳酸钠10.2g及碳酸氢钠16.8g溶于双蒸水中定容至6000ml；4℃冰箱保存备用；

2、称取五组200mgBSA分别溶于50mlpH9.6的碳酸盐缓冲液中，获得A、B、C、D、E溶液；

3、分别称取50mg、100mg、200mg、400mg、800mg链霉素，并将其分别溶于50mlpH9.6的碳酸盐缓冲液中，获得a、b、c、d、e溶液；

4、将Aa、Bb、Cc、Dd、Ee混合，再分别向五组中缓慢加入0.2mL25%的戊二醛，边加边搅拌。；

5、将加入戊二醛后的五组溶液置于室温下搅拌反应6h；

6、0.01mol/L、pH7.4PBS缓冲液的配制；称取8.0g NaCl、0.1g KCl、2.9g Na2HPO4·12H2O和0.2g KH2PO4,加双蒸水溶解，定容至1000mL，4℃冰箱保存备用；

7、反应完后用pH7.4的PBS缓冲液透析1d；

8、透析完后对每组进行SDS-PAGE凝胶电泳，看偶联是否成功；

9、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描；

10、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定链霉素与BSA的最佳初始量x。

5.1.1.1.2戊二醛的量对偶联效果的影响

1、称取五组链霉素与BSA（第一组实验的最佳初始量x）分别溶于碳酸盐缓冲液中，获得A′、B′、C′、D′、E′溶液；

2、向每组分别缓慢加入0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL25%戊二醛，边加边搅拌，获得a′、b′、c′、d′、e′溶液，将其置于室温下搅拌反应6h；

3、反应完后用pH7.4的PBS缓冲液透析1d；

4、透析完后对每组进行SDS-PAGE凝胶电泳，看偶联是否成功；

5、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描；

6、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定戊二醛的最佳加入量y。

5.1.1.1.3偶联时间对偶联效果的影响

1、称取五组一定质量的链霉素、BSA（第一组实验的最佳初始量x），并将其溶于100mL的碳酸盐缓冲液中；

2、分别向五个组中加入一定量的戊二醛（第二组实验的最佳加入量y），边加边搅拌；

3、将五个组置于室温下，分别搅拌反应2h、4h、6h、8h、10h；

4、待每组反应完后，用pH7.4PBS缓冲液透析1d；

5、透析完后对每组进行SDS-PAGE凝胶电泳，看偶联是否成功；

6、将链霉素，BSA、五个组的偶联抗原用碳酸盐缓冲稀释成一定浓度，用碳酸盐缓冲液作对照，进行紫外扫描；

7、根据紫外扫描结果计算偶联比，确定最佳反应时间t。

5.1.1.2链霉素-GA-OVA包被原的制备

其方法与SM-GA-BSA抗原的制备相同。

5.1.1.3根据以上三组实验，利用正交法分析出链霉素在用戊二醛合成抗原时的最优条件

1、根据上述三组实验的x，y，t对应分别设置三个变量；

2、对链霉素与戊二醛的初始比变量进行设置，x-1、x、x+1；

3、对戊二醛的量进行设置，y-0.1、y、y+0.1；

4、对偶联时间进行设置，t-2、t、t+2；

5、设计三因素三水平的正交试验；

6、对正交实验结果进行方差分析、F检验，确定出最优偶联条件。

5.1.1.4对不同偶联条件下的偶联液进行SDS-PAGE凝胶电泳：

1.各种溶液配制：

①30%丙烯酰胺：准确称取29g丙烯酰胺和0.8 g 双丙烯酰胺溶于60mL双蒸水中，于37℃溶解，然后补双蒸水至100mL，棕色瓶4℃保存

②浓缩胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl，pH6.8)：6.06gTris溶解在40mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调节pH至6.8，再用双蒸水加至50mL，4℃保存

③分离胶缓冲液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8):9.08gTris溶解在40mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调节pH至8.8，再用双蒸水加至50mL，4℃保存

④10%SDS：25gSDS，用双蒸水溶解至250mL。室温保存

⑤10%过硫酸铵(5ml)：0.5 g过硫酸铵溶解于5ml 双蒸水，可在密封的管内，4℃存放数月

⑥4ｘ分离胶缓冲液(100ml):75ml 1.5mol/l Tris-HCl(pH 8.8),4ml 10% SDS,21ml 蒸馏水,可在4℃存放数月

⑦4ｘ堆积胶（浓缩胶）缓冲液(100 ml):50ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8),4ml 10% SDS,46ml 蒸馏水,可在4℃存放数月

⑧电泳缓冲液(1L):3g Tris 碱,14.4g 甘氨酸,1g SDS,加蒸馏水至1L,pH 应该在8.3左右，在室温下长期保存

⑨5ｘ样品缓冲液(10ml):0.6 ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8),5ml 50%甘油,2ml 10% SDS,0.5ml 2-巯基乙醇,1ml 1% 溴酚蓝,0.9ml 的蒸馏水,可在-20℃保存数月

⑩考马斯亮蓝染色液(1L)：考马斯亮蓝R-250,1g;甲醇,450ml;蒸馏水,450ml;冰醋酸100mL.脱色:脱色液(1L)：甲醇,100ml;冰醋酸,100ml;蒸馏水,800ml.

2.具体操作步骤：

X%分离胶的计算：采用12%的分离胶

A液x/3ml

B液 2.5ml

蒸馏水（7.5- x/3）ml

10%过硫酸铵50 l

TEMED 5 l

总量10ml

①灌制分离胶

A.将玻璃板洗干净，烘干或者自然风干，装配好灌胶的模具，关键是确保凝胶玻璃板和垫片的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。

B.将A液、B液在一个小烧杯中混合，丙烯酰胺是神经毒素，操作时必须戴手套。

C.加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀，凝胶很快会凝固，所以操作要迅速。

D.小心将凝胶液用吸管或移液枪沿隔片缓慢加入模具内，避免在凝胶内产生气泡。

E.当加入适量的分离胶溶液时（凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm）,轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1～5mm的水层或异丙醇，这使凝胶表面变得平整。

F.等待30～60min,使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间会出现一个清洗的界面。聚合好后微微倾斜模具，用吸管或移液枪将水层或异丙醇层吸出，用吸水纸擦干残留水渍。

②灌制堆积胶

堆积胶经常使用5%的浓度，还是以两块量为例，成分如下：

蒸馏水 2.3ml

A液0.67ml

C液1ml

10%过硫酸铵30ul

TEMED 5ul

按以下步骤操作：

A. 将A液、C液和蒸馏水在三角瓶中混匀

B. 加入过硫酸铵和TEMED,并轻轻搅拌使其混匀

C. 将堆积胶加到分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端

D. 将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳子齿的末端没有气泡。

E. 约30min凝胶聚合，聚合后小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂。

F. 将凝胶放入电泳槽中，将电泳缓冲液加到内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。

③制备样品和上样

将各种样品（纯化前样品、过亲和柱后样品、加热后样品、0h取样的样品、空载质粒的样品）与5ｘ样品缓冲液在一个Eppendorf管中混合，100℃加热2～10min。稍微离心，将样品加到样品孔中。将样品加到加样孔的底部，并伴随着染料水平的升高而升高加样枪头，避免带入气泡。为了避免边缘效应，在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。

④电泳

接通电源，将电压调至150～200V之间开始电泳，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。结束后从电泳槽中取出玻璃板，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶。

采用考马斯亮蓝染色法

考马斯亮蓝染色液：1L

考马斯亮蓝R-250 1g

甲醇450ml

蒸馏水450ml

冰醋酸100ml

染色过程：

将胶置于染色液中，振荡染色0.5～1h,有时根据染色液用过的次数多少，适当延长染色时间。

⑥脱色

脱色液：1L

甲醇100ml

冰醋酸100ml

蒸馏水800ml

弃去染液，将凝胶在水中漂洗几次，加入脱色液直至背静干净，条带清晰可见。

所需药品与器材：

链霉素，戊二醛，牛血清白蛋白，卵清蛋白，碳酸钠，碳酸氢钠，氯化钠，氯化钾，十二水磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，盐酸，蒸馏水，丙烯酰胺，双丙烯酰胺，Tris，盐酸，SDS，过硫酸铵,甘氨酸，甘油，2-巯基乙醇，1%溴酚蓝，甲醇，冰醋酸，考马斯亮蓝R-250，TEMED 烧杯，容量瓶，分光光度扫描仪，透析袋，垂直电泳仪，磁力搅拌器，电子天平，移液管

实验五、纯化酶的电泳检测及比酶活测定

1、实验目的

学会采用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)分析基因工程产物和蛋白质的纯度鉴定及测定酶的比酶活

2、实验原理

SDS-PAGE电泳是主要用来测定蛋白质分子量大小及纯度分析的技术。如果在PAGE系统中加入十二烷基硫酸钠(SDS)，则蛋白质的迁移率主要取决于其分子量的大小，而与蛋白质所带的电荷和形状无关。SDS是阴离子去污剂，它能与蛋白质的疏水部分结合，并能把大多数的蛋白质分子拆分成亚基形式。由于大多数蛋白质与SDS结合的摩尔比为1.4：1，结合量很大，因此，加人SDS增加了蛋白质表面的负电荷，屏蔽了没有SDS时正常存在的任何一种电荷。SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象的变化，使得雪茄形状的蛋白质分子的轴比发生改变。在巯基乙醇的作用下，二硫键还原为巯基，不同蛋白质组成的短轴趋于一致，长轴与分子量成正比。因此，它们的电泳速度不取决于电荷和形状，仅与蛋白质的分子量有关。目前较流行的SDS-PAGE使用的都是线性垂直薄板状胶，这种胶是指在两层支持的玻璃板之间形成的薄片状凝胶。由于薄片胶可在同一胶上跑很多样品，使聚合、染色脱色具有一致性，所以薄片胶比管状胶的应用更广泛，本实验是按照Bio-rad的小凝胶系统来设计的，这些步骤也适用于其他系统。

经过亲和层析和加热纯化后，重组木聚糖酶应该在SDS胶片上显示出一个单一的条带，分子量应该与预期的一样，为40 kDa左右。同一个酶在相同的测定条件下，如果比酶活越高，则表示该酶的纯度越大，本实验中的木聚糖酶经过了亲和层析和加热两步纯化后，比酶活应该逐渐升高，且经过亲和层析后和加热后的比酶活相差不大。

3、实验材料和设备

A. 试剂

丙烯酰胺（电泳级）

双丙烯酰胺（N,N-甲叉双丙烯酰胺）

Tris碱

SDS (十二烷基磺酸钠，分析纯)

TEMED

过硫酸铵

甘氨酸

B. 工作液：

A液: 丙烯酰胺储存液，100ml

30% (w/v) 丙烯酰胺，0.8% (w/v)双丙烯酰胺

注意：未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒剂，操作时必须戴手套

29.2 g丙烯酰胺

0.8 g 双丙烯酰胺

加蒸馏水溶至100 ml，棕色瓶4℃保存

B液：4ｘ分离胶缓冲液，100ml

75ml 2 mol/l Tris-HCl(pH 8.8)

4ml 10% SDS

21ml 蒸馏水

可在4℃存放数月

C液：4ｘ堆积胶（浓缩胶）缓冲液，100 ml

50ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)

4ml 10% SDS

46ml 蒸馏水

可在4℃存放数月

10%过硫酸铵，5ml

0.5 g过硫酸铵

5ml 蒸馏水

可在密封的管内，4℃存放数月

电泳缓冲液：1L

3g Tris 碱

14.4g 甘氨酸

1g SDS

加蒸馏水至1L

pH 应该在8.3左右，在室温下长期保存

5ｘ样品缓冲液，10ml

0.6 ml 1mol/l Tris-HCl(pH 6.8)

5ml 50%甘油

2ml 10% SDS

0.5ml 2-巯基乙醇

1ml 1% 溴酚蓝

0.9ml 的蒸馏水

可在-20℃保存数月

C. 实验设备

蛋白质电泳装置（垂直板蛋白电泳仪和电源）

电源(电压200V，电流500mA)

100℃沸水浴

移液枪

摇床

1.5 mL小所料管

4、实验步骤

待检测的蛋白质分子量的大小决定了所使用的分离胶的浓度，下面为不同浓度的分离胶的分离范围：

丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的范围

15% 15～45kDa

12.5% 15～60kDa

10% 18～75kDa

7.5% 30～120kDa

5% 60～212kDa

制胶所需时间：

制分离胶60min

制堆积胶30min

上样15min

电泳45min

染色（考马斯亮蓝染色）1h

完全脱色8～12h

X%分离胶的计算：

A液x/3ml

B液 2.5ml

蒸馏水（7.5- x/3）ml

10%过硫酸铵50 l

TEMED 5 l

总量10ml

①灌制分离胶

A.将玻璃板洗干净，烘干或者自然风干，装配好灌胶的模具，关键是确保凝胶玻璃板和垫片的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。

B.将A液、B液在一个小烧杯中混合，丙烯酰胺是神经毒素，操作时必须戴手套。

C.加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀，凝胶很快会凝固，所以操作要迅速。

D.小心将凝胶液用吸管或移液枪沿隔片缓慢加入模具内，避免在凝胶内产生气泡。

E.当加入适量的分离胶溶液时（凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm）,轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1～5mm的水层或异丙醇，这使凝胶表面变得平整。

F.等待30～60min,使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间会出现一个清洗的界面。聚合好后微微倾斜模具，用吸管或移液枪将水层或异丙醇层吸出，用吸水纸擦干残留水渍。

②灌制堆积胶

堆积胶经常使用5%的浓度，还是以两块量为例，成分如下：

蒸馏水 2.3ml

A液0.67ml

C液1ml

10%过硫酸铵30 l

TEMED 5 l

按以下步骤操作：

A. 将A液、C液和蒸馏水在三角瓶中混匀

B. 加入过硫酸铵和TEMED,并轻轻搅拌使其混匀

C. 将堆积胶加到分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端

D. 将梳子插入凝胶内，直至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐。必须确保梳子齿的末端没有气泡。

E. 约30min凝胶聚合，聚合后小心拔出梳子，不要将加样孔撕裂。

F. 将凝胶放入电泳槽中，将电泳缓冲液加到内外电泳槽中，使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中。

③制备样品和上样

将各种样品（纯化前样品、过亲和柱后样品、加热后样品、0h取样的样品、空载质粒的样品）与5ｘ样品缓冲液在一个Eppendorf管中混合，100℃加热2～10min。稍微离心，将样品加到样品孔中。将样品加到加样孔的底部，并伴随着染料水平的升高而升高加样枪头，避免带入气泡。为了避免边缘效应，在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。

④电泳

接通电源，将电压调至150～200V之间开始电泳，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。结束后从电泳槽中取出玻璃板，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶。

⑤染色

采用考马斯亮蓝染色法

考马斯亮蓝染色液：1L

考马斯亮蓝R-250 1g

甲醇450ml

蒸馏水450ml

冰醋酸100ml

染色过程：

将胶置于染色液中，振荡染色0.5～1h,有时根据染色液用过的次数多少，适当延长染色时间。

⑥脱色

脱色液：1L

甲醇100ml

冰醋酸100ml

蒸馏水800ml

弃去染液，将凝胶在水中漂洗几次，加入脱色液直至背静干净，条带清晰可见。

⑦各个样品的比酶活测定

分别测定重组酶纯化前样品、过亲和柱后样品、加热后样品的蛋白质浓度和木聚糖酶活性，算出相应的比酶活。