多参数分析超抗原SEB诱导小鼠NKT细胞变化的流式细胞术
多参数分析超抗原ＳＥＢ诱导小鼠ＮＫＴ细胞变化的流式细胞术
王珊于力方李宁廖杰
（解放军总医院医学实验测试中心北京１００８５３）
Ｅ—ｍａｉｌ：ｗａｎｇｓｈａｎ３０１＠１２６．ｃｏｒｎ
摘要探讨采用四色荧光探针检测超抗原ＳＥＢ诱导小鼠ＮＫＴ细胞的多参数流式细胞术。选用培养Ｃ５７ＢＬ／Ｊ小鼠脾淋巴细胞。四色免疫荧光标记ＦＩＴＣ、ＰＩ、ＰｅｒＣＰ及ＡＰＣ，应用ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ型流式细胞仪，以Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ软件获取、分析及储存。经ＳＥＢ诱导后流式细胞术可同时检测到淋巴细胞亚群及ＮＫＴ细胞ＣＤ３＋ＮＫｌ．１＋，ＣＤ４＋ＮＫＩ．１＋，ＣＤ８＋ＮＫｌ．１＋的变化。第１０ｄ时，ＣＤ３＋／ＮＫｌ．１＋百分率达到最高。多参数的流式细胞术为研究ＮＫＴ细胞功能提供一种快速、客观及全面多指标的检测手段。
关键词流式细胞术；超抗原ＳＥＢ；ＮＫＴ细胞
中图分类号Ｒ４４６
ＭｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙＡｎａｌｙｓｅｔｈｅＣｈａｎｇｅｓｏｆＭｏｕｓｅ’ＳＮＫＴＣｅｌｌｓ
ＩｎｄｕｃｅｄｂｙＳｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＥｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＢ
ＷａｎｇＳｈａｎ，ＹｕＬｉｆａｎｇ，ＬｉＮｉｎｇ，ＬｉａｏＪｉｅ
（ＭｅｄｉｃａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ＆ＡｎａｌｙｓｉｓＣｅｎｔｅｒ，ＰＬＡＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１００８５３，Ｃｈｉｎａ）
ＡｂｓｔｒａｃｔＴｈｅｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆｍｏｕｓｅ’ｓＮＫＴｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌＥｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎＢ（ＳＥＢ）ｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｗｉｔｈｔｅｔｒａｃｈｒｏｍａｔｉｓｍｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅ．ＣｈｏｏｓｉｎｇｔｈｅＣ５７Ｌ／Ｊｍｏｕｓｅ’Ｓｓｐｌｅｎ—ｉｃｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｌａｂｅｌｅｄｂｙＴｅｔｒａｃｈｒｏｍａｔｉｓｍｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｉｎｃｌｕｄｉｎｇＦＩＴＣ．ＰＩ．ＰｅｒＣＰ．ＡＰＣ，ｕｓｉｎｇｔｈｅｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ—ｅｒ，ｔｈｅｄａｔａＷａｓａｎａｌｙｚｅｄａｎｄｓａｖｅｄｂｙＣｅｌｌｑｕｅｓｔｓｏｆｔｗａｒｅ．ＩｎｄｕｃｅｄｂｙＳＥＢ，ｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆｌｅｕｋｏｍｏｎｏｃｙｔｅｓｕｂ－ｇｒｏｕｐ
ａｎｄＮＫＴｃｅｌｌｓｓｕｃｈａｓＣＤ３＋ＮＫＴｌ．１＋，ＣＤ４＋ＮＫＴｌ．１＋，ＣＤ８４－ＮＫＴｌ．１＋ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ．Ｏｎｔｅｎｔｈｄａｙ，ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＣＤ３＋／ＮＫｌ．１＋ｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｔｈｅｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃｆｌｏｗｃｙ－ｔｏｍｅｔｒｙｉｓａｒａｐｉｄ，ｏｂｊｅｃｔｉｖｅａｎｄｏｖｅｒａｌｌｔｅｓｔｆａｃｉｌｉｔｙｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇＮＫＴｃｅｌｌ’Ｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．
ＫｅｙｗｏｒｄｓＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ；Ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎ；ＮＫＴｃｅｌｌ
流式细胞术（ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ）是一种对单细胞自动定量分析的新技术，具有敏感性高、客观性强、快速测量的特点，它综合了细胞学、生物物理学、化学参数，提供了可检测一个细胞群的多参数指标的方法，为研究者提供更多的信息…。
自然杀伤性Ｔ细胞（ＮａｔｕｒｅＫｉｌｌｅｒＴｃｅｌｌｓ，ＮＫＴ）是继Ｔ细胞、Ｂ细胞、ＮＫ细胞之后，由Ｆｏｗｌｋｅｓ等人首次在Ｃ５７ＢＬ／６小鼠体内发现的第四类淋巴细胞，因其表面既有Ｔ细胞特有的抗原受体（ＴＣＲ，ＴＣｅｌｌａｎｔｉ．ｇｅｎｒｅｃｅｐｔｏｒ），又有ＮＫ细胞特有的抗原受体（鼠ＮＫｌ．１／人ＣＤｌ６１）而得名旧Ｊ。它既不同于Ｔ淋巴细胞也不同于ＮＫ，细胞具有独特的生物学特性和生物学功能，从目前研究来看，此类细胞免疫调节功效超过其免疫效应功能旧Ｊ，在抗感染、抗肿瘤、移植免疫及自身免疫等方面发挥着重要作用【４。Ｊ。免疫状态研究方面较之传统免疫荧光法或桥联酶标技术具有明显优势，多参数流式细胞术是根据需要，在流式散点图上对选定细胞亚群设门，以进一步分析该细胞亚群及其分型等特点。随着对ＮＫＴ细胞关注，目前缺乏统一标记方法［６—７］，用流式细胞仪采用四色荧光探针多参数方法，观察在超抗原ＳＥＢ诱导下小鼠的ＮＫＴ细胞变化，可得到快速、准确及大量的数据，为研究者提供有力的手段。
１实验部分
１．１仪器与试剂
ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ型流式细胞仪（美国Ｂｅｃｔｏｎ—Ｄｉｃｋ—ｉｎＳｏｎ公司）。Ｃ５７ＢＬ／Ｊ小鼠脾淋巴细胞（解放军总医院免疫室陈钰主任惠赠）；单克隆抗体包括ＣＤ４一ＦＩＴＣ、ＣＤ８一ＰＥ、ＣＤ３一Ｐｅｒｃｐ、ＮＫｌ．１一ＡＰＣ及相应的标记荧光素的同型对照，均购于Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ公司。
收稿日期：２００８—０３—３１
作者简介：王珊，（１９６９一），女，解放军总医院医学实验测试中心主管技师，第三军医大学毕业，从事流式细胞仪方面的研究工作。
９０ＭｏｄｅｍＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ２００８４
ＲＰＭｌｌ６４０液体培养基和胎牛血清，购于Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，二甲基亚枫（ＤＭＳＯ购于北方同正公司）溶液１０恤Ｌ／ｍＬ储备液。
１．２实验方法
１．２．１细胞培养
ｃ５７ＢＬ／Ｊ小鼠脾淋巴细胞培养于含１０％胎牛血清的ＲＰＭＬｌ６４０液中，３７。Ｃ，５％Ｃ０２的孵箱培养，２—３天换液１次。
１．２．２ＳＥＢ诱导的Ｃ５７ＢＩ．／Ｊ小鼠脾淋巴细胞用培养液将细胞稀释为１０６／ｍＬ，按照５０ｎｇ／ｍＬ浓度加入ＳＥＢ，混匀后放入３７。Ｃ，５％ＣＯ：的孵箱继续培养５ｄ，１０ｄ，１５ｄ后，分别检测。以不加ＳＥＢ的培养淋巴细胞作为阴性对照。
１．２．３流式细胞检测
采用ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ型分析流式细胞仪，４８８ｎｍ激发光源，先将对照管上样，通过调整参数ＦＡＳ和ＳＳＣ，在散色光点图（ＦＳＣ／ＳＳＣ）中清楚显示出一个清晰、集中的细胞群体。在获取细胞前，根据ＦＡＳ／ＳＳＣ的特点，设定阈值，阈值上下浮动取决于细胞大小，避免漏检细胞，防止碎片和噪声干扰。确定电压及放大器数值后，再以门中细胞进行设门（ｇａｔｅ），使门中细胞占９５％以上，以门中细胞进行后续荧光信号检测，将对照组细胞的荧光强度设定为非特异性本底荧光，并在此基础上确定阳性荧光表达率。调定
－。．１４。０７％
ｊ乏．！＿流式细胞仪，分别将阴性对照管ＩｇＧ。一ＦＩＴＣ／ＩＧ。一ＰＥ／ＩＧ，一Ｐｅｒｃｐ／ＮＫｌ．１一ＡＰＣ使荧光散点图中细胞集中在左下（ＬＬ）象限，保持ＦＬ，，ＦＬ２，ＦＬ３，ＦＬ。电压不变，上样，调整仪器荧光补偿值，进行校正后，即可分析样本，每个样本均获取１００００个细胞，数据以ＬｉｓｔＭｏｄｅ的形式储存，采用ＣｅｌｌＱｅｓｔ功能软件进行分析。（ＣｅｌｌＱｅｓｔ是流式细胞仪的获取细胞并进行分析的一个基本软件，根据荧光抗体不同可得到多参数分析结果。）
２结果
２．１ＳＥＢ诱导的小鼠淋巴细胞ＮＫＴ细胞多参数细胞分析
ＮＫＴ细胞可分为Ｃ１Ｍ—ＣＤ８一（ＤＮ），ＣＩＭ＋ＣＤ８一和ＣＩＭ—ＣＤ８＋等不同的亚群喁】。图１中，取常规培养的Ｃ５７ＢＬ／Ｊ小鼠淋巴细胞，分别在散点图ＣＩＭＣＤ８和ＣＤ３ＮＫＩ．１中设门（Ｇａｔｅ），获得淋巴细胞亚群的同时可检测到ＮＫＴ细胞变化，可分别得到ＣＤ４＋ＮＫｌ．１＋，ＣＤ８＋ＮＫｌ．１＋，ＣＤ３＋ＮＫｌ．１＋的百分率。在图中与对照组图相比经ＳＥＢ诱导后明显可以看到ＣＤ３＋ＮＫｌ．１＋为１４．０７％，ＣＩＭ＋ＮＫｌ．１达到３９．３４％，ＣＤ８＋ＮＫｌ．１为１１．４６％。结果表明与对照组相比，经ＳＥＢ刺激的细胞组ＮＫＴ细胞比例明显提高。
图ｌ正常对照组与实验组ＮＫＴ细胞亚群的变化
ＣＤ３ＰｅｒＣＰ
结果表明与对照组相比，经ＳＥＢ刺激后的细胞中ＣＩＭ＋ＣＤ３＋ＮＫＴ细胞比例明显较高。
现代科学仪器２００８４９１
２．２不同时间ＳＥＢ诱导的ＮＫＴ细胞变化
图２显示超抗原ＳＥＢ诱导５．１０．１５天ＣＤ３＋ＮＫｌ．Ｉ＋
图２表明，注射过ＳＥＢ的Ｃ５７Ｂ／Ｊ小鼠，其ＣＤ３＋ＮＫｌ．１＋第１０ｄ最高，第１５ｄ时开始下降。经ＳＥＢ诱导的Ｃ５７ＢＬ／Ｊ小鼠１０ｄ时，ＮＫＴ细胞所具有的免疫抑制活性最高，与文献报道一致，随后逐渐减弱。
３结论
随着新的荧光探针的不断发现，荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发等技术的进展，多色荧光标记流式细胞术检测淋巴细胞及其亚群分析，以辅助临床疾病的诊断作为一种快速、高效而准确的方法，被应用于医学各个领域【９Ｊ。最初的单色标记，单参数的抗原描述，逐渐到后来双色、三色、四色的１６参数的多参数分析，可根据细胞表面的不同标记的染色，更细致的分析细胞亚群。进一步研究细胞的性质及亚群之间的作用，得到更为准确、可靠的结果。多参数ＦＣＭ可根据要求自由组合多种免疫荧光染色，不但能得到更多的检测信息，从大量繁杂的免疫系统中鉴定出功能上同源的细胞亚型¨叫利用四色荧光探针标记淋巴细胞的表面表型，通过检测前向散射角（ＦＳＣ）及侧向散射角（ＳＳＣ）确定散点图ＣＤ３＋ＮＫ１．１＋，ＣＤ４一ＣＤ８一，从而可快速、准确地测定ＣＤ３＋ＮＫｌ．１＋，ＣＩＭ＋ＮＫｌ．１＋，ＣＤ８＋ＮＫｌ．１＋ＮＫＴ细胞表达。ＮＫＴ细胞是最近被人们关注的第四类淋巴细胞，是在免疫调节、抗肿瘤免疫以及自身免疫的调节中发挥重要功能的淋巴细胞亚群。当其亚群的数量和功能发生异常时，就能导致机体免疫紊乱。由于ＮＫＴ细胞数量少，我们采用超抗原葡萄球菌肠毒素Ｂ（ＳＥＢ）诱导ＮＫＴ细胞活化，它不仅能引起Ｔ细胞的应答也能引起ＮＫＴ细胞应答¨¨。实验表明，与未加ＳＥＢ对照组相比，ＳＥＢ组的ＮＫＴ细胞有显著增高。
９２应用多参数荧光分析是免疫学重要的分析技术，ＦＣＭ则提供了分析的条件，为进一步分析ＮＫＴ细胞结构与功能打下了基础。多参数流式分析越来越广泛地应用于基础医学、诊断医学、临床医学的各个领域。荧光抗体和流式技术的不断发展，多参数分析将成为医学研究中不可缺少的重要研究手段。
参考文献
［１］ＰｅｌｌｉｃｃｉａｒＣ，ｅｔａ１．，１９９５，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．２１９（４）：３２９—３３７
【２］ＴａｎｉｇｕｃｈｉＭ．Ａｎｏｖｅｌｌｙｒｅｐｈｏｃｙｔｅ－－－ＮＫＴ．ｊｓｉＮｅｗｓｌｅｔｔｅｒ，２０００，８（１）：１５一１６
［３］ＯｈｔｅｋｉＴ。Ｈｏｓ，ＳｕｚｕｋｉＨ，ｅｔａ１．ＲｏｌｅｆｏｒＩＬ一１５／ＩＬ一１５ｒｅｃｅｐｔｏｒｂｅｔａ—Ｃｈｍｎｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｍ１．１ｃｅｌｌｒｅｃｅｐｔｏｒ—ａｌｐｈａｂｅｔａ＋ｃｅｌｌｄｅｖｅｌ?ｏｐｍｅｎｔＪｌｍｍｕｎｏｌ。１９９７。１５９：５９３１—５９３５
［４］ＧｏｄｆｒｅｙＰＩ，ＨａｍｍｏｒｄＫＪ，ＰｏｕｌｔｏｎＬＤ，ｅｔａｌ，ＮＫＴｃｅｌｌ：ｆａｌｌ∞ｉｅｓ．ＩｍｍｕｎｅＴｏｄａｙ，２０００，２１：５７３—５８９
［５］ＬｅｅＰＴ，ＢｅｎｌａｇｈａＫ，ＴｅｙｔｏｎＬ，ｅｔａ１．，Ｄｉｓｔｉｎｃｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｉｎｅａｇｅｓｏｆｈｕ?ｌＩｍＶ（ａｌｐｈａ）２４ｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒ［ｅｄｌｓ．］Ｅｘｐｍｅｄ，２００２，１９５：６３７—６４ｌ
［６］ＬｉｕＣＣ，ＰｅｍｓｓｉａＢ，ＹｏｕｎｇＪＤ．ＴｈｅｅｍｅｒｇｉｎｇｒｏｌｅｏｆＩＬ—１５ｉｎＮＫ—ｃｅＵｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｉｍｉｎｕｎｏｌｔｏｄａｙ。２０００，２１：１１３—１１６
［７］ＬａｕｗｅｒｙｓＢＲ，ＲｅｎａｕｌｄＪｃ，ＨｏｕｓｓｉａｕＦＡ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｎａｔｕｒａｌｋｉｌｌｅｒｂｙｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎａｎｄｉｎｔｅｄｅｕｋｉｎ１８，ｃｙｔｏｋｉｎｅ。
１９９９，ｌｌ，：８２２—８３０
［８］ＢｅｒｚｉｎｓＳＰ，ＳｍｙｔｈＭＪ，ｃｏｄｆ畸ＤＩ．ＷｏｒｋｉｎｇｗｉｔｈＮＫＴｃｅｌｌ—ｐｉｔｆａｌｌｓａｎｄｐｒａｃｔｉｃａｌｉｔｉｅｓ．ＣｕｒｔＯｐｉｎＩｍｍｕｎｏｌ，２００５，１７：４４８—４５４
［９］ＭａｅｃｋｅｒＨＴ，ＭａｉｎｏＶＣ，ＰｉｃｋｅｒＵ．ＩｍｍｕｎｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｒ２ｃｅｌｌｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｈｅａｌｔｈａｎｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＪＣｌｉｎｉｃｌｍｍｕｎｏｌ，２０００，２０（６）：３９１—３９９
［１０］吴一峰，钱凯先．荧光探针在流式细胞术检测肿瘤中的应用［Ｊ］．浙江大学学报：工学版，２００３，３７（５）：６１７—６２２
［１１］ＫａｔｓｕｎｏｒｉＡ，ＨｉｒｍｈｉＤ，ＳｈｕｈｊｉＳ，ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＫＴｃｅｌｌｂｙｂａｃｔｅｒｉａｌｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｍ［Ｊ］．临床免疫，２００２，３７（１）：２６—３３
ＭｏｄｅｍＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ２００８
４
多参数分析超抗原SEB诱导小鼠NKT细胞变化的流式细胞术
作者：王珊， 于力方， 李宁， 廖杰， Wang Shan， Yu Lifang， Li Ning， Liao Jie
作者单位：解放军总医院医学实验测试中心,北京,100853
刊名：
现代科学仪器
英文刊名：MODERN SCIENTIFIC INSTRUMENTS
年，卷(期)：2008(4)
参考文献(11条)
1.Katsunori A;Hiroshi D;Shuhji S Activation of NKT cell by bacterial superantigena 2002(01)
2.Maecker HT;Malno VC;Picker LJ Immune fluorescence Analysis off2cell responsesin heal than disease [外文期刊] 2000(06)
3.Berzins SP;smyth MJ;Godfrey DI Working with NKT cell-pitfalls and practicalities[外文期刊] 2005(4)
https://www.wendangku.net/doc/4811270303.html,uwerys BR;Renauld JC;Houssiau FA Synergistie proliferation and activation of natural killer bY interleukin and intedeukin 18[外文期刊] 1999(11)
5.Liu CC;Pemssia B;Young JD The emerging role of IL-15 in NK-cell development 2000
6.Lee PT;BenlaghaK;TeytonL Distinct functional lineages of humall V(alpha)24 natural killer[cells[外文期刊] 2002(5)
7.Godfrey PI;Hammord KJ;Poulton L D NKT cell:fallacies[外文期刊] 2000(11)
8.Ohteki T;Ho S;Suzuki H Role for IL-15/IL-15 receptor beta-Chain natural killers 1.1 cell receptor-alpha beta+cell development 1997
9.Taniguchi M A novel lymphoeyte-NKT 2000(01)
10.吴一峰;钱凯先荧光探针在流式细胞术检测肿瘤中的应用[期刊论文]-浙江大学学报（工学版） 2003(05)
11.Pellicciar C查看详情[外文期刊] 1995(04)
本文链接：https://www.wendangku.net/doc/4811270303.html,/Periodical_xdkxyq200804025.aspx