双水相

生物制药工艺学实验报告

——摸索双水相萃取酵母蔗糖酶的条件

【实验目的】

了解双水相萃取的原理;掌握蔗糖酶比活力测定的原理和方法。

【实验原理】

一、双水相萃取

1.定义:某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以适当的浓度溶解会形成

互不相溶的两水相系统。

溶液的分相不一定依赖于有机溶剂,在一定条件下,水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物

质从一个水相转移到另一水相中,从而完成分离任务。

在这两相中水分都占很大比例,活性蛋白质或细胞在这种环境中不会失活,但可以不同比例分配于两相,这就克服了溶剂萃取中蛋白质容易失活和强亲水

性蛋白质难溶于有机溶剂的问题。

对聚合物而言,由于相对分子质量较大,分子间作用力也较大;

高聚物与高聚物形成两相是由于高聚物的不相溶性,聚合物分子量越高,相分离所需浓度越低;

高聚物与无机盐溶液也能形成两相是由于盐析作用,盐浓度越高,越易分相。

2.相图:两水相的形成条件和定量关系,常用相图来表示,它是一条双结点线。

双水相

系线的长度是衡量两相间差别的尺度,系线越长两相间的性质差别越大,反之则越小。

系线的长度反映了两相密度的差异,两相密度差随着系线长度的增加而增加,相分离加快,但远离临界点的聚合物浓度高,粘度大,也会导致相分离困

难,所以在中间组成时,分离速度最佳。

3.影响分配系数的主要因素:

聚合物的相对分子质量:在聚合物浓度不变的前提下,当聚合物相对分子质量降低时,其疏水性下降,亲水性蛋白质易分配于富含该聚合物的相

中。

聚合物的浓度:当双水相系统的总浓度增大时,两相性质的差别增大,蛋白质趋向一侧分配。

盐类的影响:盐的浓度影响蛋白质疏水性。

4.双水相萃取的优点:

双水相系统含水量高,聚合物对蛋白质有稳定作用,为生物活性物质提供了温和的分离环境。

双水相系统界面张力低,蛋白质在两相间达到分配平衡时间短,重现性很好,故可直接放大。

二、蔗糖酶活力测定

原理:蔗糖酶可作用于β-1,2糖苷键,将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果

糖。

葡萄糖和果糖具有还原性,在偏碱性条件下,可与3,5-二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质,在一定浓度范围内,还原糖的量和反应液的颜色

强度成正比关系;蔗糖酶的活力通过其水解产生的还原糖量来反映。

【实验步骤】

一、研磨法破碎酵母细胞

称6 g活性干酵母粉于研钵中,用捣杵研磨,破碎酵母细胞(至粉末状),再加入30 mL 0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4),继续研磨(成匀浆状);

吸取3 mL酵母细胞匀浆液分配于2个dorf管中,5000rpm离心20min,留取上清液(标记为“粗酶液”);

将剩余匀浆液平均分为三份,每份约9mL。

二、双水相萃取蔗糖酶(双水相体系重量为40g)

考察硫酸铵浓度对蔗糖酶分配的影响

浓度为18% 硫酸铵浓度分别为:10%,15%,17%。

条件:PEG

1500

先称量干净烧杯的重量,去皮,再将一份酵母细胞匀浆液倒入烧杯中,称量匀浆液的重量;

在烧杯中,再加入相应质量的PEG和硫酸铵,PEG均加入7.2g,10%组加入硫酸铵4g,15%加入硫酸铵6g,17%组加入硫酸铵6.8g,分别补充蒸馏水至40g;

搅拌使PEG和硫酸铵溶解,并在磁力搅拌器上充分搅拌5min,5000rpm离心20min,加速两相分开;

在小离心管上标明“萃取组(上)”和“萃取组(下)”。测量上、下相的体积(注:用移液管小心吸出),暂存于离心管中。

三、蔗糖酶活力测定

1.酶解反应体系:

双水相

2.DNS法测定体系中还原糖的含量:

双水相

四、制作葡萄糖标准曲线

双水相

五、蛋白质含量测定

双水相

【实验结果】

一、计算蔗糖酶的活力

1.以葡萄糖的质量为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制葡萄糖的标准曲线,拟

双水相

拟合方程:X

0.0058

Y0.7007

-

?

=

+

将测定组的吸光值代入以上方程,得到酶解反应体系中还原糖的质量(mg)。

双水相

2.蔗糖酶活力的定义:在一定的实验条件下,在10min内释放1mg还原糖的

量为一个活力单位。

酶活力(U/mL)=还原糖的质量(mg)÷ 0.5(mL)×酶解反应体系的

体积(mL)÷酶液的体积(mL)

双水相

二、计算蛋白质的含量

1. 将粗酶液组、萃取组的吸光值代入实验一所得的标准溶菌酶回归方程中,得

到体系中蛋白质的浓度(mg/mL)。

标准溶菌酶回归方程:Y=0.5871*X+0.0278

双水相

双水相

三、计算比活力(粗酶液、萃取相)

比活力=酶活力(U/mL)÷蛋白质浓度(mg/mL)

双水相

四、计算纯化倍数和回收率

纯化倍数=萃取相的比活力÷粗酶液的比活力

回收率=萃取相的酶含量÷粗酶液的酶含量

酶含量=酶活力(u/mL)×酶液体积(mL)

双水相

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【实验结果分析】

双水相

双水相

双水相

双水相

结论:

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