酵母中RNA的提取与含量测定
酵母中RNA的提取与含量测定
14级拔尖赵子杰 141270054
一．实验目的
1.掌握稀碱法提取酵母RNA的原理和方法。
2.掌握用苔黑酚法测定RNA含量的原理和方法。
二．实验原理
1.RNA的提取
核酸（RNA）都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、碱基和磷酸以等分子比例构成的，故测定组成核苷酸的任意一种组分即可以测定生物体内核酸的含量或者是提取出来的核酸的含量。
提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者是利用碱使细菌细胞壁溶解，是RNA释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。使用浓盐法提取RNA的时候应该注意掌握温度，直接至90~100℃浸提，避免在20~70℃的时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。这两种方法是从废弃的啤酒酵母中提取RNA的一般方法。但是这两种方法各有利弊，如浓盐法提取的RNA纯度高，而稀碱法提取的时间短，提取率高，更利于工业化生产。本实验采取浓盐法。
酵母核酸中RNA的含量较多，DNA则少于2%。RNA可溶于碱性溶液，当碱液被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到粗RNA粗品。
2.RNA的鉴定
目前测定核酸含量的方法主要有以下四种：定磷法（RNA/DNA）、戊糖测定法(RNA)、脱氧戊糖测定法（DNA）和紫外吸收法（DNA/RNA）。定磷比色法是有准确，微量，快速的特点，是测定核酸含量的最好方法，戊糖测定法和脱氧戊糖测定法是通过糖的颜色反应来测定RNA和DNA的，方法简单，快速，
但是当样品中含有粘多糖和蛋白质存在的时候对测定会有干扰。在酸性条件下，RNA分子中的核算基转变为α-呋喃甲醛，后者与苔黑酚（3,5-二羟甲苯）作用生成绿色复合物，可用比色法鉴定。
三．实验器材
RNA的提取： RNA的含量测定：
1.干酵母粉（市售）。 1.试管1.5cmX1.5cm(X7)。
2.PH试纸。 2.吸管5ml。
3.离心机4000r/min。 3.水浴锅。
4.抽滤装置。 4.722型（或720型）分光光度计。
5.电子天平。 5.移液枪。
6.量筒。
7.吸管(5ml)。
四．实验试剂
1.0.2%NaOH溶液。
2.乙酸A.R.。
3.95%乙醇。
4.无水乙醚A.R.。
5.标准RNA溶液：准确称取RNA标准品10mg，用少量蒸馏水溶解，定容至100ml。
6.样品溶液：同样取10mg左右的样品，定容于100ml，摇匀。
7.苔黑酚-三氯化铁试剂。
五．实验步骤
1.RNA的提取
称取8g酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加热30min，经常搅拌。
冷却，加入乙酸数滴，使提取液呈酸性（PH5~6）。离心10min,4000r/min。取上清液，加入两倍体积的95%的乙醇，边加边搅。
加毕，静置，待完全沉淀，过滤。滤渣先用95%的乙醇洗两次，每次约10ml，继而用无水乙醚洗两次，每次10ml。洗涤时可用玻棒小心搅动沉淀。乙醚滤干后，滤渣即为粗RNA，可用作接下来的测定含量用。
2.RNA的含量测定
1）标准曲线的绘制
取干净试管6支，编号。按下表进行操作。
管号
试剂0 1 2 3 4 5 6
RNA标准溶
液/ml 0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 —
样品溶液
（0.5mg/ml)—————— 2.0 蒸馏水 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0.0 0.0 苔黑酚试剂 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
RNA含量
/mg0.0000 0.0412 0.0824 0.1236 0.1648 0.2060
水浴45min
A670nm/A 0.000 0.078 0.183 0.268 0.356 0.456 0.212 2）样液测定
加毕，混匀，加热45min。冷却，测定各管670nm的吸光度，对照标准曲线求得未知RNA的含量。
六．实验现象与结论
1.RNA的提取
实验现象：
①加入NaOH进行搅拌后呈棕黄色粘稠物。
②离心后明显分层，沉淀为棕黄色，上层溶液呈黄色粘稠状，似蛋清。
③向上清液加入乙醇后呈淡黄色浑浊，静置后沉淀为白色，上清液为黄色。
④过滤洗涤后呈白色粉末状沉淀。
称取酵母粉：8.01g
RNA粗品：0.4234g
2.RNA的含量测定
实验现象：加热后从0号至5号溶液由黄色至黄绿色依次加深，6号溶液颜色为淡黄绿色。
称量RNA样品：0.0101g
称量标准RNA：0.0103g
按要求绘制标准曲线如下：
根据标准线线性回归的结果为y=2.2184x-0.005，其中R2=0.9989，接近于1，表明线性回归效果很好。
根据结果测得y=0.212，代入原方程得：x=0.0980mg ，即该试管中RNA 的含量为0.0980mg 。
可知其纯度为： %51.48%1001
.1050
0980.0=??=
ω 七．实验总结
1.过滤时,洗涤不能带水,否则沉淀粘在滤纸上取不下来。
2.有时絮状沉淀出现较慢,可放十多分钟。
3.利用等电点控制RNA 析出时，应严格控pH 。
4.稀碱法提取的RNA 为变性RNA ，可用于RNA 组分鉴定及单核苷酸制备，不能作为RNA 生物活性实验材料。
5.有很多操作细节需要相当严谨的完成，比如水浴时间，离心时间，沉淀取上清液等，只有小心翼翼充分细心的做好这些细节工作，产率会有一定的提高
八．思考题
1.本实验为何选用酵母为生产原料？在分离纯化的实验选材上有哪些主要原
则？
答：因为酵母细胞中核酸的含量非常高，且主要是RNA ，其含量可达2.67%~10.0%。而DNA 的含量较少，在测定RNA 的含量时DNA 对测定的影响非常小，故选取酵母为生产原料。在分离纯化的实验选材上应该注意以下几点：待分离物质再材料中的含量要高；提取方法要简便；杂质要少，保证提取后提取物的纯度。如果是用于规模化生产的话，必不可少的一个就是要考虑材料的价格。 2.大量的乙醇洗涤在工业生产上有否危险隐患？厂家是如何考虑的。
答：废旧的乙醇可以净化以后回收再利用。乙醇是易挥发物质和燃品，有很大的安全隐患。乙醇洗涤有很多的好处，可以脱去色素，脂溶性杂质，还可以使RNA 分子脱水，易于烘干。由于RNA 分子在乙醇溶液中水化层被破坏，磷酸基团暴露出来，并与Na 结合，最终使RNA 沉淀，增加产率。因此乙醇洗涤时必须的。
2.RNA 提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？
答：过滤时，洗涤不能带水，否则沉淀粘在滤纸上取不下来；有时絮状沉淀出现较慢，可放十多分钟；利用等电点控制RNA 析出时，应严格控制pH ；稀碱法提取的rna 为变性rna ，可用于单核苷酸制备，不能作为rna 生物活性材料。
参考文献
[1] 廖鲜艳李永仙等，《啤酒酵母胞内RNA 提取的研究》，《酿酒》2002年第29卷第2期
[2] 李志东邱峰张洪林，《影响浓盐法提取啤酒酵母RNA 的工艺参数研究》，《化工技术与开发》2007年第36卷第2期