CRISPR实验流程
CRISPR/Cas9 实验流程
交流企鹅: 2621697472（大家做哪块？）
一、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程
1.1 确定待敲除基因的靶位点
1.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）
1.3 构建表达sgRNA的质粒
1.4 sgRNA活性检测
1.5 利用Cas9质粒建立knock-out细胞系
1.1、确定待敲除基因的靶位点
根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显子或在编码成熟microRNA的外显子的5’和3’侧翼序列。
1.2、设计识别靶位点的一对DNA Oligos
确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显子序列输入到在线免费设计sgRNA的软件Input框中（https://www.wendangku.net/doc/4e16198733.html,/），然后进行设计运算，软件会自动输出sgRNA序列（网站设计一般很慢或数据输出不完整，可使用我的内部软件，2天内输出全部结果，无物种限制）。一般地，
基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列（Protospacer Adjacent Motif）前间区序列邻近基序，这是一种见于crRNA分子的短核苷酸基序，可以被Cas9蛋白特异性识别并切割）的20个nt。而PAM序列的特征为NGG（其中N为任意核苷酸）。因此，sgRNA模板序列选择非常方便，即使没有软件，研究者也可手工进行选择。不过，在线软件可以给出该序列在基因组中存在相似序列的情况，即可能的脱靶位点。因此，利用在线软件可以选择脱靶机会小的序列作为sgRNA模板序列。
根据选择的sgRNA模板序列，合成一对序列互补的DNA Oligos（同时设计检测目的基因的引物一起合成）。
1.3、构建可表达sgRNA的质粒
（Precut SgRNA Cloning kit and pSD-gRNA Plasmid构建试剂盒）
企鹅: 2621697472
将合成的Oligos以逐步降温的方法退火成双链，然后与我们提供的质粒进行连接，连接后转化感受态的大肠杆菌，再进行涂板。
次日在LB琼脂平板上，挑取单克隆6个，溶于20ul LB液中，涡旋后，将部分菌液接种到LB液中，37oC下250 rpm生长，另部分的菌液用作模板进行快速PCR，经电泳确定阳性克隆后，将相对应的细菌送商业公司测序，同时将部分菌液接种到LB液体，37oC下250 rpm培养过夜。
1.4、sgRNA活性检测
1.4.1 sgRNA活性预检测--SSA活性检测
（Precut pSG-target Cloning kit & SSA assay检测试剂盒）
企鹅: 2621697472
? SSA检测：根据客户要求检测sgRNA的活性及敲除效率，客户也可
以选购我公司Precut pSG-target Cloning kit自行构建报告载体用于检测，我公司提供阳性及阴性sgRNA及其SSA report target质粒。
? 检测原理：SSA报告质粒(pSG-target)中luciferase基因被终止密码子提前终止，这种截短的luciferase没有活性。为检测sgRNA的剪切活性，将Cas9/sgRNA的靶点序列插入到终止密码子之后。在Cas9和sgRNA 的作用下，靶点位置的序列被有效剪切形成DSB，细胞通过同源重组重新形成有活性的luciferase（Figure 2），通过检测luciferase的活性升高就可以反应Cas9/sgRNA的剪切活性（Figure 3）。
Figure 2. Restore disrupted luciferase function via sgRNA-mediated homologous recombination
Figure 3.Increased FL/RL ratio in Cas9/sgRNA transfection cells.
1.4.2、CRISPR剪切活性检测--surveyor
CRISPR/Cas9打靶基因后引入的突变的方式与ZFN、TALEN基本一致，都是NHEJ或是HR。因此在CRISPR/Cas9的应用中，活性检测或是突变效率的检测可以参照ZFN和TALEN方法.主要包括有:靶位点直接PCR后TA克隆测序和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法（Surveyor法）。
Surveyor法即错配酶法：靶序列经CAS/sgRNA切割后由于缺乏修复模板，将主要以非同源重组的方式进行修复，或多或少会插入或删除一些碱基。因此将靶序列PCR扩增后经变性、退火，将形成错配。错配酶（主要是CEL1或T7E1酶）将识别错配的杂合双链并剪切。产物跑电泳，比较切割条带与未切割条带的比例，即可反映出Cas/sgRNA 的活性。
1.4、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系
将Cas9质粒转染细胞，如果细胞用脂质体转染困难，可采用电转。通过荧光标记观察转染效率，如果选择了带Neo抗性的质粒，则同时用G418药物筛选。如果有FACS，可直接分选带荧光的细胞。
或者当细胞长满培养皿时，将细胞消化成单细胞，采用有限稀释法，接种96孔板。根据前述突变率决定克隆接种数量，由于Indel突变是随机突变。因此，其中的2/3应该是移码突变。如突变率=30%，则建议接种克隆数为96个，最终约有5个阳性克隆。
在荧光显微镜下观测细胞克隆生长情况，选择带有荧光的克隆，适时
进行胰酶消化后，提取部分细胞的基因组DNA用作PCR模板。然后以前述引物和PCR条件进行PCR扩增。PCR产物先进行2%琼脂糖凝胶电泳，如果出现条带，则将PCR产物直接送测序。测序时，PCR产物无需切胶。待测序结果返回后，人工阅读测序色谱图。可确定基因是否突变以及突变基因的基因型。
将携带有双突变等位基因的阳性克隆扩增，保存，稳转系建立成功。
二、利用Cas9质粒建立可遗传的基因敲除动物品系的详细实验过程：
2.1 确定待敲除基因的靶位点
2.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）
2.3 构建可表达sgRNA的Cas9质粒
2.4 体外转录sgRNA 和Cas9 RNA
2.5 将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性
2.6 将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder 2.7 将Founder自交得到F1
2.8 F1自交得到F2
2.1 确定待敲除基因的靶位点
同前
2.2 设计识别靶位点的识别的一对DNA Oligo（引物）
同前
2.3 构建可表达sgRNA的Cas9质粒
同前，选择带有T7启动子的质粒
2.4 体外转录sgRNA 和Cas9 RNA
使用特定引物，以上述质粒为模板，以高保值酶分别对Cas9和sgRNA 进行PCR扩增，循环数设为30个，20 ul反应体系。然后将产物纯化用作体外转录模板。体外转录时，Cas9 RNA需要戴帽和加尾，而sgRNA 无需戴帽和加尾。
2.5 将sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵检测sgRNA活性
将体外转录的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入斑马鱼受精卵中进行活性检测；对于非斑马鱼基因，将含待敲除靶位点序列的DNA片段进行扩增，然后和上述两种RNA共同注射入斑马鱼受精卵。待斑马鱼胚胎发育至24小时，随机选取5个胚胎，提取基因组DNA，然后以此为模板进行PCR扩增。然后按前面同样的方法进行sgRNA的活性验证。
2.6 将有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder
将体外转录的有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入动物受精卵，获得基因敲除的初建者。待初建者发育至可进行基因型鉴定时（斑马鱼为4个星期），剪取部分尾鳍，提取基因组DNA，作为PCR模板，然后按前面同样的方法进行基因突变鉴定。选取有突变的斑马鱼用作传代实验。
4.7 将Founder自交得到F1
以斑马鱼为例，将阳性Founder自交，得到F1。待F1生长至4星期时，进行剪取部分尾鳍，提取基因组DNA，作为PCR模板，然后按前面同样的方法进行基因突变鉴定。选取有移码突变的斑马鱼用作建系。8）F1自交得到F2
对于特定的基因，建立基因鉴定的酶切或PCR方法，通过将携带相同基因型突变等位基因的F1斑马鱼自交，获得纯合突变体、杂合突变体。如果纯合突变不致死，则可将纯合突变F2传代，从而建立纯合突变体系。如果纯合突变致死，则可将杂合突变F2传代，从而建立杂合突变体系。
动物实验推荐使用体外转录的sgRNA
（sgRNA体外转录试剂盒）
（一步纯化RNA转录试剂盒）
企鹅: 2621697472