姜厚朴水提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究
姜厚朴水提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的
抑菌机理研究
李婷，杨舒然，陈敏，宋丽雅，何聪芬
（北京工商大学,北京市植物资源研究开发重点实验室，中国化妆品协同创新中心，北京 100048） 摘要：为了探讨姜厚朴水提物（GMB）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理，试验对GMB作用下菌体形态结构、膜系统上离子通道的酶活力和能量代谢等方面进行了研究。结果表明，GMB对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为6.25、12.5 mg/mL。大肠杆菌胞外AKP酶和β-半乳糖苷酶吸光度值分别增加1.78和4.24倍，GMB作用4 h后电导率显著上升，膜上Na+K+-A TP酶活性从0.42增加到1.74 mg prot/mL，且为阴性对照的1.7倍；金黄色葡萄球菌体表出现囊泡状、不规则的突起结构，SDH酶活性、总A TP 酶活性和胞内蛋白质含量分别降低40%、23.4%和17.9%，且AKP酶活和电导率均有所增加。由此推测出GMB主要是通过破坏大肠杆菌细胞壁、膜结构，增加其渗透性和通透性，造成胞内物质外流和蛋白质合成量下降等现象，进而抑制菌体生长。而GMB抑制金黄色葡萄球菌的作用机制是增加细胞壁的通透性、降低能量代谢相关酶的活性，干扰其正常的代谢活动。
关键词：姜厚朴；大肠杆菌；金黄色葡萄球菌；抑菌机理
文章篇号：1673-9078(2016)2-84-92 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.2.014 Antibacterial Mechanism of Ginger Mix-fried Magnolia Bark Extract against Escherichia coli and Staphylococcus aureus
LI Ting, Y ANG Shu-ran, CHEN Min, SONG Li-ya, HE Cong-feng
(Science College of Beijing Technology and Business University, Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, Chinese Cosmetics Collaborative Innovation Center, Beijing 100048, China) Abstract: To determine the antibacterial mechanism of ginger mix-fried magnolia bark (GMB) against Escherichia coli and Staphylococcus aureus, the morphological structure of the bacterial cells, enzyme activity in the ion channels of cell membrane, and energy mechanism after treatment with GMB were studied. The results showed that the minimum inhibitory concentrations (MICs) of GMB against E. coli and S. aureus were 6.25 and 12.5 mg/mL, respectively. The absorbance values for extracellular alkaline phosphatase (AKP) and β-galactosidase in E. coli increased 1.78-fold and 4.24-fold, respectively. Four hours after GMB treatment, the conductivity of the culture medium changed significantly, and membrane Na+K+-A TPase activity increased from 0.42 to 1.74 mg prot/mL, which was 1.7 times higher than that of the negative control. There were vesicular or irregular projections on the cell surface of S. aureus, and the sorbitol dehydrogenase (SDH) activity, total adenosine triphosphate (A TP) activity, and soluble protein content decreased by 40%, 23.4%, and 17.9%, respectively, whereas AKP enzymatic activity and conductivity increased. These results suggested that GMB increased E. coli cell permeability by disrupting the cell wall and damaging membrane structure, which resulted in an outflow of intracellular material and a decreased amount of synthesized proteins, thereby inhibiting bacterial growth. GMB appeared to inhibit S. aureus by enhancing the cell wall permeability, reducing the activity of enzymes related to energy metabolism, and interfering with the normal metabolic activities.
Key words: ginger mix-fried magnolia bark; Escherichia coli; Staphylococcus aureus; antibacterial mechanism
当前，细菌污染所引起的食源性疾病是影响人类公共健康和食品安全的最大因素之一，其中引起食源收稿日期：2015-05-11
基金项目：北京市优秀人才培养资助D项目（2012D005003000006）
作者简介：李婷（1991-），女，在读研究生，研究方向为天然植物抑菌剂 通讯作者：宋丽雅（1974-），女，博士，副教授，研究方向为微生物与酶工程 性疾病的主要病原菌有沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌[1]。细菌污染食品后分解食物中的蛋白质、糖、脂肪、维生素等营养物质，从而进行自身繁殖，最终导致食品的营养价值和品质下降，严重时造成食品腐败变质，呈现出一定的令人难以接受的感官性状，如刺激性气味、组织腐烂等。此外，有些细菌污染食品后会产生毒素，如肉毒毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素
84
等，若不慎食用会造成人体中毒。因此，在延长食品保存期、保证食品品质的过程中，食品防腐剂具有非常重要的作用。然而，传统的食品防腐剂主要是化学合成品，由于合成防腐剂可能存在潜在危险，所以在许多国家已被逐渐禁止或限制使用。国际上食品添加剂已形成了无毒、安全、天然的发展趋势。因此，评价和筛选具有抑菌活性的植物抑菌剂已成为食品行业研究的新领域。
中草药中含有许多杀菌成分，而且本身又是很好的抗氧化剂，可防止油脂和食品氧化，起到保鲜作用。中草药作为食品防腐剂，不仅可以避免化学防腐剂的毒性危害，而且还可以赋予食品独特的风味。厚朴始载于《神农本草经》，来源为木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的干皮、根皮或枝皮。有研究报道称其提取物对多种微生物均有较强的抑制效果，药理学研究也证明厚朴具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗过敏等作用。厚朴在临床应用上一般为姜制厚朴（Ginger Magnolia Bark，以下简称GMB），有研究表明姜制厚朴对金黄色葡萄球菌的抑制效果比厚朴生品更明显，且已证明净厚朴和GMB在主成分的含量上确实存在差异，原因可能是由于其主成分含量在炮制前后发生了变化，或是源于辅料生姜的协同作用[2]。但是，目前有关GMB对微生物作用机制的研究鲜有报道。本文选取革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌作为试验对象，研究GMB抑制细菌生长的作用机制，旨在为姜厚朴在食品、药品等领域的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株与中药提取液
大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），以上菌株均由本实验室提供；中药姜厚朴购于北京同仁堂有限责任公司（航天桥店）；净厚朴购于祁瑞中药饮片有限公司。
菌株的活化：菌种经营养肉汤培养基培养过夜，取菌液在营养琼脂平板划线培养24 h，挑取生长状况较好的单菌落进行液体培养基扩增。
GMB：将姜厚朴干燥后粉碎过筛（30目），用去离子水浸泡30 min后沸水浴提取25 min，其中料液比为1:10，然后过滤、浓缩至30%，存放在4 ℃冰箱备用（净厚朴提取液制作方法同姜厚朴）。
1.1.2 主要试剂和仪器
磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、无水乙醇、戊二醛、醋酸异戊酯、邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）等试剂均为分析纯，均购于北京半夏科技发展有限公司。营养肉汤培养基和营养琼脂培养基均购于北京奥博星生物技术有限责任公司。
超声细胞破碎仪（宁波新芝JY92-ⅡN）；扫描电子显微镜（中科院微生物所HITACHI SU8010）；高速冷冻离心机（Sigma）；酶标仪（Thermo Multiskan Go）；电导率仪（雷磁DDS-307a）；摇床震荡培养箱（上海福玛）；-80 ℃冰箱（Thermo）；高压蒸汽灭菌锅（上海博讯实业有限公司）；超净工作台（TELSTAR A V-100）。
1.2 实验方法
1.2.1 最小抑菌浓度（MIC）的测定
液体倍半稀释法[3]：取对数生长期的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌接种到营养肉汤培养基中（菌悬液浓度为1×107 CFU/mL），分别加入等量的不同质量浓度的GMB，使其最终质量浓度分别为50、25、12.5、6.5、3.2、1.6 mg/mL，同时设置无菌水空白对照组，于37 ℃、120 r/min震荡培养24 h后涂布平板，观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长情况，以微生物不生长的最小稀释浓度的GMB质量浓度即为MIC值。
1.2.2 GMB对微生物生长曲线的影响
取活化后的大肠杆菌/金黄色葡萄球菌菌种按2%（V/V）接种量接种于4个100 mL营养肉汤培养基中，分别加入等量的不同质量浓度的GMB并使其最终浓度分别为1/4 MIC、1/2 MIC、3/4 MIC，同时设置无菌水空白对照组，于37 ℃、120 r/min震荡培养，于不同时间取样测定光吸收值，绘制生长曲线。
1.2.3 扫描电镜观察微生物形态结构的变化
将活化培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌加入到2 MIC浓度GMB的肉汤培养基中，于37 ℃、120 r/min摇床中培养，从加药培养开始计时，于6 h分别取1.5 mL（正常未加抑菌剂的菌体作为阴性对照），离心后收集菌体，用戊二醛固定48 h。然后用不同浓度的乙醇进行梯度洗脱脱水（每次15 min），醋酸异戊酯置换，采用临界点干燥，最终将干燥好的样品粘贴在样品台上，喷金。于扫描电镜下观察菌体形态和结构变化。
1.2.4 GMB对细胞壁通透性的影响
将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种到含2 MIC浓度GMB的培养液中（不加抑菌剂培养的细菌作为对照组），摇床培养6 h后收获菌体，用PBS缓冲液（0.1 mol/L、pH=7.4）洗涤3次，再离心；然后用PBS缓冲液（pH=7.4）重悬菌体，并调整成相同的OD420值（OD420=2.5）。然后放在37 ℃水浴锅中温育
85
并在0、1、2、3、4和5 h时取出1 mL菌悬液测定其胞外碱性磷酸酶（AKP）酶的含量。采用AKP酶含量测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）进行检测。
1.2.5 GMB对细胞膜完整性的影响
菌株的前处理同1.2.4，其中以菌悬液和ONPG （30 mmol/L）体积比例为19:1。漩涡混匀30 s后置于37 ℃水浴，在反应不同时间后取出2 mL反应液，离心（12000 r/min，2 min）、取上清液，在416 nm波长下进行读数，测定胞外β-半乳糖苷酶含量。
1.2.6 GMB处理后菌液电导率的变化
将活化培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别接种到肉汤培养基中，菌悬液调整为相同的浓度。然后加入2 MIC值浓度的GMB（设未加抑菌剂的培养液为阴性对照），于37 ℃、120 r/min摇床培养不同时间，并用电导率仪测定培养液中电导率的变化情况。
1.2.7 GMB对膜系统上离子通道酶活性的影响
将活化培养的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌加入到2 MIC浓度GMB的肉汤培养基中，接种量为2%，于37 ℃、120 r/min摇床中培养不同时间，然后离心取沉淀，生理盐水洗涤3次，最终悬浮并调整成相同的浓度（OD420=2.5）。然后用超声细胞破碎仪进行破碎（大肠杆菌超声总时间10 min、间歇2 s、功率为3%、冰水浴，而金黄色葡萄球菌超声功率为4%），制备好的细胞悬液不需要离心，最后按照Na+K+-A TP酶和Ca2+-A TP酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）说明书进行操作。
1.2.8 GMB对微生物菌体能量代谢酶的影响
菌体前处理同1.2.6，制备好的细胞悬液需要离心。然后按照琥珀酸脱氢酶（SDH）、苹果酸脱氢酶（MDH）、总A TP酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）要求进行测定酶活。SDH活力定义为每毫克蛋白每分钟使反应体系的吸光度值降低0.01为1个酶活单位；MDH活力为酶毫克蛋白在反应体系中1分钟内催化1 μmol的底物变成产物定义为1个酶活力单位；
A TP酶活力单位定义为每小时毫克蛋白的组织中A TP 酶分解A TP产生1 μmol无机磷的量为一个A TP酶活力单位。
1.2.9 GMB对微生物胞内总蛋白质合成能力的影响
菌体前处理同1.2.6，制备好的细胞悬液不需要离心，然后采用蛋白质定量分析试剂盒（GenStar）测定微生物胞内蛋白质含量。
1.2.10 数据分析
采用Excel 2007进行数据处理，所有数据重复三次，结果以平均值±标准差表示。用Duncan’s法进行显著性分析，p<0.05即认为存在显著性差异。
2 结果与讨论
2.1 最小抑制浓度（MIC）的测定结果
本研究采用倍半稀释法测定了GMB对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的MIC值。由表1结果可知，GMB 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，当GMB质量浓度为6.25 mg/mL时大肠杆菌不生长，而为3.2 mg/mL时大肠杆菌生长，因此GMB对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为6.25 mg/mL；同理，GMB对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度的判定方法同对大肠杆菌的MIC的确定，MIC值为12.5 mg/mL。GMB对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑制作用优于革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。
表1 GMB对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度 Table 1 MICs of ginger mix-fried magnolia bark extract against Escherichia coli and Staphylococcus aureus GMB质量浓度
/(mg/mL)
对照组50 25 12.5 6.25 3.2 1.6大肠杆菌生长+ - - - - ++
金黄色葡萄球菌+ - - - + ++
注：“+”指有菌生长；“-”指无菌生长。
2.2 GMB对微生物生长曲线的影响
菌液的光密度（OD值）可以用来衡量菌液中细菌数目的多少，因此，OD值的变化间接的反应GMB 对微生物生长的影响情况。GMB对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长曲线的影响见图2。GMB组与对照组相比，菌液的光密度值明显降低，表明GMB对微生物的生长有较好的抑制作用，并且随着GMB浓度的增加，两种微生物的吸光度值均明显下降，说明在一定范围内GMB的抑菌作用随其浓度的增加而增加。由生长曲线的变化可以看出，GMB可以使大肠杆菌与金黄色葡萄球菌停滞期延长，并且在对数生长期对两种细菌的生长均有明显抑制作用。
2.3 GMB对微生物菌体形态的影响
GMB对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体形态的影响如图3、4。扫描电镜观察结果显示，GMB作用后，两种微生物的形态与对照组相比均发生了明显变化。GMB处理前大肠杆菌形态规则完整（图3 a），而经2 MIC浓度GMB处理后的大肠杆菌菌体欠饱满，表面粗糙，出现严重皱缩，尤其是在两端部位（图3 b、
86
c）。正常金黄色葡萄球菌表面光滑、外观饱满、折光性好（图4 a）；而经GMB处理6 h后，大部分菌体表面有明显的凹陷、囊泡状或不规则的突起结构。此外，菌体周围有溶出物，可能是细胞流出的胞内物质（图4 b、c）。
图2 GMB对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长曲线的影响
Fig.2 Effect of GMB on the growth of E. coli and S. aureus 注：a.大肠杆菌；b.金黄色葡萄球菌。
图3 扫描电镜观察大肠杆菌的形态结构
Fig 3 Scanning electron micrographs of (a) untreated and (b, c) GMB-treated (six hours) Escherichia coli
注：未处理（a）；处理6 h（b、c）。
图4 扫描电镜观察金黄色葡萄球菌的形态结构
Fig.4 Scanning electron micrographs of (a) untreated and (b, c) GMB-treated (six hours) Staphylococcus aureus 注：未处理（a）；处理6 h（b、c）。
2.4 GMB对细胞壁通透性的影响
碱性磷酸酶（AKP酶）是存在于细胞壁与细胞膜之间的一种酶，正常情况下在胞外不能检测到AKP 酶。当细胞壁或细胞膜遭到破坏后，细胞透性增大，AKP酶泄露到胞外，通过检测胞外AKP酶含量的变化即可以反映细胞壁的透性变化[4]。经2MIC浓度的GMB作用6 h后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌胞外AKP酶含量如图5所示，在温育的过程中AKP酶的吸光度值不断增加，且显著高于对照组（P<0.05），说明处理组胞内AKP酶不断地流到胞外。其中，大肠杆菌处理组在温育的过程中吸光度值从0.097增加到0.270，金黄色葡萄球菌处理组吸光度值从0.054增加到0.181。
实验结果表明，GMB对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞壁均有较强的破坏作用，破坏了细胞的完整性，使胞外AKP的含量升高。AKP酶在微生物体内有重要的意义，不仅可以直接参与磷酸基团的转移和代谢过程，而且与蛋白质的分泌、DNA、RNA、脂质等代谢有关。此外，有研究报道称胞内AKP酶的含量或活力能调节胞内钙离子的代谢[5]，GMB处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌大量AKP酶泄露，因此推测微生物体内钙离子浓度可能发生改变，进而与钙离子浓度调节相关的离子通道、钙结合蛋白、相关酶活等也出现异常。
87
88
图5 GMB 作用后微生物胞外AKP 酶含量的测定 Fig.5 Effects of GMB on microbial extracellular AKP content
注：a.大肠杆菌，b.金黄色葡萄球菌。
2.5 GMB 对细胞膜完整性的影响
细胞膜是维持细胞完整性及保持正常物质能量代谢的基础。有报道显示，多种植物源防腐剂均可作用于微生物的细胞壁和细胞膜体系，直接而迅速破坏依赖于膜结构完整性的能量代谢和细胞赖以生存的对物质的选择性透性，使微生物生长停滞[6]。β-半乳糖苷酶位于细胞膜以内，正常情况下在胞外检测不到其活性，因此内膜通透性的测定可以通过测定细菌胞内释放的β-半乳糖苷酶的含量来判断。
在细胞膜完整性试验中，通过对细胞膜β-D-半乳糖苷酶释放的检测，比较了培养菌株时加入GMB 和未加入GMB 情况下细胞膜通透性的变化（如图5、6）。和未加入抑菌剂的菌悬液相比，随着时间的增加在培养微生物的过程中加入抑菌剂的菌悬液中有较高浓度的β-半乳糖苷酶，且大肠杆菌较金黄色葡萄球菌变化更明显。其中，大肠杆菌处理组在温育的过程中吸光度值从0.89增加到4.66，即增加了4.24倍，而金黄色葡萄球菌处理组吸光度值从0.198增加到0.645倍；在温育5 h 后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌处理组的吸光度值分别是阴性对照组的23.8和22.5倍，且经Duncan 方差分析，处理组胞外β-半乳糖苷酶含量与对照组差异显著（P<0.05）。实验结果表明GMB 对微生
物细胞膜造成了很大的损伤，尤其是对革兰氏阴性菌大肠杆菌，导致其通透性增大，引起细胞内β-D-半乳糖苷酶泄露。细胞膜完整性被破坏一方面会使细胞内部物质发生泄漏，影响细胞的正常代谢；另一方面使得细胞外的抑菌物质进入细胞内，进一步作用于细胞内的其他成分。
图5 GMB 作用后微生物胞外β-半乳糖苷酶含量的测定 Fig.5 Effects of GMB on microbial extracellular β-galactosidase
content
注：a.大肠杆菌，b.金黄色葡萄球菌。
2.6 GMB 处理后菌液电导率的变化
加入抑菌物质GMB 后培养液中电导率变化如图6所示，GMB 对微生物细胞膜的渗透性影响效果显著，且大肠杆菌较金黄色葡萄球菌更敏感。实验结果显示，2MIC 值浓度GMB 作用于大肠杆菌4 h 后其培养液中电导率出现急剧上升，从11.48 ms/cm 增加到13.61 ms/cm ，处理12 h 后胞外电导率即显著高于对照组（P<0.05）（图6 a ）；而金黄色葡萄球菌处理组的电导率随时间的增加而稳定的增大（图6 b ），这就意味着菌体细胞膜的渗透性相应增加。大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的阴性对照中电导率的增加是由于菌体正常的死亡、裂解所致。因此，推测GMB 可使细胞膜渗透性增加，尤其是对革兰氏阴性菌，引起细胞内成分的泄露，特别是电解质的损伤，包括K +、Ca 2+、Na +等。
89
图6 GMB 作用后培养液中电导率的变化情况
Fig.6 Effects of GMB on the conductivity of culture medium
注：a.大肠杆菌，b.金黄色葡萄球菌。
2.7 GMB 对膜系统上离子通道酶活性的影响
Na +K +-A TP 酶是生物体内广泛存在的一种极为重要的膜酶，其作用在于维持细胞膜的渗透性，维持低钠高钾的细胞内环境，维持细胞的静息电位。2 MIC 值浓度GMB 作用于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌6 h 后对其细胞膜上Na +K +-A TP 酶活性的影响见图6，加入抑菌剂3 h 后大肠杆菌细胞膜上Na +K +-A TP 酶活性明显增加，其活性从0.42增加到1.74 mg prot/mL ，且培养至6 h 时酶活性为阴性对照的1.7倍（图7 a ）；金黄色葡萄球菌的处理组Na +K +-A TP 酶活性也呈稳定增加的趋势（图7 b ），但比较而言GMB 对大肠杆菌细胞膜上的Na +K +-A TP 酶活性影响更显著。推测微生物菌体在外加不利的环境下积极做出反应，通过改变细胞膜内外离子浓度来抵御外界不利环境的影响，进而维持细胞活动。其结果与Wan 等关于杀菌剂没食子酸甲酯作用枯草杆菌时导致细胞膜上Na +K +-A TP 酶活性上升的结论一致[7]。
离子的跨膜转运是细胞信号传递的基础，细胞内各种离子浓度的稳态平衡对细胞活动起着至关重要的作用。细胞内Ca 2+浓度的异常变化都会对正常生命活动产生重要影响，因为细胞的许多重要生理代谢如能量代谢、氧代谢、糖代谢等均与胞内Ca 2+浓度有关。
细胞内较低的钙离子浓度主要靠细胞膜对Ca 2+极低的通透性、钙结合蛋白的缓冲及依赖质膜两侧的钙泵，Na +-Ca 2+交换系统将Ca 2+主动排除，或通过细胞内Ca 2+库摄取于贮存Ca 2+。当细胞内钙离子浓度异常增大时，内质网膜上的Ca 2+-A TP 酶激活并迅速将Ca 2+从细胞内转运贮存到内质网内部，Na +K +-A TP 酶转运系统使Ca 2+从细胞内流出，从而维持细胞内Ca 2+浓度，使之处于较低水平[8]。
图7 GMB 对微生物细胞膜上离子通道中Na +K +
-ATP 酶活性的影响
Fig.7 Effect of GMB on Na +K +-ATPase activity in cell
membrane ion channels
注：a.大肠杆菌，b.金黄色葡萄球菌。
GMB 作用于微生物后对其Ca 2+-A TP 酶活的影响如图8所示，在没有加入抑菌剂的阴性对照中，Ca 2+-A TP 酶活稳定，而加入GMB 后Ca 2+-A TP 酶活性都在持续上升，并没有明显的滞后期。GMB 加入6 h 后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌处理组酶活性分别是对照组的1.2、1.3倍，且经方差分析，存在显著性差异（P<0.05）。实验结果表明，在外加环境的刺激下细胞内Ca 2+浓度增加，导致Ca 2+-A TP 酶激活以维持胞内较低钙离子浓度。有研究报道说明细胞内钙超载，可使自由基产生增多，损害能量系统的结构和功能，导致组织和细胞的损伤[9]。此外，Na +K +-A TP 酶和Ca 2+-A TP 酶的活性依赖于膜流动性并受A TP 水平的影响[10]，所以推测GMB 对微生物细胞膜的结构或功能特性产生了破坏作用。
90
图8 GMB 对微生物细胞膜系统上C a2+
-ATP 酶活性的影响 Fig.8 Effect of GMB on Ca 2+-ATPase activity in microbial cell
membranes
注：a.大肠杆菌，b.金黄色葡萄球菌。
2.8 GMB 对微生物菌体能量代谢酶的影响
SDH 是微生物细胞能量代谢的重要酶，其活性是
细胞能量代谢损伤的敏感标志[11]。MDH 的辅酶为NADP +，NADP +通过接受代谢物脱下的H +可生成还原型NADPH ，参加生物合成。而A TP 酶可将A TP 催化水解为ADP 和PO 43-，同时释放能量，能量可以通过传递而被用于驱动另一个需要能量的化学反应，此过程被所有已知的生命形式广泛利用。可见SDH 、MDH 和A TP 酶是在微生物能量代谢过程中起着关键作用。
表2 GMB 对大肠杆菌在能量代谢中关键酶活性的影响 Table 2 Effect of GMB on the key enzymes involved in the
energy metabolism of E. coli
阴性对照
GMB 处理 3 h
6 h
3 h
6 h
MDH 活性 /(U/mg prot) 2.25±0.13 2.42±0.11 2.16±0.19 2.21±0.09SDH 活性 /(U/mg prot)
9.20±0.30 9.24±0.42
9.03±0.32 8.84±0.12
总ATP 酶活性
/(U/mg prot)
0.50±0.01 1.02±0.11 0.45±0.01 0.98±0.11
由表2可知，2 MIC 浓度GMB 作用大肠杆菌6 h
后其MDH 、SDH 和A TP 酶活性均有一定的下降趋势，与阴性对照相比分别降低了8%、4.3%和4.2%；对于金黄色葡萄球菌而言（表3），GMB 对SDH 酶活力影响较MDH 酶更显著，抑菌剂处理3 h 后SDH 酶活性急剧下降，在培养 6 h 时SDH 酶活为 3.94±0.25 U/mgprot ，与阴性对照相比降低了约40%。此外，A TP 酶活力也有明显下降趋势，培养6 h 对照组和处理组A TP 酶活力分别为0.90±0.15 U/mg prot 和0.69±0.09 U/mg prot ，处理组与阴性对照相比大约降低了23.4%。且在培养的整个过程中处理组酶活均低于同期对照组（P<0.05）。
表3 GMB 作用对金黄色葡萄球菌在能量代谢过程中关键酶活性
的影响
Table3 Effect of GMB on the key enzymes in the energy
metabolism of Staphylococcus aureus
阴性对照 姜厚朴水提物处理 3 h
6 h
3 h
6 h
MDH 活性 /(U/mgprot) 3.02±0.25 3.41±0.28 2.83±0.42 3.30±0.32SDH 活性 /(U/mgprot) 6.10±0.43 6.31±0.57 5.54±0.83 3.94±0.25总ATP 酶活性/(U/mgprot)
0.60±0.140.90±0.15
0.53±0.140.69±0.09
A TP 酶活性的减弱可使细胞内Mg 2+、K +浓度降低，导致细胞内DNA 合成受阻，从而影响细胞的物质交换和呼吸代谢功能。近年来也有研究表明，A TP 产量减少，将出现细胞内外离子分布异常，细胞内钠、钙的堆积[12]（上文以证明胞内钙离子增多，膜系统上Ca 2+-A TP 酶活力增强）。此外，能量代谢障碍，A TP 的消耗将降低氨基磷脂移位酶的作用，即把氨基磷脂主要为磷酯酰丝氨酸从膜外侧转移到膜内侧的能力减少，造成细胞膜流动性发生变化[13]。
2.9 GMB 对微生物胞内总蛋白质合成能力的影响
如图9所示对照组菌体的可溶性蛋白质含量基本稳定且缓慢增加，而经GMB 处理后的大肠杆菌体内可溶性蛋白质含量急剧下降，金黄色葡萄球菌在培养3 h 以后开始有明显下降趋势。在GMB 处理的过程中，大肠杆菌体内可溶性蛋白质含量下降了0.19 mg/ml ，与阴性对照相比降低了14.1%；而金黄色葡萄球菌在GMB 的作用下体内可溶性蛋白质则降低了0.15 mg/mL ，与阴性对照相比降低了17.9%。由此可知，在整个培养过程中处理组菌体内可溶性蛋白质含量明
91
显低于同期对照组（P<0.05），但具体的蛋白质种类需要进一步进行研究。
蛋白质是一切生命的物质基础，可维持体内正常的新陈代谢和各类物质的运输，且在细胞和生物体内各种生物化学反应中起催化作用的酶主要也是蛋白质，因此蛋白质的表达水平可以反应细胞的生命状态。如HHP 作用蜡状芽孢杆菌后其体内参与糖代谢、转运、重折叠、氨基酸生物合成和核苷代谢过程的酶蛋白的表达发生了变化[14]。本实验中经过GMB 处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌体内蛋白质含量均发生了不同程度的下降，据此推测GMB 可能是影响了菌体某些结构或功能蛋白的合成，从而达到了抑制微生物生长的作用。此外，蛋白质的合成需要生命体提供大量的能量，且2.8结果以证明GMB 可以干扰大肠杆菌和金黄色葡萄球菌能量代谢中相关酶的活性，特别是对于金黄色葡萄球菌，造成其胞内蛋白质合成受阻。
图9 GMB 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌胞内蛋白质合成能力的
影响
Fig.9 Effect of GMB on the protein synthesis capacity of
Escherichia coli and Staphylococcus aureus 注：a.大肠杆菌，b.金黄色葡萄球菌。
3 结论
3.1 GMB 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌
质量浓度分别为6.25和12.5 mg/ml ，表明GMB 对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较强的抑制作用，且对革兰氏阴性菌即大肠杆菌的抑制效果更显著。此外，
GMB 可以使大肠杆菌与金黄色葡萄球菌停滞期延长，
抑制其对数生长期。
3.2 本文从细胞壁通透性、细胞膜完整性、膜系统上
离子通道的酶活力和能量代谢等方面研究了GMB 对大肠杆菌的作用机制。试验结果显示，处理组胞外AKP 酶和β-半乳糖苷酶吸光度值分别增加了1.78和4.24倍，培养液电导率在GMB 作用4 h 后显著上升，膜系统上Na +K +-A TP 酶活在培养6 h 时为对照组的1.7倍。因此推测GMB 主要是通过破坏大肠杆菌细胞壁、膜结构，增加其渗透性和通透性，造成胞内物质外流和蛋白质合成量下降等现象，进而抑制菌体生长。
3.3 GMB 对金黄色葡萄球菌的作用机制试验结果显
示：实验组SDH 和A TP 酶活与对照组相比分别降低了40%、23.4%，能量代谢障碍进一步导致蛋白质合成受阻，胞内可溶性蛋白质含量降低了17.9 %。此外，电镜图也显示金黄色葡萄球菌菌体表面结构发生了明显变化，表明GMB 对金黄色葡萄球菌的细胞壁、膜系统产生了一定的作用。因此推测GMB 抑制金黄色葡萄球菌的作用机制是增加细胞壁的通透性、降低能量代谢相关酶的活性，干扰其正常的代谢活动。
参考文献
[1] 徐振波,刘晓晨,李琳,等.金黄色葡萄球菌肠毒素在食源性
微生物中的研究进展[J].现代食品科技,2013,29(9):2317-
2324
XU Zhen-bo, LIU Xiao-chen, LI Ling, et al. Development of Staphylococcus aureus Enterotoxin in Food-borne Bacteria[J]. Modern Food Science and Technology, 2013, 29(9): 2317- 2324
[2] 许腊英,胡静,翁德全,等.净厚朴与姜厚朴水煎液主要药理
学比较[J].中国医院药学杂志,2007,27(11):1503-1505 XU La-ying, HU Jing, WENG De-quan, et al. Comparison between Houpo and Ginger Houpu in main pharmacology[J]. China Journal of Hospital Pharmacy, 2007, 27(11): 1503-1505
[3] Anja K, Sasa P , Barbara J, et al. Evaluation of diffusion and
dilution methods to determine the antibacterial activity of plant extracts [J]. Journal of Microbiological Methods, 2010, 81(2): 121-126
[4] Hara S, Y ama K. A novel type of antibacterial peptide
isolated from the Silkworm, Bombyx Mori [J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(50): 29923-29927
[5] Ivanvski S. Expression of bone matrix protein mRNAs by
primary and cloned cultures of regenerative phenotype of human periodontal fibro blasts [J]. Journal of Dental
Research, 2001, 80: 1665-1671
[6]陈佳佳,廖森泰,刘凡,等.中草药抑菌活性成分研究进展[J].
中草药,2011,34(8):1313-1317
CHEN Jia-jia, LIAO Sen-lin, LIU Fan, et al. Progress of
herbal antibacterial active ingredient [J].Journal of Chinese
Medicinal Materials, 2011,34(8): 1313-1317
[7]Fan W W. Antibacterial mechanisms of methyl gallate against
ralstonia solanacearum [J]. Australasian Plant Pathology, 2013
[8]Endo J, Sano M, Katayama T, et a1. Metabolic remodeling
induced by mitochondrial aldehyde stress stimulates tolerance to oxidative stress in the heart [J]. Circulation
Research, 2009, 105(11): 1118
[9]Gulcan H, Ozturk IC, Arslan S. Alterations in antioxidant
enzyme activities in cerebrospinal fluid related with severity
of hypoxic ischemic encephalopathy in newborns [J].
Biology of the Neonate, 2005, 88(2): 87-91
[10]孙卫,郑学芝,李丽,等.葛根素对糖尿病大鼠胰腺线粒体氧
化应激及A TP酶的影响[J].临床合理用药,201l,4(8c): 13-14
SUN Wei, ZHENG Xue-zhi, LI Li, et al. Effect of puerarin
on pancreatic mitochondria oxidative stress and A TPase in
diabetic rats [J]. Chinese Journal of Clinical Rational Drug
Use, 2011, 4(8c): 13-14
[11]Piasecka M, Wenda R L, Ogofiski T. Computerized analysis
of eytochemical reactions for dehydrogenases and oxygraphie
studies as methods to evaluate the function of the mitochondrial sheath in rat spermatozoa [J]. Andmlogia, 2001, 33(1): 1-12
[12]Gulcan H, Ozturk I C, Arslan S. Alterations in antioxidant
enzyme activities in cerebrospinal fluid related with severity
of hypoxicis chemic encephalopathy in newborns [J].
Biology of the Neonate, 2005, 88(2): 87-91
[13]Suwalsky M, Ungerer B, Quevedo L, et a1. Cu+ ions interact
with cell membrane [J]. Journal of Inorganic Biochemistry,
1998, 70(3): 233
[14]Martinez-Gomariz M, Hernaez M L, Gutierrez D, et al.
Proteomic analysis by two-dimensional differential gel electrophoresis of a high-pressure effect in Bacillus cereus [J].
Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57: 3543-
3549
92
金黄色葡萄球菌检测方法
金黄色葡萄球菌检测方 法 Revised as of 23 November 2020
金黄色葡萄球菌检测方法 1.纸片法 目前广泛应用的一种方法，用纸片、膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过观察微生物在测试片上面的生长、显色来测定食品中微生物。采用快速测试片检测具有显着的优点：可测定少量检品，不需要配制试剂，不需要大量的玻璃器皿，操作简便迅速；易于消毒保存，便于运输携带方便，价格低廉；除纸片外无其他任何废液废物，大大减少了工作量；可以在取样时同时接种，结果更能反映当时样本中真实细菌数，防止延长接种时间时细菌繁殖造成的污染。 技术优点：操作简单使用方便，避免了繁琐的操作。 技术缺点：用时间比较长，无法准确定性及计数。 此方法现在应用于快速检测领域，美国3M公司Petrifilm为载体的测试片应用最为广泛。但其也存在一些问题：Petrifilm测试片上覆盖了一层薄膜，当样品粘液过多时会出现菌落的扩散和融合，影响计数；Petrifilm测试片面积较小，当菌量大于250cfu时，准确计数较困难；待测样品中含有的某些有机物可能使显色减缓。使目视效果下降，导致计数偏低。 2.免疫学方法 各种免疫学方法的基本原理都是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。金黄色葡萄球菌特异的抗原能激发机体产生相应的特异性抗体。在免疫检测中，可利用单克隆抗体检测金黄色葡萄球菌的特异抗原，也可利用金黄色葡萄球菌抗原检测体内产生的特异抗体，两种方法均能判断机体的感染状况。目前对于金黄色葡萄球菌的测定主要进行了肠毒素的测定，方法以酶联免疫吸附实验为主，有胶体金方法，也有用亲和素一生物素乳胶凝集实验和免疫荧光实验，但都有一定的局限性。 免疫学方法包括下面两个部分： （1）抗原抗体技术分析：抗原抗体技术是免疫技术中的核心部分，对于金黄色葡萄球菌检测全菌免疫筛选抗体是很困难的事情，现在目前市场有的大多都是对金黄色葡萄球菌毒素类进行免疫得到的抗体，金黄色葡萄球菌毒素有12种，军事医学科学院生产的金黄色葡萄球菌毒素A、B、C的抗体。毒素抗体优势在于敏感度高，易于检查，缺点毒素种类多，检测其中几种不具有普遍性。毒素分离工艺复杂，要得到纯毒素成本比较高。 （2）免疫学方法技术分析：上述免疫学技术应用最多的是酶联免疫技术和胶体金侧向层析技术。酶联免疫技术广泛应用于实验室检测，由于一次可以检测多个样本，此技术多用于体外诊断，目前也广泛用于食品安全。胶体金技术由于操作简单，检测适度快等优势，在食品安全领域广泛用于现场快速检测。 基于免疫学方法的技术主要分为：酶联免疫技术、胶体金侧向层析技术、免疫荧光技术、免疫沉淀技术、乳胶凝集技术、免疫磁珠技术。 3.分子生物学方法 金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：肠毒素、血浆凝固酶、溶血素、杀白细胞素、表皮溶解毒素、毒性体克综合重量毒素I 等。而这些致病因子基因的鉴定(包括耐药性相关基因、毒素基因、酶基因及多
儿童金黄色葡萄球菌肺炎的临床治疗分析
儿童金黄色葡萄球菌肺炎的临床治疗分析 发表时间：2016-05-12T09:59:07.450Z 来源：《心理医生》2015年17期供稿作者：李世红 [导读] 黑龙江省双鸭山煤炭总医院金黄色葡萄球菌肺炎是金黄色葡萄球菌引起的急性肺部感染，其病情重，病死率高。 李世红 （黑龙江省双鸭山煤炭总医院黑龙江双鸭山 155100） 【摘要】目的：探讨儿童金黄色葡萄球菌肺炎的临床治疗。方法：对20例金黄色葡萄球菌肺炎患儿临床治疗资料进行分析。结果：20例患儿经治疗痊愈19例，自动出院1例。结论：金黄色葡萄球菌肺炎应用敏感抗菌素治疗，本病容易出现并发症，积极治疗并发症。 【关键词】儿童；金黄色葡萄球菌肺炎；抗菌素治疗 【中图分类号】R720.5 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）17-0069-02 金黄色葡萄球菌肺炎是金黄色葡萄球菌引起的急性肺部感染，其病情重，病死率高。多见于婴幼儿及新生儿。占社区获得性肺炎的5%以下；占院内获得性肺炎的10%～30%，仅次于铜绿假单胞菌，特别是在有气管插管和机械通气及近期胸腹部手术的患者。对2012年1月～2015年6月收治的确认断金黄色葡萄球菌肺炎患儿20例临床治疗方法分析如下。 1.资料与方法 1.1 一般资料 本组收治的20例金黄色葡萄球菌肺炎患儿，其中男12例，女8例。年龄最小3个月，最大14岁，平均年龄7岁。临床表现：发热19例，其中高热10例，中度发热9例；寒颤5例，呼吸困难5例，咳嗽20例，胸痛4例，肝肿大4例。周围血白细胞计数明显增高，可达(15～30)×109/L，中性粒细胞增加，白细胞内可见中毒颗粒。白细胞总数减低甚至<1.0×109/L提示预后严重。血沉增快，前降钙素、C反应蛋白增高。合格痰涂片行革兰染色可见大量成堆的革兰阳性球菌和脓细胞。痰、胸腔穿刺液、支气管镜灌洗液培养，或血培养可获金黄色葡萄球菌而确诊。 1.2 方法 约90%的金葡菌株产β-内酰胺酶，对甲氧西林敏感的金葡菌(MSSA)治疗首选耐青霉素酶青霉素如苯唑西林，无并发症者疗程为2～3周，有肺脓肿或脓胸并发症者治疗4～6周，继发心内膜炎者疗程为6周或6周以上。对耐甲氧西林金葡菌(MRSA)肺炎，首选糖肽类抗生素如万古霉素或去甲万古霉素治疗：前者10mg/kg，6小时静滴一次；或20mg/kg，每12小时一次。后者剂量为16～32mg/kg，分2次静滴[1]。糖肽类抗生素存在潜在性耳肾毒性，据文献报道万古霉素引起的肾毒性的发生率在5%～25%，故疗程中应监测血药浓度，定期复查血肌酐、肌酐清除率，并注意平衡功能和听力监测。重症MRSA肺炎合并肾功损害者，应根据肾功能调整糖肽类剂量。 2.结果 20例金黄色葡萄球菌肺炎患儿经治疗痊愈19例，自动出院1例。并发肺脓肿、脓气胸者1例预后较好，经3～6个月可基本治愈。 3.讨论 金黄色葡萄球菌是定植在人皮肤表面的革兰阳性菌，存在于25%～30%健康人群的鼻前庭。作为条件致病菌，金葡菌可以引起广泛的感染，从轻微的皮肤感染到术后伤口感染、严重的肺炎和败血症等。金葡菌含有血浆凝固酶，它是致病性的重要标志。该酶使血浆中纤维蛋白沉积于菌体表面，阻碍机体吞噬细胞的吞噬，即使被吞噬后细菌也不易被杀死，并有利于感染性血栓形成。金葡菌常寄居于正常人的鼻前庭和皮肤等处，在寄居部位营共生生活[2]。经吸入或血行途径分别引起原发性支气管源性金葡肺炎和血源性金葡肺炎。支气管源性金葡肺炎炎症开始于支气管，向下蔓延到毛细支气管周围的腺泡形成按肺段分布的实变，4日左右液化成脓肿，由于细支气管壁破坏引起活瓣作用，可发展而形成肺大疱。胸膜下小囊肿破裂则诱发脓气胸。血源性金葡肺炎经常由静脉系统感染性血栓或三尖瓣感染性心内膜炎赘生物脱落引起肺部感染性栓塞以后形成多发性小脓肿而致。金葡菌致病特点之一是引起化脓，造成组织坏死和脓肿。因此，无论是吸入或血行性金葡肺炎均可并发肺脓肿和脓胸。 社区获得性金葡菌肺炎因感染途径而异，主要为吸入性和血源性。院内获得性金葡菌肺炎与气管插管或呼吸机辅助呼吸相关。多见于婴幼儿及新生儿，在出现上呼吸道感染后1～2日，突然寒战、高热、咳嗽，伴黏稠黄脓痰或脓血痰、呼吸困难、胸痛和发绀等。有时可有猩红热样皮疹及消化道症状及呕吐、腹泻、腹胀等明显感染中毒症状甚至休克[3]。肺部体征出现早，有散在湿性啰音，并发脓胸或脓气胸时，呼吸音减弱或消失。感染性栓子脱落引起肺栓塞可伴胸痛和咯血。由心内膜炎引起者体检可有三尖瓣区收缩期杂音、皮肤淤点、脾大。 本病起病急，病情严重，进展快。一般先有数天的上呼吸道感染症状，然后突起高热，多呈弛张热型，但新生儿和体弱儿可低热或无热。咳嗽，痰呈黏液脓性，不易咳出。呼吸困难，缺氧明显，可见鼻翼扇动，青紫及三凹征。中毒症状显著，患者面色苍白、嗜睡或烦躁不安，重症可出现面色发灰、皮肤发花、肢端冰凉、心音低钝、心率快、血压下降等休克表现。肺部体征出现早，早期即有呼吸音减弱和中细湿啰音。病变进展迅速，极易发展成肺脓肿、脓胸、脓气胸、肺大泡等。皮肤可出现各种类型皮疹如猩红热样或荨麻疹样皮疹等。周围血白细胞总数多明显增高，中性粒细胞增高伴核左移和中毒颗粒。婴幼儿和重症患儿可出现外周血白细胞降低，但中性粒细胞百分比仍较高。X线检查早期可见肺纹理增粗或小片状浸润影，病变发展迅速，甚至数小时内出现脓胸、脓气胸、肺大泡等相应的征象，因此在短期内应重复摄片。 根据临床症状、体征和X线胸片或CT扫描检查可确立肺炎诊断。当肺炎进展迅速，很快出现肺大疱、肺脓肿和脓胸，有助于诊断[4]。积极进行各种途径的病原学检测十分重要。利奈唑胺为恶唑酮类抗革兰阳性球菌的新型合成抗菌药，对耐药球菌包括MRSA在内有良好抗菌活性，CA-MRSA肺炎也可选用利奈唑胺。替考拉宁对多重耐药的革兰阳性球菌具有显著的抗菌活性，严重不良反应罕见。其他治疗根据病情而异，止咳化痰、拍背排痰以保持呼吸道通畅、吸氧和对症支持治疗等。金葡菌肺炎应识别其潜在病因和并发症，积极治疗并发症，有脓胸并发症者应行胸腔穿刺，多数病例需胸腔闭式引流。部分需胸腔镜行胸膜剥脱。 【参考文献】 [1]齐晓红，叶惠芬，张燕青.医院内获得性金黄色葡萄球菌肺炎危险因素病例对照研究[J].中华医院感染学杂志， 2001，11(5).10. [2]邹海瑞，洪旭初.医院内获得性耐甲氧西林黄色葡萄球菌肺炎的诊断与治疗[J].实用诊断与治疗杂志，2004.18（6）：525-527. [3]肖小六.万古霉素联合用药治疗金葡菌肺炎并败血症临床分析[J].中国现代医生，2009.47（4）：100-101.
金黄色葡萄球菌危害评估报告
宁城县中蒙医院 SOP文件金黄色葡萄球菌危害评估报告 一．危害程度分类 金黄色葡萄球菌是最常见的化脓性球菌，因排列的规则形似葡萄状，故称之为金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌为需氧或兼性厌氧，广泛分布于自然界中。如空气，土壤，水以及日用物品，在卫生部公布的《人间传染的病原微生物名录》中将其列为第二类病原微生物，属高致病性病原微生物，引起人和动物的化脓性疾病。 二．背景资料 金黄色葡萄球菌呈球形，直径微米，无鞭毛、无芽孢，革兰氏染色呈阳性，对营养要求不高，在普通培养基上生长良好，最适生长温度37度，PH为，耐盐性强，培养24小时出现，表面光滑、湿润，有光泽，不透明菌落（1-2mm），产不同色素，如金黄、白色、柠檬色，对湿热敏感，在100度煮沸5分钟后杀死，浓汁中，紫外线敏感致病性和感染数量：金黄色葡萄球菌之所以能引起疾病是其产生多种毒素和酶，主要有a溶血毒素b杀白细胞素c肠毒素d剥脱性毒素e凝固酶f其他物质引起的局部的蜂窝组织炎等化脓性感染，还可引起如肺炎，心包炎，骨髓炎，肾盂肾炎等重症者可发展呈脑膜炎，败血症，脓毒血症，目前，耐药性菌株的增多，已成为医院内交叉感染的一个急待解决的问题 金黄色葡萄球菌有多种传播途径，主要为吸入带菌的飞沫及接触
带菌的感染伤口引起肺炎及伤口化脓性感染，传染源为带菌的物品，空气等。传播途径主要为接触。金黄色葡萄球菌对实验室人员以及其他可能暴露在实验室传染性气溶胶中的人员是一种危害，尤其是有伤口暴露在空气中，其传染的实验室人员发病率比其他人群高。三．实验活动及及其危害性与预防措施 四、实验室实验活动危害评估本实验室主要从事金黄色葡萄球菌微生物学的实验内容有： 1、金黄色葡萄球菌的培养与耐药检测，生化分型实验 2、金黄色葡萄球菌的涂片染色 金黄色葡萄球菌培养传代，药物敏感实验，生化分型、涂片、染色等工作中可产生气溶胶，培养物制剂的溅出，泼洒和容器的破碎等也可造成严重污染。 拟采取防护措施： 1在工作台面应当放置一块浸有消毒液的布或吸有消毒液的纸，使用后将其高压灭菌或按感染性废物处理。避免感染性物质的扩散。 2 为了避免转移物质洒落，微生物接种环的直径应为2~3mm并完全封闭，手柄的长度应小于6cm以减小振动，或者采用一次性灭菌棉签。 3 用封闭式微型电加热器消毒接种环能够避免在本生灯的明火上加热所引起的感染性物质爆溅。 4 样品容器应当坚固，正确地用盖子或塞子盖好后应无泄漏。在容器外部不能有残留物。
金黄色葡萄球菌的测定
金黄色葡萄球菌的测定 1 卫生学意义 金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。 2 检验方法 2.1 术语与定义 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。是常见的引起食物中毒的致病菌。常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。 2.2 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： （1）恒温培养箱：36℃±1℃。 （2）冰箱：2℃～5℃。 （3）恒温水浴箱：37℃～65℃。 （4）天平：感量0.1g。 （5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 （6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。 （7）无菌培养皿：直径90mm。 （8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.3 培养基和试剂 （1）7.5%氯化钠肉汤 1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4； 2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。 （2）B－P琼脂平板 1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.2 2）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混合，保存于冰箱内。 3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。分装每
金黄色葡萄球菌肺炎的常识
如对您有帮助，可购买打赏，谢谢金黄色葡萄球菌肺炎的常识 导语：金黄色葡萄球菌肺炎是现在幼儿和体质虚弱的老年人很容易患上的疾病，这种病又叫做金葡肺炎，这是一种比较严重的疾病，通常死亡率是在百分之 金黄色葡萄球菌肺炎是现在幼儿和体质虚弱的老年人很容易患上的疾病，这种病又叫做金葡肺炎，这是一种比较严重的疾病，通常死亡率是在百分之三十到百分之四十，导致死亡的原因多是因为病人同时还有其他的一些合并症，下面让我们详细的了解一下金黄色葡萄球菌肺炎 早期金黄色葡萄球菌肺炎常不易认识。起病急，肺炎症状迅速发展时可考虑本病。如近期有上呼吸道感染、皮肤小疖肿或乳母患乳腺炎的病史，可以协助诊断。 金黄色葡萄球菌肺炎(staph ylococcus aureus pneumonia)是由金黄色葡萄球菌(一般为凝固酶阳性)所致的肺炎。由于滥用抗生素的结果，抗药性金黄色葡萄球菌的菌株明显增加，金黄色葡萄球菌感染也见增多。本病大多并发于葡萄球菌败血症，多见于幼婴及新生儿，年长儿也可发生。以冬、春两季上呼吸道感染发病率较高的季节多见。常在医院内或婴儿室内发生交叉感染引起流行。 葡萄球菌能产生多种毒素和酶，如溶血素、葡萄球菌激酶、凝固酶等。一般认为凝固酶和细菌毒性有一定关系，如为凝固酶阴性(如表皮葡萄球菌)则多为条件致病菌，很少引起严重疾病，但为医院内感染的常见细菌之一。对青霉素g耐药金葡菌已成为全世界难题，80年代国内外报道耐甲氧西林金葡菌(methicillin resistant staphylococcus aureus，mrsa)已成为院内感染的主要病原。 金黄色葡萄球菌所致的原发性支气管肺炎，以广泛的出血性坏死、 预防疾病常识分享，对您有帮助可购买打赏
大肠杆菌病的常用药物
- - . 禽大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌的某些致病性菌株引起的多种疾病总称，包括大肠杆菌性败血症、肠炎、脐带炎、肝周炎、心包炎、腹膜炎、全眼球炎、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、关节炎、肉芽肿等，并能导致胚胎和幼雏死亡。由于大肠杆菌血清型复杂，给免疫防治带来一定的困难，药物防治仍是控制禽大肠杆菌病的主要手段。yz.ag365yz.ag365 本文就防治禽大肠杆菌病的常用药物作一简述。- - 考试资料
- - . yz.ag365yz.ag365 一、β-内酰胺类抗生素yz.ag365yz.ag365 β-内酰胺类抗生素为化学结构中含有β-内酰胺环一类抗生素，主要包括青霉素类、头孢菌素类、β－内酰胺酶抑制剂。抗病作用机理均为抑制细胞壁的合成。yz.ag365yz.ag365 1、青霉素类。防治禽大肠杆菌病的青霉素类抗生素主- - 考试资料
- - . 要为半合成广谱抗生素氨苄西林、阿莫西林。氨苄西林、阿莫西林均耐酸、不耐酶，内服或肌注易吸收。阿莫西林耐酸较氨苄西林强，该药抗菌谱广，杀菌力强，作用迅速，阿莫西林的血清浓度比氨苄西林高1.5-3倍。阿莫西林对大肠杆菌有较强的抗菌作用，其体外抗菌谱等同于氨苄西林，但体内效果则增强2-3倍。yz.ag365yz.ag365 用法与用量：⑴氨苄西林：内服一次量为每千克体重10毫升或肌注为一次量每千克体重10毫升，1日2-3次。- - 考试资 料
- - . ⑵阿莫西林：内服一次量为每千克体重10-15毫升，1日2次。yz.ag365yz.ag365 2、头孢菌素类。为广谱半合成抗生素，具杀菌力强、抗菌谱广、毒性小、对酸和β-内酰胺酶比青霉素类稳定等优点，第三、四代头孢菌素对大肠杆菌具有较强的抗菌作用，因较贵而多用于宠物、种畜禽及贵重动物。临床上应用的有头孢噻呋、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢哌酮、头孢他啶、头孢吡肟。yz.ag365yz.ag365 - - 考试资料
实验七--食品中金黄色葡萄球菌的检验
实验七食品中金黄色葡萄球菌的检验 一、实验目的要求 1、了解食品的质量与金黄色葡萄球菌检验的意义。 2、掌握金黄色葡萄球菌的生物学特性。 3、掌握金黄色葡萄球菌检验的生化试验的操作方法和结果的判断。 4、掌握食品中金黄色葡萄球菌检验的方法和技术。 二、原理 葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。 金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。 三、试剂和仪器 （一）最先准备的器材 规格名称数量用途 1、500ml广口瓶1个稀释样品 2、500ml三角瓶1个制生理盐水 3、250ml三角瓶3个制培养基等 4、10×100mm试管6支血浆凝固酶试验 5、1ml移液管2支 6、10ml移液管 2 支 7、直径为90 mm平皿12套制血平板B-P平板 8、250ml量筒1支 （二）应灭菌的其它器材 剪刀1把不锈钢汤匙1把称量纸适量 （三）应制备的培养基 培养基总量所用容器 1.无菌水50ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用） 2.0.85%生理盐水70ml/瓶1瓶250ml三角瓶（全班共用） 3.0.85%生理盐225ml/瓶1瓶500ml三角瓶 4.7.5%NaCl肉汤50ml/瓶1瓶250ml三角瓶
金黄色葡萄球菌
金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片 金黄色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus Rosenbach) 是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus），有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。而对于金黄色葡萄球菌在速冻食品中的存在量，卫生部于2011年11月24日公布食品安全国家标准《速冻面米制品》，允许金葡菌限量存在。 目录 简介 流行病学 引发病症 球菌检验 球菌控制 感染处理 限量存在 简介 金黄色葡萄球菌细胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。其肽聚糖的网状结构比革兰氏阴性菌致密，染色时结晶紫附着后不被酒精脱色故而呈现紫色，相反，阴性菌没有细胞壁结构，所以紫色被酒精冲掉然后附着了沙黄的红色。金黄色葡萄球菌与青霉素的发现有很大的渊源。当年弗莱明就是在他的金黄色葡萄球菌的培养皿中发现有些球菌被杀死了，于是发现了青霉素。而研究也表明青霉素只对以金黄色葡萄球菌为代表的革兰氏阳性菌作用明显。这也是由肽聚糖层的厚度和结构造成的。新出现的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，被称作超级细菌，几乎能抵抗人类现在所有的药物，但是万古霉素可以对付它。典型的金黄色葡萄球菌为球型，直径0.8μm 左右，显微镜下排列成葡萄串状。
显微图像 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37°C，最适生长pH7.4,干燥环境下可存活数周。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1~2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10~15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。对碱性染料敏感，十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长。 流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而，食品受其污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒，占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占到45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。 金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位，常成为污染源。 一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品：食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不密封，运输过程中受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶：
乳酸菌抗菌机理
乳酸菌抗菌机理 乳酸菌的抗菌机理涉及其产生的各种代谢产物，包括酸性物质、乳酸菌素、二氧化碳和过氧化氢等。其中酸性物质可以消耗大量细胞能量并影响细胞膜的稳定性；乳酸菌素可作用于细胞膜，造成膜内物质和能量的泄漏。 乳酸菌是一类可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称，在自然界和食物中广泛存在。乳酸菌是最早被人类用于食品储藏加工的微生物之一，早在公元前6000年，人们就懂得利用乳酸菌发酵食物。他们发现食物经过一定的处理和储存就可改善风味、延长储存期和增加食物的安全性。迄今人们已明确了许多乳酸菌在生产安全优质食品中所起重要作用的生物学机理[1～2]:乳酸菌可以发酵食物中碳水化合物，分泌乳酸菌素，产生有机酸、酒精和二氧化碳等，来抑制一些腐败菌或致病菌的生长及改善食品的品质和风味，同时经过发酵，乳酸菌可以增加食品的可消化性并产生一些维生素、抗氧化剂。近几年，乳酸菌抑制食品中一些腐败菌和致病菌的作用引起人们的极大关注。虽然现代生物技术和安全体系(如HACCP)已被普遍的引入食品加工行业，但食品的安全问题仍然威胁着人类，每年都有许多关于食物中毒和食源性疾病散发或爆发的报道，同时，人们正力图追求不含化学防腐剂及各种添加剂的天然的安全食品。解决这问题需要发展新的食品保鲜技术来控制食品中腐败菌和致病菌的生长。国内外学者对之开展了大量的研究并建立了许多方法，其中最引人注目的就是利用乳酸菌来加强食品安全性和延长储存期。
1乳酸菌产生的酸性物质及其抑菌作用 1.1乳酸菌产生的酸性物质乳酸菌可产生对食品中微生物具有抑制作用的酸性物质，主要是乳酸菌的代谢终产物及中间产物，包括乳酸、乙酸、乙醇等。 1.2酸性物质对食品微生物的抑制作用一般细菌生长的最适pH 值为6～7，若低于该值，细菌的生长速率将大大降低或不生长甚至死亡，这在腐败性微生物上尤为可见。乳酸菌产生的酸性物质对食品中微生物的抑制作用已在许多实验中得到证实，这种抑菌作用取决于3个相互影响的因素:1.介质的pH值； 2.酸的离解程度； 3.酸的种类。 从20世纪70～80年代，国内外学者就开始建立pH值对食品中各种腐败菌和致病菌抑制作用的预测模型。但在这些模型中都是用无机酸如盐酸、磷酸来降低pH值，而乳酸菌产生的多是一些含羧基的弱有机酸。只有未离解的弱有机酸进入细菌细胞才能有效的发挥抑菌作用。这些有机酸的离解度取决于其pKa和pH值，可以用Henderson-Hasselbach公式计算:pH=pKa+log([A-] / [HA])。从中不难看出介质的pH值影响酸的离解，若在pH值固定条件下酸的pKa决定了其离解度。因此乳酸菌产生的弱酸的抗菌能力取决于介质的pH值及酸的种类(pKa)。由于胞质的pH值相对较高，当非离解的酸通过细胞膜进入胞质，就发生离解使细胞质酸化并释放酸性阴离子。这就给微生物带来两种后果:首先，若微生物要维持其胞内的pH值，就得动用ATP酶来清除质子，这将消耗大量细胞能量，加重细胞的代谢负担；其次，细胞内阴性酸离子的积聚可影响细胞膜的稳定性并抑制其传递
金黄色葡萄球菌及其检验
我们以SN标准中的最近似值(MPN)测定法来进行讲解： 这种方法适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少量金黄色葡萄球菌。 1、样品制备： 固体或半固体食品: 以无菌操作称取25g样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均质杯内,于8000r/min均质1～2min,制成1:10样品匀液。 液体食品: 用灭菌吸管吸取25mL样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠),经充分振摇制成1:10样品匀液。 供计数检验时,可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。 2、选三个连续稀释度，从每个稀释度分别取1 mL稀释样品液，接种3管含10％氯化钠why?还记得么？金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。因此，这事实上是一种选择性的增菌。胰蛋白胨大豆肉汤。样品的最高稀释度必须达到能获得阴性终点,置36±1℃培养48 h。 3、用3 mm接种环,从有细菌生长的各管中移取1 环,划线接种于表面干燥的Baird- Parker琼脂平板,置36±1℃培养45～48h。 4、从有细菌生长的每一平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落,移种到肉汤培养基中,置36±1℃培养20～24 h。 5、取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于8mm×100mm试管内充分混合,置36±1℃培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做巳知阳性和阴性对照。对可疑结果,应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验{如耐热核酸酶试验等} 加以证实。 6、报告结果：根据凝固酶试验结果查最近似值(MPN)表,报告金黄色葡萄球菌的MPN/g (mL)。 附：怎样在平板上进行细菌的划线分离。 1.斜线法 2.曲线法 3.方格法 4.放射法 5.四格法
精油抑菌机理综述
·茶树油在果蔬保鲜中的应用及其对采后病原真菌的抑菌机理 （宁波大学海洋学院，宁波315211） 摘要：茶树油具有广谱的抑菌性能，在果蔬采后病原真菌控制上起到了重要的作用。关于茶树油在果蔬保鲜上的应用研究至今较为缺乏，令其在商业上的应用前景受到限制。同时，本文综述了茶树油的抗真菌机理，目前的研究主要集中在细胞膜和呼吸代谢方面。认为仍需进一步结合茶树油的组分之间的相互作用及其在亚细胞水平上的抑菌作用机理进行系统性的研究，为茶树油开发成果蔬保鲜剂提供基础。 关键词：茶树油；果蔬；真菌；机理 Research on Tea tree oil in Fruits and V egetables Preservation and Its Antifungal Mechanism on Postharvest pathogenic fungi Abstract: Tea Tree Oil (TTO), the volatile essential oil derived mainly from the Australian native plant Melaleuca alternifolia. Employed largely for its antimicrobial properties, TTO plays an important role in controlling postharvest pathogenic fungi .Few applied research on tea tree oil in fresh fruits and vegetables has been reported, making it limited in commercial application. Meanwhile, the antifungal mechanism of TTO was reviewed, the current research focused on cell membrane and respiratory metabolism. The interaction between the components of TTO and its effect on subcellular level need to be studied systematically, providing a basis to develop it into fruit and vegetable preservative. Keywords: Tea Tree Oil; fruits and vegetables; fungi; Mechanism 1茶树油概述 植物精油，属于植物体内的次生代谢物质，是一类可随水蒸气蒸馏，具有一定芳香气味且能在常温下挥发的油状物质的总称。植物学上称为精油(essential oil)，商业上称芳香油(aromatic oil)，化学和医药学上称挥发油(volatile oil)[1]。植物精油按化学成分和含量多少可将植物精油分为四大类，即萜烯类衍生物，芳香族化合物，脂肪族化合物，含氮、含硫类化合物。许多研究表明植物精油具有抑制细菌、抑制真菌、抗病毒、杀寄生虫、杀虫的作用而引起了人们极大的兴趣[2]。最早植物精油是在日化产品中使用，近年来由于其较强的抑菌活性和低毒、环境友好等特点，也开始被应用到农产品特别是果蔬病虫害防治和保鲜防腐上[3]，可作为天然防腐剂的重要来源之一，在食品保鲜中具较好的应用前景。 茶树油为桃金娘科（Myrtaceae）白千层属（Melaleuc）植物互叶白千层（Melaleuca alternifolia）的叶和枝条末梢经水蒸气蒸馏而得的无色至淡黄色精油[7]。它是迄今为止发现的活性最强的天然抗菌剂, 也是极具应用价值和发展潜力的纯天然植物精油之一。目前，全世界茶树油每年产量500多吨，因其能高效、无毒、无刺激地杀死真菌和细菌而被广泛应用于医疗、化工等领域[6]。气相色谱-质谱联用仪( GC/MS) 对茶树油的成分进行分析发现，茶树油是由百种以上的物质所组成，其主要成分有萜品烯-4-醇( 1-terpined-4-ol)、γ-萜品烯( gamma-terpinence)、α-松油烯(alpha-terinence)、1，8-桉叶素( 1, 8-cineole)等，其主要抑菌活性成分是萜品烯-4-醇[8]。其中，萜品烯-4-醇和γ-萜品烯占整个茶树油比例的50 % 以上。为提高茶树油质量和防止掺假，ISO/ TC54制订了茶树油的国际标准(ISO4730- 1996)，该标准规定了茶树油的两种特征性成分含量的上下限。其中，1，8-桉叶素(-，15%)，萜品烯-4-醇(30%，-)。
实验5 金黄色葡萄球菌的检验
实验5 金黄色葡萄球菌的检验 1 目的和要求 （1）掌握金黄色葡萄球菌的检验方法 （2）了解金黄色葡萄球菌各检验步骤的依据及原理 2 基本原理 金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA酶。 3 实验材料 3.1 检样乳与乳制品（如奶粉、消毒乳）、肉制品、饮料 3.2 菌种金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌斜面培养物。 3.3 培养基7.5%氯化钠肉汤、肉浸液肉汤、血琼脂平板、Baird-Parker氏培养基 3.4 试剂与染色剂无菌生理盐水、兔血浆、革兰氏染色液等。 3.5 仪器与其他用具无菌吸管（1mL、5、10）、无菌试管、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、均质器、恒温箱等。 4 检样程序 5 操作步骤 5.1 5.1.1样品的处理
称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。若样品为液态，吸取25 mL 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤或10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预臵适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。 5.1.2 增菌和分离培养 5.1.2.1 将上述样品匀液于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 5.1.2.2 将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker 平板和血平板，血平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。Baird-Parker 平板36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h 或45 h～48 h。 5.1.2.3 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 5.1.3 鉴定 5.1.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为0.5 μm～1 μm。 5.1.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 ℃±1℃培养18 h～24 h。 取新鲜配臵兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，臵36℃±1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒臵时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 ℃±1℃培养18 h～48 h，重复试验。 病原性葡萄球菌多数产生血浆凝固酶，非病原性的一般不产生。因此，该法是判定葡萄球菌有无致病性的重要指标。 5.2 金黄色葡萄球菌Baird-Parker平板计数 5.2.1 样品的稀释 5.2.1.1固体和半固体样品：称取25 g样品臵盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或臵盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2 min，制成1:10的样品匀液。 5.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品臵盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预臵适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 5.2.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 5.2.1.4 按5.2.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。 5.2.2 样品的接种
金黄色葡萄球菌的检查
金黄色葡萄球菌的检查 同学们，这一节我们一起来学习一下第四章微生物限度检查法中的金黄色葡萄球菌的检查。 金黄色葡萄球菌为葡萄球菌属中的一种。本菌在自然界分布甚广，空气、土壤、水和日常用具，人的皮肤。看，这就是金黄色葡萄球菌，它是一种革兰氏阳性球菌，呈葡萄状排列，无芽胞，无荚膜，能分解甘露醇，血浆凝固酶阳性。 该菌是葡萄球菌中致病力最强的一种，可经皮肤、粘膜侵入人体引起化脓性病变等局部及全身化脓性炎症，严重时可导致败血症。 所以，国家规定外用药品和一般滴眼剂、眼膏剂、软膏剂等规定不得检出金黄色葡萄球菌，检验金黄色葡萄球菌有重要意义。 金黄色葡萄球菌的操作流程如图所示，与之前讲述过的其他控制菌的检查一样： 在完成培养基的配制和供试品的处理后，用营养肉汤于30～35℃增菌培养18～24小时，必要时可延至48小时。增菌培养的目的使被检药物中的被检菌增殖，避免出现漏检。 接着，进行分离纯化，其目的是使被检菌从混合菌中分离出来。以接种环沾取以接种环沾取1～2环培养液，划
线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上，置30～35℃培养24～72小时。 当阳性对照平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落生长但不同于表中所列特征，可判为未检出金黄色葡萄球菌。 若供试品分离平板生长的菌落与表中所列特征相似疑似时，应选取2～3个以上菌落，分别接种于营养琼脂斜面上，于30～35℃培养18～24小时，取其培养物做以下检查。 1. 革兰染色镜检 革兰染色镜检观察显微镜下的细菌结构是否符合金黄色葡萄球菌的形态特征：金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌，无芽孢，无荚膜。排列呈不规则的葡萄状，亦可呈单个、成双或短链状排列，菌体较小。 2. 血浆凝固酶试验 金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶，能将血浆里的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，使血浆凝固。
金黄色葡萄球菌肺炎CT征象
金黄色葡萄球菌肺炎CT征象 金黄色葡萄球菌肺炎是金黄色葡萄球菌引起肺部急性炎症。临床病情严重，细菌耐药率高，预后多较风险。 【发病机理和病理】金黄色葡萄球菌肺炎可发生于任何年龄，以5~15岁儿童和50~80岁的老年人多见。常年发病，以冬、春季最多。正常人群体内和体表多处有葡萄球菌存在而不引起疾病。 1、吸入性感染:鼻腔是最上要的带菌部位。当人体的免疫力下降，吸入含有大量的定植于鼻咽部或气道的葡萄球菌，使细菌在肺部繁殖，产生化脓性病变。吸入性葡萄球肺炎常呈大叶性分布或广泛的、融合性的细支气管肺炎。张力性肺气囊肿，尤多见儿童、青少年。位于表浅的肺气囊肿若张力过高，可破入胸膜腔形成气胸、脓气胸。成人患者有20%~30%呈单发或多发性脓肿，内含大量的葡萄球菌、红细胞、白细胞及坏死组织。 2、血源性感染：血源性葡萄球菌肺炎继发于葡萄球菌菌血症或败血症由细菌栓子经血循环至肺而引起。原发感染常为皮肤疖痈、毛囊炎、骨髓炎、蜂窝炎、伤口等。病变以多发性、周围性肺浸润为特征。菌拴引起多发性肺小动脉栓，导致双肺多发性化脓性炎症，进而组织坏死形成多发性肺脓肿，并可累及胸膜产生脓胸或脓气胸。少数病例则由血行播散直接引起脓胸。 【临床表现】起病急骤，病情的发展迅速。寒战、高热，体温高达39℃~40℃，呈稽留热型。大汗淋漓，并可现胸痛、呼吸困难和发绀。有显著的毒血症状，全身肌肉、关节酸痛，体质衰弱，精神萎靡，甚至神志模糊，呼吸脉搏增快。常并发循环衰竭。咳嗽于初期时多较轻微，以后咳黄色粘稠痰，随即转为脓性痰或脓血性痰。 老年病人及患慢性疾病的患者及某些不典型病例。呈亚急性经过，起病较缓慢，症状较轻，低热、咳少量脓性痰。有时甚至无临床症状。 早期可无特殊体征，常与严重的中毒症状和呼吸道症状不平行，其后可出现双肺散在湿啰音。病变融合则呈肺实变体征:叩诊浊音，呼吸音减弱或消失。脓胸时可出现胸腔积液的体征。 【影像表现】疾病早期CT改变不明显。仅有小片状肺部浸润。病变发展极快。出现大叶性炎症改变或肺段性浸润，常以双下肺野多见。随后病灶内或其周围出现空腔或蜂窝状透亮区，并可发展为肺脓肿。 肺浸润、肺脓肿、肺气囊肿和脓胸或脓气胸为金黄色葡萄球菌肺炎的四大影像征象，在不同类型后不同病期以不同的组合表现（图3-135）。多发性小脓肿、肺气囊肿和脓胸或脓气胸为婴幼儿金黄色葡萄球菌肺炎的特征。且早期临床表现与胸部CT表现不一致，即临床症状已很严重，而肺部CT表现不明显（图3-136）（图3-137）。但病变发展极快，可于数小时发展为多发性肺脓肿、肺气囊肿、脓胸，并可产生张力性气胸、纵隔气肿。金黄色葡萄球菌肺炎的另一特征呈迁徙性，当临床表现已明显缓解时肺气囊肿仍可存在数月，最后可自然痊愈。（图3-138）（图3-139）（图3-140） 血源性葡萄球菌肺炎早期在双肺的周边部出现大小不一的斑片状或团块状阴影，边缘模糊，直径为1~3cm，有时类似于转移性肺癌，随病变发展，病灶周围出现肺气囊肿，并迅速发展成肺脓肿。 【鉴别诊断】血源性金黄色葡萄球菌性肺炎具有一些临床和影像学特征：1.起病急。临床症状重。2.表现多样，多种影像表现可同时出现，如斑片状影、小点状影、结节影、肺气囊等可在CT片上同时见到；3.病灶比较广泛，多个肺野出现同时受累；4.容易在短期内出现散在的肺气囊或多发的脓肿病灶；5.病灶易变，短期内复查CT可见病灶的形态、部位、大小发生变化。
姜厚朴水提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究
姜厚朴水提物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的 抑菌机理研究 李婷，杨舒然，陈敏，宋丽雅，何聪芬 （北京工商大学,北京市植物资源研究开发重点实验室，中国化妆品协同创新中心，北京 100048） 摘要：为了探讨姜厚朴水提物（GMB）对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理，试验对GMB作用下菌体形态结构、膜系统上离子通道的酶活力和能量代谢等方面进行了研究。结果表明，GMB对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC分别为6.25、12.5 mg/mL。大肠杆菌胞外AKP酶和β-半乳糖苷酶吸光度值分别增加1.78和4.24倍，GMB作用4 h后电导率显著上升，膜上Na+K+-A TP酶活性从0.42增加到1.74 mg prot/mL，且为阴性对照的1.7倍；金黄色葡萄球菌体表出现囊泡状、不规则的突起结构，SDH酶活性、总A TP 酶活性和胞内蛋白质含量分别降低40%、23.4%和17.9%，且AKP酶活和电导率均有所增加。由此推测出GMB主要是通过破坏大肠杆菌细胞壁、膜结构，增加其渗透性和通透性，造成胞内物质外流和蛋白质合成量下降等现象，进而抑制菌体生长。而GMB抑制金黄色葡萄球菌的作用机制是增加细胞壁的通透性、降低能量代谢相关酶的活性，干扰其正常的代谢活动。 关键词：姜厚朴；大肠杆菌；金黄色葡萄球菌；抑菌机理 文章篇号：1673-9078(2016)2-84-92 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2016.2.014 Antibacterial Mechanism of Ginger Mix-fried Magnolia Bark Extract against Escherichia coli and Staphylococcus aureus LI Ting, Y ANG Shu-ran, CHEN Min, SONG Li-ya, HE Cong-feng (Science College of Beijing Technology and Business University, Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, Chinese Cosmetics Collaborative Innovation Center, Beijing 100048, China) Abstract: To determine the antibacterial mechanism of ginger mix-fried magnolia bark (GMB) against Escherichia coli and Staphylococcus aureus, the morphological structure of the bacterial cells, enzyme activity in the ion channels of cell membrane, and energy mechanism after treatment with GMB were studied. The results showed that the minimum inhibitory concentrations (MICs) of GMB against E. coli and S. aureus were 6.25 and 12.5 mg/mL, respectively. The absorbance values for extracellular alkaline phosphatase (AKP) and β-galactosidase in E. coli increased 1.78-fold and 4.24-fold, respectively. Four hours after GMB treatment, the conductivity of the culture medium changed significantly, and membrane Na+K+-A TPase activity increased from 0.42 to 1.74 mg prot/mL, which was 1.7 times higher than that of the negative control. There were vesicular or irregular projections on the cell surface of S. aureus, and the sorbitol dehydrogenase (SDH) activity, total adenosine triphosphate (A TP) activity, and soluble protein content decreased by 40%, 23.4%, and 17.9%, respectively, whereas AKP enzymatic activity and conductivity increased. These results suggested that GMB increased E. coli cell permeability by disrupting the cell wall and damaging membrane structure, which resulted in an outflow of intracellular material and a decreased amount of synthesized proteins, thereby inhibiting bacterial growth. GMB appeared to inhibit S. aureus by enhancing the cell wall permeability, reducing the activity of enzymes related to energy metabolism, and interfering with the normal metabolic activities. Key words: ginger mix-fried magnolia bark; Escherichia coli; Staphylococcus aureus; antibacterial mechanism 当前，细菌污染所引起的食源性疾病是影响人类公共健康和食品安全的最大因素之一，其中引起食源收稿日期：2015-05-11 基金项目：北京市优秀人才培养资助D项目（2012D005003000006） 作者简介：李婷（1991-），女，在读研究生，研究方向为天然植物抑菌剂 通讯作者：宋丽雅（1974-），女，博士，副教授，研究方向为微生物与酶工程 性疾病的主要病原菌有沙门菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌[1]。细菌污染食品后分解食物中的蛋白质、糖、脂肪、维生素等营养物质，从而进行自身繁殖，最终导致食品的营养价值和品质下降，严重时造成食品腐败变质，呈现出一定的令人难以接受的感官性状，如刺激性气味、组织腐烂等。此外，有些细菌污染食品后会产生毒素，如肉毒毒素、金黄色葡萄球菌肠毒素 84