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灵芝多糖含量检测条件及其提取工艺的优化

作者简介王新(1981-),男,安徽滁州人,硕士研究生,研究方向:天然

有效成分的提取与分离。

收稿日期

2007!02!07

灵芝多糖是灵芝的重要化学成分之一,具有抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等作用,还可作为肿瘤化学治疗和放射治疗的有效辅助治疗药物[1-3]。因此,有关灵芝多糖检测与分离提取的研究成为了国内外瞩目的重要课题。

目前测定灵芝多糖含量的方法主要有蒽酮-硫酸法和苯酚-硫酸法。苯酚-硫酸法在试验数据的稳定性方面虽然要优于蒽酮-硫酸法[4],但仍然存在着数据波动较大、重复性差等缺点。如果能对苯酚-硫酸法的测定条件进行详细地研究并找出最佳条件,就可以提高该方法的准确性和重复性。单因素试验和正交试验是优化提取工艺的常用方法,具有方便、快速、准确的特点[5]。笔者优化了苯酚-硫酸法的检测条件,用改进后的方法检测灵芝多糖的含量;并通过单因素和正交试验得到了最佳提取工艺。

1材料与方法1.1材料与试剂

灵芝饮片:产地云南,购于南京正草堂

药业有限公司;葡萄糖、苯酚、浓硫酸、正丁醇、氯仿、无水乙醇:分析纯,购于中国医药(集团)上海化学试剂公司。1.2仪器设备

WFJ7200可见分光光度计

(尤尼柯上海仪器有限公司);ALPHA2!4冷冻干燥机(德国CHRIST公司);HH!6数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司);FC160型锤式粉碎机(上海中药机械厂);LD5!2A离心机

(北京医用离心机厂)。

1.3灵芝多糖的检测

(苯酚-硫酸法)条件的优化1.3.1最大吸收波长的确定。取质量浓度为0.04mg/ml的葡萄糖标准溶液和稀释10倍的灵芝多糖提取液各2.0ml,分别加入浓度5%的标准苯酚溶液1.0ml,混匀,迅速滴加浓硫酸5.0ml,混匀,沸水浴中反应20min,冷却至室温。以蒸馏水代替糖溶液如上法作空白,于400 ̄650nm扫描其吸收曲线。1.3.2显色温度的确定。取质量浓度为0.04mg/ml的葡萄糖标准溶液和稀释10倍的灵芝多糖提取液各2.0ml,分别加入浓度5%的标准苯酚溶液1.0ml,混匀,迅速滴加浓硫酸5.0ml,混匀,分别置于25、50、75、100℃水浴中加热20

min,取出后立即冷却至室温,然后于490nm处测吸光值。

以蒸馏水代替糖溶液如上法作空白。

1.3.3显色时间的确定。取质量浓度为0.04mg/ml的葡萄

糖标准溶液和稀释10倍的灵芝多糖提取液各2.0ml分别加入5%的标准苯酚溶液1.0ml,混匀,迅速滴加浓硫酸5.0

ml,混匀,沸水浴中分别反应10、20、30、40、50min,取出后

立即冷却至室温,然后于490nm处测吸光值。以蒸馏水代替糖溶液如上法作空白。

1.4灵芝多糖的提取方法以及提取工艺优化

1.4.1

提取灵芝多糖的工艺流程:灵芝饮片→预处理→热

水浸提→离心分离→收集上清液(测定上清液的多糖含量,从而确定最佳提取工艺条件)→浓缩→sevage法除蛋白→透析→乙醇沉淀→离心收集沉淀→冷冻干燥→灵芝多糖。

1.4.2灵芝多糖提取率的计算。用优化的方法建立葡萄糖

标准曲线,得出回归方程C=1.5859A+0.0245,由精制灵芝

多糖测得灵芝多糖相对葡萄糖的换算因子[7]f=2.15。

灵芝多糖提取率计算公式为:多糖提取率(%)=C?V?D?f/W×10-3

式中,C为供试液中葡萄糖浓度(mg/100ml),V为多糖提取液的体积(ml),D为多糖提取液的稀释倍数,f为换算因子,W为供试灵芝粉的重量

(g)。1.4.3提取时间对提取率的影响。称取预处理后灵芝粉4

g,放入烧杯中,加入200ml蒸馏水,80℃水浴中分别浸提30、60、90、120、150、180min。测定并计算提取率。1.4.4

提取温度对提取率的影响。称取预处理后的灵芝粉

4g,放入烧杯中,加入200ml预热的蒸馏水,分别在30、40、

50、60、70、80℃的水浴中浸提120min。

测定并计算提取率。1.4.5液料比对提取率的影响。分别称取预处理后的灵芝

粉10.00、6.67、5.00、4.00、3.33、2.86g,放入烧杯中,加入200

ml蒸馏水,80℃水浴中浸提120min。测定并计算提取率。1.4.6正交试验。选取提取温度、提取时间和液料比3个因

素,每个因素设3个水平进行正交试验,试验水平见表1。

2结果与分析

2.1苯酚-硫酸法显色条件的优化

2.1.1

最大吸收波长的确定。图1表明,葡萄糖标准液和灵

灵芝多糖含量检测条件及其提取工艺的优化

王新

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江212013)

摘要优化了苯酚-硫酸法测定灵芝多糖含量的显色条件,并且通过单因素和正交试验确定了灵芝多糖的最佳提取工艺条件。结果表明:苯酚-硫酸法测定灵芝多糖含量的条件为最大吸收波长490nm,显色时间20min,显色温度100℃;灵芝多糖的最佳提取工艺条件为提取温度80℃,提取时间2.5h,液料比50ml/g,在此条件下灵芝多糖的提取率为2.58%。关键词苯酚-硫酸法;灵芝多糖;正交试验中图分类号O629.12文献标识码A文章编号0517-6611(2007)14-04281-02

OptimizationofPolysaccharidesContentDecectionconditionandExtractionProcessofGanodermalucidumWANGXin(SchoolofFoodandBiologicalEngineering,JiangsuUniversity,Zhenjiang,Jiangsu212013)

AbstractThecolorconditionfordetectingpolysaccharidesinGanodermalucidumbyphenol-sulfericacidmethodwasoptimized.Theoptimumextractingconditionwasobtainedthroughsingleeffectfactorandorthogonalexperiments.Theconditionofphenol!sulfericacidmethodwas490nmmaximumabsorptionwavelength,20minreactiontimeand100℃reactiontemperature.Theoptimumextractingconditionwas50minutes,60℃and50ml/gliquid!materialratio.Extractionratioofpolysaccharidesundertheaboveconditionwas2.58%.KeywordsPhenol!sulfericacidmethod;PolysaccharidesinGanodermalucidum;Orthogonalexperiment

安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(14):4281-4282,4285责任编辑王丽莉责任校对王淼

芝多糖提取液均在490nm附近有最大吸收值。

2.1.2显色温度的确定。表2表明,在100℃时,苯酚-硫酸

试剂显色反应最为充分,所以在测定多糖时,显色反应应选择在100℃的水浴中进行。

2.1.3显色时间的确定。表3表明,苯酚-硫酸试剂在沸水

中显色20min就已经反应完全了,从而确定显色时间为

20min。

2.2灵芝多糖提取工艺研究

2.2.1

提取时间对提取率的影响。图2表明,浸提时间越

长,提取效果越好。当浸提时间到2.5h时,提取率基本不再增加,说明此时提取液中的多糖已经达到平衡。因此,浸提

2.5h提取效果最好。

2.2.2提取温度对提取率的影响。高温会对多糖的活性产

生不利的影响,因此该试验将提取温度控制在80℃以下进行研究。图3表明,随着温度的升高,多糖的提取率显著增

高。这是因为温度越高,分子运动的速度越快,多糖越易于在水中溶出。

2.2.3液料比对提取率的影响。图4表明,随着液料比的增

加,多糖的提取率逐渐增高。当液料比大于50ml/g时,提取率不再增加。这是因为液料比达到一定程度时,水溶性多糖已经基本被提取出来了,即使再增大液料比,也不会对多糖提取率有大的影响。

2.2.4正交试验。由表4可知最佳提取条件为:A3B3C3,即提

取温度80℃、提取时间2.5h、液料比50ml/g;提取温度对灵芝多糖的提取率有十分显著的影响,其次为提取时间和液料比。对最优组合进行验证试验,所得提取率为2.58%。

3结论

苯酚-硫酸法测定灵芝多糖的条件为显色温度100℃,

显色时间20min,最大吸收波长490nm;根据单因素和正交

(下转第4285页)

水平

因素A提取温度∥℃

B提取时间∥h

C液料比∥ml/g

401.5302602.040380

2.5

50

表1正交试验水平设计

显色温度∥℃

吸光值

葡萄糖溶液

多糖提取液

25

0.5670.402500.6090.424750.6080.4261000.6120.445

表2

显色温度对吸光度的影响

显色时间∥min

吸光值

葡萄糖溶液

多糖提取液

100.6090.419200.6120.442300.6110.440400.6090.438500.6150.436

表3

显色时间与吸光度的关系

序号

因素

提取率∥%

ABCD111111.37212221.56313331.66421231.74522311.86623121.90731322.21832132.10933212.41

R0.7100.2170.1200.057

A3B3C3

表4L9(34)正交试验直观分析

安徽农业科学2007

4282

(上接第4282页)

试验得出热水浸提灵芝多糖的最佳工艺条件为:提取温度80℃、

提取时间2.5h、液料比50ml/g。在此条件下,灵芝多糖的提取率为2.58%,通过方差分析发现提取温度对灵芝多糖提取率有十分显著的影响。参考文献

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表2苹果汁上部和沉淀物中蛋白质的氨基酸组成

氨基酸

蛋白质中氨基酸占总氨基酸的质量分数∥%

瓶上部果汁瓶底沉淀物

天冬氨酸(Asp)10.1

9.6谷氨酸(Glu)15.413.8丝氨酸(Ser)5.75.0组氨酸(His)2.92.6甘氨酸(Gly)5.34.7苏氨酸(Thr)5.14.8丙氨酸(Ala)2.92.9精氨酸(Arg)10.310.5酪氨酸(Tyr)3.24.0半胱氨酸(Cys-s)0.50.5缬氨酸(Val)7.87.1蛋氨酸(Met)0.31.4苯丙氨酸(Phe)4.95.2异亮氨酸(Ile)4.45.3亮氨酸(Leu)7.79.2赖氨酸(Lys)6.97.8脯氨酸(Pro)

6.65.6

表3沉淀物中中性糖类组成

保留时间∥min样品峰面积糖质量∥mg

百分含量∥%

阿拉伯糖14.38107100.2030.92甘露糖20.2935970.0680.31葡萄糖21.562479374.70021.36半乳糖

21.98186130.3531.60

51015202530354045500

51015202530

101520253035404550图3

标准中性糖的气相色谱图保留时间∥min2.3沉淀物中中性糖组成由图3可得6种标准单糖的

保留时间分别为:鼠李糖13.27min;阿拉伯糖14.65min;木糖15.71min;甘露糖20.94min;葡萄糖21.87min;半乳糖22.81min;内标

(磷酸肌醇)25.63min。将沉淀物中中性糖的保留时间与标准单糖的保留时间对照,发现沉淀物中中性糖种类有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖(图4)。由表3可知,果汁沉淀物中检测出4种单糖,其中葡萄糖含量最高。葡萄糖可能广泛存在于淀粉、果胶、纤维素、半纤维素等之中,所以其含量最高。半乳糖含量仅次于葡萄糖。沉淀物中性糖中未发现木糖,说明沉淀物中不含有半纤维素,或者含有的半纤维素中没有木聚糖、木葡聚糖。

综上可知,沉淀物中性糖中葡萄糖含量占绝对优势,半乳糖含量次之,表明沉淀物中的主要多糖为淀粉、纤维素,果胶半纤维素含量较少,不含木聚糖、木葡聚糖等。

3结论

研究结果表明:苹果浑汁贮藏期间沉淀物成分以蛋白

质为主,还含有碳水化合物、酚类(花色苷,表儿茶素、绿原酸、单宁等)、5!羟甲基糠醛(HMP)等Vc降解产物,成分很复杂。沉淀物中的主要多糖为淀粉、纤维素。沉淀物主要是由果汁中原有的颗粒聚集度大下沉产生;酚类物质氧化聚合后与蛋白质、氨基酸等物质结合产生的新的小颗粒以及类似苹果清汁中的后混浊因素也存在,但不是主要因素。参考文献

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梁茂雨等

苹果浑汁贮藏期间沉淀物的研究

35卷14

4285

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