Medip-seq甲基化测序分析流程
#流程大放送#MeDIP-seq测序
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介绍
MeDIP-Seq 全称Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing，即甲基化DNA免疫共沉淀测序。该种测序方法通过使用5'-甲基胞嘧啶抗体特异性抓去样本中甲基化程度高的DNA片段，并对富集的DNA片段进行高通量测序。相对于BS-seq和RRBS-seq技术而言，MeDIP-seq技术以较小的数据量和较高的性价比，帮助科研人员检测基因组上的甲基化区域。
需要注意的是，MeDIP-seq生成DNA甲基化图谱最小分辨率在50-100bp左右，无法达到BS-seq和RRBS-seq的单碱基分辨率。
该项技术可用于以下研究
1、处于特定时期或特定处理条件下的样本中，研究样本中染色体DNA甲基化模式；
2、比较不同细胞、组织、样本间的DNA甲基化修饰模式的差异。
3、疾病样本中，与疾病发生发展相关的DNA甲基化表观
数据处理和分析流程图
示例图片展示
示例图2 DNA甲基化信号在不同类型染色体区域的分布
示例图2 特定基因区域内甲基化信号展示[1]
示例图3 基因TSS位点周围甲基化信号分布特征分类[1]
图片来源文献
[1]. Kim, J.H., et al., Deep sequencing reveals distinct patterns of DNA methylation in prostate cancer. Genome Res, 2011. 21(7): p. 1028-41.
DNA甲基化测序服务DNA甲基化是表观遗传学(Epigen
DNA甲基化测序服务 DNA甲基化是表观遗传学（Epigenetics）的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要的作用，是目前新的研究热点之一。在哺乳动物中，甲基化一般发生在CpG的胞嘧啶5位碳原子上，通过使用5’-甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的DNA片段，并结合Illumina高通量测序平台，对所有富集的DNA片段进行高通量测序，研究人员能够获得全基因组范围内高精度的甲基化状态，为深入的表观遗传调控分析提供了更有利的切入点。 DNA甲基化测序技术优势 ?灵活度高：能够直接对任意物种的高甲基化片段进行测序，无需已知的基因组序列信息。 ?检测范围广：覆盖整个基因组范围的甲基化区域。 ?精确度高：能够在实际结合位点50个碱基范围内精确定位。 ?数字化信号：直接对甲基化片段进行测序和定量，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。 图1 MeDIP-Seq测序技术能够覆盖整个基因组区域包括启动子区、内含子、外显子、基因间，甚至是一些重复序列，并能分析这些区域各自的甲基化程度，右上角的不同颜色就代表了不同的甲基化程度（摘自Down TA., et al, 2008, Nature Biotechnology）。
康成生物提供的DNA甲基化测序服务流程： 1. 甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP） 2. 测序文库构建 ?双链DNA末端修复及3’末端加’A’ ?使用特定的测序接头连接DNA片段两端 ?高保真聚合酶扩增构建的测序文库 3. DNA成簇（Cluster）扩增 4. 高通量测序（Illumina Genome Analyzer IIx） 5. 数据分析 ?原始数据读取 ?与数据库比对并进行注释 ?确定甲基化位点 ?深层次数据分析 6. 提供实验报告 ?原始数据报告（Fasta-Q格式），包含所有 测序序列信息，碱基读取质量评估 ?基本数据分析报告（Excel表格），包含有 效序列的序列信息、与参考基因组比对后的 注释信息等。 ?高级数据分析（应客户要求定制），如甲基化区域（enriched region）鉴定，分析两样本间甲基化水平有差异的区域并注释，结合表达谱分析其对基因的表达调控。
DNA甲基化实验操作原理及方法-Hxg
DNA 甲基化重亚硫酸氢盐修饰法（DNA METHYLATION BISULFITE MODIFICATION） 实验操作原理及方法 一、实验目的： 通过本实验，可以检测特定DNA序列的甲基化状态。 二、实验原理： DNA 甲基化是指由S-腺苷甲硫氨酸（SAM）提供甲基基团，在DNA 甲基转移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）的作用下，将CpG 二核苷酸的胞嘧啶（C）甲基化为5-甲基化胞嘧啶（5-m C）的一种化学反应。DNA 甲基化是调节基因转录表达的一种重要的表观遗传的修饰方式。 DNA 甲基化主要在转录水平抑制基因的表达。DNA 甲基化引起基因转录抑制的机制可能主要有以下3 种：（1）DNA甲基化直接干扰特异性转录因子与各基因启动子中识别位置的结合。（2）序列特异性的甲基化DNA 结合蛋白与启动子区甲基化CpG 岛结合，募集一些蛋白，形成转录抑制复合物，阻止转录因子与启动子区靶序列的结合，从而影响基因的转录。（3）DNA 甲基化通过改变染色质结构，抑制基因表达。 重亚硫酸氢盐修饰法检测DNA甲基化的基本原理是基于DNA变性后用重亚硫酸氢盐处理，可将未甲基化胞嘧啶修饰成尿嘧啶。此反应的步骤是：1、在C-6位点磺化胞嘧啶残基；2、在C-4处水解去氨基来产生尿嘧啶磺酸盐；3、在碱性条件下去硫酸化。在这个过程中，5-甲基胞嘧啶由于甲基化基团干扰了重亚硫酸氢盐进入到C-6位点而保持着未反应的状态。在重亚硫酸氢盐处理后，使用针对每个修饰后DNA链的引物进行PCR反应。在这个PCR产物中，每5-甲基胞嘧啶显示为胞嘧啶，而由未甲基化胞嘧啶转变成的尿嘧啶则在扩增过程中被胸腺嘧啶所取代。 BSP(bisulfate sequencing PCR) ：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，进行PCR扩增。最后，对PCR产物进行测序，并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。
甲基化检测原理及步骤 DNA实验技术方法汇总
DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 （1）3 M NaOH原料（用前现配） 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 （2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配） 配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。 （3）溶解试剂Ⅰ（用前现配） 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 （4）溶解试剂Ⅱ 打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。 第二步：DNA修饰程序 1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。 注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。 2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
高通量测序常用名词汇总
高通量测序常用名词汇总 技术支持 Q20值是指的测序过程碱基识别（Base Calling）过程中,对所识别的碱基给出的错误概率. 如果质量值是Q20,则错误识别的概率是1%,即错误率1%,或者正确率是99%； 如果质量值是Q30,则错误识别的概率是0.1%,即错误率0.1%,或者正确率是99.9%； 如果质量值是Q40,则错误识别的概率是0.01%,即错误率0.01%,或者正确率是99.99%； 你发现规律没有,Q“N”0的质量值,就是正确率有N个9的百分比,这样就非常容易记忆了. 基因高通量测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值，这个质量值是衡量测序准确度的。碱基的质量值13，错误率为5%，20的错误率为1%，30的错误率为0.1%。行业中Q20与Q30则表示质量值≧20或30的碱基所占百分比。例如一共测了1G的数据量，其中有0.9G的碱基质量值大于或等于20，那么Q20则为90%。Q20值是指的测序过程碱基识别（Base Calling）过程中，对所识别的碱基给出的错误概率。质量值是Q20，则错误识别的概率是1%，即错误率1%，或者正确率是99%； 质量值是Q30，则错误识别的概率是0.1%，即错误率0.1%，或者正确率是99.9%； 质量值是Q40，则错误识别的概率是0.01%，即错误率0.01%，或者正确率是99.99%； 一代测序技术：即传统的Sanger测序法，Sanger法是根据核苷酸在待定序列模板上的引物点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，通过检测得到DNA碱基序列。 二代测序技术：next generation sequencing（NGS）又称为高通量测序技术，与传统测序相比，二代测序技术可以一次对几十万到几百万条核酸分子同时进行序列测定，从而使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序（Deep sequencing）。NGS主要的平台有Roche（454 & 454+），Illumina（HiSeq 2000/2500、GA IIx、MiSeq），ABI SOLiD等。 基因：Gene，是遗传的物质基础，是DNA或RNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列。基因通过复制把遗传信息传递给下一代，使后代出现与亲代相似的性状。 DNA：Deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸，一个脱氧核苷酸分子由三部分组成：含氮碱基、脱氧核糖、磷酸。脱氧核糖核酸通过3',5'-磷酸二酯键按一定的顺序彼此相连构成长链，即DNA链，DNA链上特定的核苷酸序列包含有生物的遗传信息，是绝大部分生物遗传信息的载体。
DNA甲基化检测技术全攻略
DNA甲基化检测技术全攻略 近年来涌现出不少DNA甲基化的检测技术，少说也有十几种。大致可以分为两类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析，后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。下面大家介绍一些常用的方法。 特异位点的甲基化检测 甲基化特异性PCR(MS-PCR) 这种方法经济实用，无需特殊仪器，因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后，即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中，通常设计两对引物，一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板，而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段，则说明该检测位点存在甲基化，若第二对引物能扩增出片段，则说明该检测位点不存在甲基化。 这种方法灵敏度高，可用于石蜡包埋样本，且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷，你要预先知道待测片段的DNA序列，并设计出好的引物，这至关重要。另外，若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况，那可能导致假阳性。 亚硫酸氢盐处理+测序 这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下：经过亚硫酸氢盐处理后，用PCR扩增目的片段，并对PCR产物进行测序，将序列与未经处理的序列进行比较，判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠，且精确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。 联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA) DNA样本经亚硫酸氢盐处理后，利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG)，则PCR扩增后保留为CGCG，BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中，C未发生甲基化，则PCR后转变为TGTG，BstUI识别位点丢失，不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。 这种方法相对简单，可快速定量几个已知CpG位点的甲基化，且需要的样本量少。然而，它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。 荧光定量法(Methylight) 此种方法利用TaqMan? 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段，并设计一个能与待测位点互补的探针，随后开展实时定量PCR。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。 Qiagen就提供了多种预制的MethyLight分析。EpiTect MethyLight PCR Kit包括了两条甲基化敏感的TaqMan探针和2条甲基化不敏感的PCR引物。随着目标序列甲基化状态的不同，只有FAM标记的亚硫酸氢盐转化的甲基化DNA特异的TaqMan探针，或只有VIC
中关村华康基因研究院----DNA甲基化测序问题集锦
DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，能在不改变DNA 序列的前提下，改变遗传表观。 DNA甲基化在维持细胞正常功能、传递基因组印记，胚胎发育、肿瘤发生等方面发挥重要作用，目前已经成为表观遗传学和表观基因组学的研究热点。 Roche GS FLX Titanium 、IlluminaSolexa GA IIx和AB SOLID 4均可以进行大规模DNA甲基化测序分析，由于IlluminaSolexa GA IIx测序仪具有数据读取量大、成本低等优势， IlluminaSolexa GA IIx测序仪在DNA甲基化测序方面得到广泛应用。 DNA甲基化测序可在全基因组水平上最大限度的、完整的获取甲基化状态信息和与基因表达调控的多重关系，可高效精确完成全基因组甲基化测序及高分辨DNA 甲基化谱式绘制，并可对发现的靶点区进行甲基化特异性PCR验证。 甲基化测序对样品有什么要求？ 答：（1）请提供浓度≥10 ng/μg、总量≥200 ng、OD260/280为1.8~2.2的DNA样品；若单次富集的DNA量不够，建议将2~3次免疫沉淀的DNA合并在一起。（2）样品请置于1.5 ml管中，管上注明样品名称、浓度以及制备时间，管口使用Parafilm封口。在运输前将所有样品管固定于50 ml带盖离心管中，再将50 ml管放在封口袋中。为了防止低浓度样品黏附在离心管壁上，请使用 non-stick tube运输DNA ；建议使用冰袋运输，并且尽量选用较快的邮递方式，以降低运输过程中样品降解的可能性。 MeDIP富集DNA片段的流程？ 答：甲基化DNA免疫沉淀法（Methylated DNA immunoprecipitation，MeDIP）是一种高效富集甲基化DNA的方法。主要通过与5mC特异性结合的抗体加入到变性的基因组DNA片段中，从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀，形成富集。其流程如下（图1）： （1）将基因组DNA超声打断成400-500bp片段； （2）加热变性，使双链DNA片段解链形成单链DNA样品； （3）向变性后的单链DNA样品中加入5’-甲基胞嘧啶抗体； （4）使用亲和层析分离（3）步样品中的甲基化DNA片段的抗体复合物，样品中其余的非甲基化DNA片段被洗脱。纯化得到甲基化DNA片段（MeDNA）。
甲基化原理及方法
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰测序法） 基本原理在于：样本经亚硫氢酸盐处理后,甲基化的胞嘧啶（C）保持不变,但非甲基化的胞嘧啶被转化成脲嘧啶,因此在利用该处理产物作为模板的PCR产物中,甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶,但非甲基化胞嘧啶变成了脲嘧啶（胸腺嘧啶）,此时检测到的胞嘧啶（C）即是样品中本身的甲基化位点. 第一部分基因组DNA的提取。 DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。 验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。 6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
甲基化检测方法
甲基化检测方法（亚硫酸氢盐修饰后测序法） 第一部分基因组DNA的提取。 这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA 应该是完整的。 此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。 使用两者的细节： 1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml； 2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。验证提取DNA的纯度的方法有二： 1：紫外分光光度计计算OD比值； 2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。 我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 第二部分亚硫酸氢钠修饰基因组DNA 如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。 1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul； 2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； 3：42℃水浴30min； 水浴期间配制： 4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色） 5：3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。 8：50℃避光水浴16h。 一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。 这一步细节： 1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。 2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。 3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
全基因组重亚硫酸盐测序和简化代表性重亚硫酸盐测序分析流程
#流程大放送#WGBS和RRBS测序分析流程 介绍 WGBS全称Whole Genome Bisulfite Seuqneicng，即全基因组重亚硫酸盐测序。该方法通过Bisulfite处理，将原基因组中未发生甲基化的C碱基转换成U的同时，保留所有甲基化C 的碱基不发生转变，从而帮助科研人员识别发生甲基化的CpG位点。该种测序技术适用于绘制单碱基分辨率的全基因组DNA甲基化图谱。 RRBS全称Reduced Representation Bisulfite Sequencing，即简化代表性重亚硫酸盐测序。该方法在Bisulfite处理前，使用MspI（该酶的酶切位点为CCGG）酶切对样本进行处理，去除低CG含量DNA片段，从而使用较小的数据量富集到尽可能多的包含CpG位点的DNA片段。 相比于WGBS技术，RRBS是一种准确、高效且经济的DNA甲基化研究方法，通过酶切，并进行Bisulfite测序，该方法在保证DNA甲基化状态检测的高分辨率的同时提升测序数据的高利用率。 该项技术可用于以下研究 1、处于特定时期或特定处理条件下的样本中，研究样本中染色体高精度DNA甲基化模式； 2、比较不同细胞、组织、样本间的高精度DNA甲基化修饰模式的差异； 3、疾病样本中，与疾病发生发展相关的高精度DNA甲基化表观遗传机理研究和相关高精度DNA甲基化位点分子标志的探索性研究。
数据处理和分析流程图 分析结果示例图片展示 示例图1 样本中各区域DNA甲基化水平信息统计和样本间差异DNA甲基化分析结果展示[1] 示例图2 差异DNA甲基化区域内转录因子基序识别[1]
示例图3 DNA甲基化水平变化与基因表达水平变化的关联性分析[1] 示例图来源文献 [1]. Ng, C.W., et al., Extensive changes in DNA methylation are associated with expression of mutant huntingtin. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(6): p. 2354-9.
人全基因组甲基化测序项目结题报告
人全基因组甲基化测序项目 结题报告 成都生命基线科技有限公司
目录 一、分析方法 (3) 1.1 全基因组甲基化测序 (3) 1.2 生物信息分析概述 (3) 1.3 数据过滤 (3) 1.4 序列比对 (3) 1.5 甲基化水平 (3) 1.6 DMR检测 (4) 1.7 甲基化水平程度差异 (4) 1.8 GO注释 (4) 1.9 KEGG通路富集 (4) 二、项目流程 (5) 2.1 实验流程 (5) 2.2 信息分析流程 (5) 三、项目结果报告 (6) 3.1 数据基本处理与质控 (6) 3.2 全基因组甲基化水平分析 (8) 3.3 甲基化C碱基中CG, CHG 与CHH的分布比例 (9) 3.4 甲基化CG、CHG和CHH的甲基化水平分布 (10) 3.5 甲基化的CG，CHG，CHH附近碱基的序列特征分析 (10) 3.6 染色体水平的甲基化C碱基密度分布 (11) 3.7 基因组的不同区域的甲基化分布特征 (11) 3.8 基因组不同转录元件中的DNA平均甲基化水平 (12) 3.9 DMR的检测 (12) 3.10 DMR相关基因的GO和Pathway分析 (14) 四、参考文献 (15)
一、分析方法 1.1 全基因组甲基化测序 首先采用Covaris聚焦超声仪对合格的DNA样品进行打断。加入End Repair Mix置于20℃ 30分钟进行末端修复后，用QIA quick PCR Purification Kit(Qiagen)纯化DNA片段。使用A-Tailing Mix置于37℃ 30分钟在3’末端加A碱基，然后在DNA片段两端连接上测序接头。采用EZ DNA Methylation-Gold kit（ZYMO）进行Bisulfite处理，使用2%琼脂糖凝胶进行片段选择，并使用QIA quick Gel Extraction kit (QIAGEN)回收目标片段。最后使用Agilent 2100 Bioanaylzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对样品文库进行质控与定量。合格文库采用Illumina平台进行测序。 1.2 生物信息分析概述 得到下机数据后，首先进行数据过滤，去掉低质量数据，得到可用数据。完成数据过滤后，需检测可用数据量是否符合合同要求。检测合格后，将可用数据与参考基因组进行比对，得到比对结果。在确认比对质量合格后，使用唯一比对数据计算得到全基因组C碱基甲基化信息，进行信息分析处理，得到标准信息分析结果和个性化分析结果。 1.3 数据过滤 数据过滤包括去、污染以及低质量序列。数据过滤分析使用华自主的分析软件，低质量的reads包括以下两类，符合任意一条的都会被剔除： 1) N > 10%； 2) 质量值小于20的碱基>10%。 完成过滤后的reads称为clean reads，这些数据存储为FASTQ格式（参见帮助页中的FASTQ格式）。 1.4 序列比对 过滤完成后，clean data与参考基因组进行比对（BSMAP），并计算每个样品的比对率和bisulfite转化率等统计信息。 1.5 甲基化水平 甲基化水平是支持甲基化的reads数占所有覆盖该位点的reads数的比例[3]。计算公式如下： Nm为改为点是甲基化C的reads数，Nnm为该位点是非甲基化C的reads数。
甲基化测序word版
DNA甲基化检测实验 一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP） （Bisulfite Genomic Sequence） 原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。该方法特点是： ?特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的； ?灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。 重亚硫酸盐测序法技术实验流程 A． DNA制备 用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。 B．重亚硫酸盐处理 C． DNA纯化 用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。 D． PCR扩增 E． PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化 F． PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。 G．用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析 二、甲基化特异性的PCR实验流程 （methylation-specific PCR, MSP） 原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐
甲基化原理及步骤
二、DNA亚硫酸氢盐修饰和纯化操作步骤 修饰设计：使用CpGenome TM kit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。 第一步：试剂准备 （1）3 M NaOH原料（用前现配） 把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。 （2）20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配） 配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。 （3）溶解试剂Ⅰ（用前现配） 打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。 （4）溶解试剂Ⅱ 打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。 第二步：DNA修饰程序 1、在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH 加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。 注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA 修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。 2、50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴） 3、加入550 μl新鲜配制的DNA修饰试剂Ⅰ并涡旋振荡。 4、加热块或水浴50℃避光孵育4-16小时。
DNA甲基化详解
提到遗传，我们都已经习惯于这样的概念，即基因组的编码信息存在于ACGT 这四种碱基的排列顺序中。然而，诸如胞嘧啶的甲基化修饰及其分布，组蛋白的乙酰化等，同样影响着表型。这就构成了表观遗传学(epigenetics)的主要研究内容。其实，早在1942年，C.H.Waddinton就提出了表观遗传学的概念，他指出，表观遗传与遗传相对，主要研究基因型和表型的关系。而现在，对于表观遗传学，比较统一的认识是，其研究在没有细胞核DNA序列改变的情况时，基因功能的可逆的可遗传的改变。也就是说，在不改变基因组序列的前提下，通过DNA 和组蛋白的修饰等来调控基因表达，其中又以DNA甲基化(DNA methylation)最为常见，成为表观遗传学的重要组成部分。随着人类基因组计划的开展，科学家们开始在基因组水平来研究表观遗传学，逐步形成表观基因组学(epigenomics)。表观基因组学就是要在整个基因组水平来研究表观遗传过程以及与这些过程密切相关的特定基因组区域的识别与鉴定。2000年10月，人类表观基因组协会(Human Epigenome Consortium)由欧盟赞助，启动了旨在于人类6号染色体MHC 区域首先做出DNA的甲基化图谱的先导计划(Pilot Project)。该计划顺利完成，引导启动了2003年的人类表观基因组计划(Human Epigenome Project，HEP)。2005年，美国国家卫生院(NIH)下属的国立癌症研究所启动了癌症基因组先导计划。2006年，该所与国立人类基因组研究所一起共同启动癌症基因组计划(Cancer Genome Project)。表观基因组学和DNA甲基化与癌症的研究成为新的热点。本文将简要介绍DNA甲基化与CpG岛，癌症与DNA甲基化，和DNA甲基化的重要检测方法。DNA甲基化与CpG岛：在人类表观遗传学研究中，最常见的就是CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰。其主要过程是，在CpG甲基化结合蛋白(Methyl-CpG Binding Proteins,MBDs) 和DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变成为5’甲基胞嘧啶。在正常人类的DNA中，约有3-6%的胞嘧啶被甲基化。在哺乳动物中，约有50,000,000个CpG二核苷酸，其中70%的被甲基化。而那些可被甲基化的CpG 二核苷酸并非随机的分布于基因组序列中，相反，在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子区域，5’端非翻译区和第一个外显子区，CpG 序列密度非常高，超过均值5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，称之为CpG岛(CpG Islands, CGIs)。CpG岛的概念最早由Adrian Bird提出，他称之为
MERIP-seq(RNA甲基化测序)
https://www.wendangku.net/doc/50874494.html, 1 MeRIP 测序 m6A 甲基化修饰在基因表达调控、mRNA 剪接、RNA 编辑、RNA 稳定性、控制mRNA 寿命和降解、介导环状RNA 翻译等方面扮演重要角色。 甲基化RNA 免疫共沉淀结合高通量测序（Methylated RNA Immunoprecipitation with Next Generation Sequencing ，MeRIP-Seq ）是研究细胞内转录组表观修饰的最新技术。这项技术通过使用N6-甲基腺嘌呤抗体富集高甲基化的RNA 片段，然后结合高通量测序，在全转录组范围内研究发生甲基化的RNA 区域，从而比较不同细胞、组织、样本间的RNA 甲基化修饰模式的差异，可帮助解决细胞分化、生物发育、疾病发生发展、热休克反应等生物学问题。 技术参数样 品 准 备 测 序 策 略推 荐 数 据周 期200ug RNA 2×108细胞量 300bp RNA 文库 HiSeq PE150测序 10Gb clean data 80个工作日 建库方法技术流程
https://www.wendangku.net/doc/50874494.html, 2 技术特点 （1）对抗体进行严格质检、效价分析，提供文章发表质量的IP 报告； （2）对MeRIP 实验体系进行精心优化； （3）特有的Peak calling 技术； （4）提供个性化分析报告，提供关联分析、解析m6A 调控机制。 部分结果展示 差异结合分析 差异结合KEGG Pathway 富集分析 Peak 的Motif 分析 案例解析 RNA 甲基化m6A 修饰调控造血干/祖细胞分化 脊椎动物中，造血干/祖细胞（HSPC ）来源于生血内皮，通过内皮-造血转换（EHT ）方式在主动脉血管底部产生。Mettl3是RNA 甲基转移酶，敲除Mettl3造成胚胎造血功能发育受损，EHT 受到抑制，内皮细胞不能分化为HSPC ， HSPC 相关marker 表达量显著减少。 Mettl3敲除后，Mettl3蛋白表达量和全基因组的m6A 水平均下降（MeRIP-seq 结果显示，m6A 修饰水
DNA甲基化原理
DNA甲基化 甲基化检测服务-亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite genomic sequencing PCR, BSP)是利用未甲基化的胞嘧啶可以被亚硫酸氢钠发生脱氨基变为尿嘧啶的原理，用两一特异性引物扩增后测序。测序法克服了只能针对单个位点检测，并且这些位点必须是限制性内切酶识别位点的缺点，可以对任何基因序列的甲基化状态进行检测。 甲基特异性的PCR扩增（MS-PCR）示意图 DNA甲基化（英语：DNA methylation） DNA甲基化是一种表观遗传修饰，它是由DNA甲基转移酶（DNA methyl-transferase, DNMT）催化S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)作为甲基供体，将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶（mC）的一种反应，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位点，它在基因组中呈不均匀分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的区域，在哺乳动物中mC约占C总量的2－7％。DNA甲基化是表观遗传修饰的主要方式，能在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。为外遗传编码（epigenetic code）的一部分，是一种外遗传机制。DNA甲基化过程会使甲基添加到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5'碳上：这种5'方向的DNA甲基化方式可见於所有脊椎动物。在人类细胞内，大约有1%的DNA碱基受到了甲基化。在成熟体细胞组织中，DNA甲基化一般发生於CpG双核苷酸（CpG dinucleotide）部位；而非CpG甲基化则於胚胎干细胞中较为常见。植物体内胞嘧啶的甲基化则可分为对称的CpG（或CpNpG），或是不对称的CpNpNp形式（C与G是碱基；p是磷酸根；N指的是任意的核苷酸）。特定胞嘧碇受甲基化的情形，可利用亚硫酸盐定序（bisulfite sequencing）方式测定。DNA甲基化可能使基因沉默化，进而使其失去功能。此外，也有一些生物体内不存在DNA甲基化作用。
重测序-全基因组选择(GS)
首页 科技服务 测序指南 基因课堂 市场活动与进展 文章成果 关于我们 全基因组选择1. Meuwissen T H, Hayes B J, Goddard M E.Prediction of total genetic value using genome-wide dense marker maps[J]. Genetics, 2001, 157(4): 1819 1829. 阅读原文>> 2. Haberland A M, Pimentel E C G, Ytournel F, et al. Interplay between heritability, genetic correlation and economic weighting in a selection index with and without genomic information[J]. Journal of Animal Breeding and Genetics, 2013, 130(6): 456-467. 阅读原文>> 3. Wu X, Lund M S, Sun D, et al. Impact of relationships between test and training animals and among training animals on reliability of genomic prediction[J]. Journal of Animal Breeding and Genetics, 2015, 132(5): 366-375. 阅读原文>> 4. Goddard M E ,Hayes BJ. Genomic selection [J]. Journal of Animal Breeding and Genetics,2007,124:323:330. 阅读原文>> 5. Heffner E L, Sorrells M E, Jannink J L. Genomic selection for crop improvement [J]. Crop Science, 2009, 49(1): 1-12. 阅读原文>> 参考文献 全基因组选择简介 Meuwissen等[1]在2001年首次提出了基因组选择理论(Genomic selection , GS)，即利用具有表型和基因型的个体来预测只具有基因型不具有表型值动植物的基因组育种值(GEBV)。 例如，提高奶牛的产奶量一直是奶牛研究者的研究重点，传统育种的方法需要牛生长至成年后，才能进行产奶量的测定，再进行后续的育种进程。如果在犊牛刚出生时就可以通过某种技术预测出其产奶量，就可以大大的减少育种时间，节省大量的育种成本。 全基因组选择（GS）利用覆盖全基因组的高密度分子遗传标记进行标记辅助选择，可以在奶牛的幼年时期就预测出其生产性状和营养性状，快速筛选出具有优良性状的奶牛或者种公牛，加速育种的进程。 全基因组选择技术参数 提供领先的基因组学解决方案 Leading Edge Genomic Services & Solutions 动植物重测序变异检测BSA性状定位遗传图谱群体进化全基因组关联分析Hi-C测序 人类基因组测序全基因组测序外显子测序目标区域测序单细胞基因组测序 动植物基因组测序全基因组survey 全基因组 de novo 测序泛基因组测序组装变异检测 微生物基因组测序16S/18S/ITS等扩增子测序细菌基因组 de novo 测序真菌基因组 de novo 测序微生物重测序宏基因组测序 建库测序建库测序 诺禾致源微信文章精彩阅读 >> 版权所有：北京诺禾致源科技股份有限公司 转录调控测序 真核有参转录组测序医学转录组测序真核无参转录组测序比较转录组与泛转录组测序原核转录组测序宏转录组测序单细胞转录组测序LncRNA测序circRNA测序small RNA测序ChiP-seq RIP-seq 全基因组甲基化测序 GS 重测序新产品发布 群体大小 参考群体的选择十分重要，表型信息及固定效应信息记录需要准确完整。此外，选择出 的参考群体要满足内部亲缘关系比较远，数量达到1000个以上[2]。候选群体最好与参考群体的亲缘关系较近，这样可以保证育种值预测的准确性[3]。 测序策略 测序深度：平均每个样本≥10×；测序平台：Illumina HiSeq PE150测序； 全基因组选择技术优势 全基因组选择与传统的分子标记辅助选择相比，具有很多优势[5]： 能够在得到物种个体DNA的时候即对其进行育种值评估，可以缩短世代间隔，加快遗传进展并且降低经济投入。 全基因组范围内的标记能够解释尽可能多的遗传变异，可以对遗传效应进行较为准确的检测和估计。 能够较准确的评估遗传力较低、难测定的性状或测定费用较高的性状。 通过基因组选择的方式，即使单个标记的效应很微小，导致遗传变异的所有遗传效应也都能够被SNP标记捕获， 所以比传统的基于系谱和表型数据的最佳线性无偏模型得到更高的可靠性。 a b c d
甲基化检测方法
甲基化检测方法 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
甲基化检测（detection of methylation） 概念：DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶转变为5'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。 这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。 现有检测方法 1.甲基化特异性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变;随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化; 反之，说明被检测的位点不存在甲基化。 2.亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP) 用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。 3.高分辨率熔解曲线法(High Resolution Melting，HRM) 在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化。 送样要求 细胞(≥106个)、组织(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥等样品材料，基因组DNA(体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl)。