土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望5[1]

土壤微生物群落结构影响因素及研究方法的现状与展望

摘要: 土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分, 在土壤有机物质分解和养分释放、能量转移等中起着重要作用。随着人们对生物群落结构多样性重要性认识的不断深入及研究方法的不断改进, 土壤微生物群落结构多样性, 尤其是群落结构的研究工作逐渐受到生态学家的重视。本文从土壤微生物群落结构多样性的影响因素以及研究方法等方面阐述了目前国内外土壤微生物群落结构多样性的研究现状, 并对其未来研究方向进行了合理展望。

关键词:微生物,群落结构, 土壤微生物群落

Review and prospects on methodology and affecting factors of soil microbial community structure

Abstract:Soil microorganisms are important components of soil ecosystem and play

central roles in biogeochemicalcycling such as organic matter decomposition, mineral nutrient release, and energy transformation. Along with the intensive comprehension of the importance of microbial community structure diversity and the rapid development of methodology, more and more studies have focused on soil microbial community structure diversity. This review introduces the current development of methodology and affecting factors of soil microbial community structure diversity. We also discussed the directions of future research on soil microbial community structure diversity.

Key words: biodiversity, community structure ; soil；microbial community

引言

土壤微生物主要指土壤中那些个体微小的生物体,主要包括细菌、放线菌、真菌,还有一些原生动物和藻类等[ 1 ] 。土壤微生物是影响土壤生态过程的一个重要因素, 土壤微生物在土壤形成、生态系统的生物地球化学循环、污染物质的降解和维持地下水质量等方面都具有重要作用[ 2, 3, 4 ] 。由于土壤中微生物个体微小, 数量多,土壤微生物分离和鉴定困难,土壤环境条件复杂等原因, 目前为止大约仅1～10%的土壤微生物被分离和鉴定,这些限制了对土壤微生物

在陆地生态系统中重要作用的认识[ 5, 6 ] 。虽然,对土壤微生物的认识有限,但这并没有影响它们在维护整个陆地生态系统稳定中的重要作用。近年来,随着研究的日益深入,对土壤微生物群落结构及其影响因素、土壤微生物结构与生态

功能的关系,土壤微生物在维持土壤质量等方面的研究越来越受到土壤学家、生态学家和微生物学家的关注.

许多研究已经证实，通过传统的分离方法鉴定的微生物只占环境微生物总数的0.1% ~10 %[1, 2]。传统的土壤微生物研究方法如分离计数法、显微镜法往往会过低估价土壤微生物的群落结构组成，虽然使用电子显微镜或荧光抗体染色法可以对土壤微生物形态多样性进行观察，但是这两种方法并不能描述出土壤微生物的群落结构组成方面的信息，也无法描绘出不同群体的生理差异。随着微生物研究技术的发展尤其是分子生物学技术的发展，土壤微生物学家开发出一系列的研究土壤微生物群落结构的方法。

1土壤微生物多样性影响因素

1.1土壤生态系统内生物因素对土壤微生物群落结构的影响

1.1.1植物多样性对土壤微生物群落结构影响

陆地生态系统中植物多样性是影响土壤微生物群落结构的另一个重要因素[ 26 ] 。植物多样性对土壤微生物群落结构的影响主要是两个方面:一方面是植物为土壤微生物提供营养物质,另一方面植物多样性影响整个生态系统的过程,进而间接的影响土壤微生物的群落结构[ 27, 28 ] 。森林植物物种组成影响土壤微生物数量、群落结构及活性[ 29 ] 。Bardgett 等发现栽种不同草本植物的土壤具有明显不同的土壤微生物磷脂酸图谱( PFLA) [ 31 ] 。Grayston等利用B IOLOG系统研究发现长有不同草本植物的土壤具有不同的土壤微生物群落[ 32 ] 。森林植被能影响林地微环境,通过根系分泌物、地上和地下凋落物以及树冠的拦截和淋洗作用改变土壤微生物生长所需能量物质的数量和质量

[ 29,33 ] 。陆地生态系统中植物通过凋落物和地下根系分泌物为土壤中微生物提供营养物质。不同的植物凋落物理化性状不同,凋落物分解过程中释放的有机,无机物也不同,从而对土壤中微生物生长具有选择性刺激作用。另外,不同植物的根系分泌物也有很大差异,很早的研究就发现活的根系能分泌种类繁多的可溶性有机物质,包括糖、氨基酸和有机酸等,这些分泌物质为土壤生物提供C源引起根际微生物的快速生长,一般由活根分泌的可溶性有机物质通常在1 ～10g/100g 根干重[ 28 ] 。随着研究手段的进步发现根际中的真菌微生物比以前认识要丰富得多[ 34 ] 。植物多样性对土壤微生物群落结构的影响具有几个特点: ( i)

植物对土壤微生物特别是根际土壤微生物群落组成有选择性影响( ii)这种选择影响的强度随植物不同而有差异( iii) ,这种选择性影响具有植物特异性

[ 10 ] 。植物的这种特异性在菌根菌和Frankia菌等与植物具有共生关系的微生物中表现的更加明显。

1.1.2土壤微生物间相互作用

土壤微生物之间存在复杂的关系,包括共生,互生,捕食等. 土壤微生物之间相互作用维持着整个土壤生态系统内土壤微生物群落结构的稳定。在森林生态系统中不同土壤微生物相互作用共同完成对凋落物的分解,推动整个系统的物质循环、能量流动。此外,在土壤中存在着大量的有益菌群,目前研究较多的是根际促生菌( PGPR) ,它们能维持土壤质量的健康,减少土壤中病源微生物的生长。土壤微生物之间具有一定的拮抗作用。土壤中细菌产生的挥发性物质能影响其它土壤微生物的生长,直接影响了土壤微生物的群落结构。细菌的挥发物质影响真菌的生长和酶的活性,这种作用受细菌种类、年龄、环境因素的影响,并且真菌对不同细菌的产物具有特异性[ 16 ] 。土壤微生物之间更多的是半共生关系,即“一种生态依赖关系,一种生物体改变周围的环境,为其后来的另一种生物体的生长创造条件”[ 23 ] 。在植物凋落物分解过程中不同土壤微生物相互协作共同完成对凋落物的分解,分解过程中微生物具有一个演变的过程. 通常,真菌在凋落物分解过程初期占主要地位,分解凋落物中新鲜物质,而细菌在分解后期占主要地位完成凋落物的最终分解和矿化过程[ 24 ] 。

1.1.3土壤动物多样性对土壤微生物活性与群落结构影响

土壤动物对土壤微生物群落结构的影响主要包括以下3个方面: (1)土壤动物的粉碎、搅拌、混合作用。土壤动物通过这些作用使进入土壤的凋落物等物质充分的与土壤混合,增加了土壤微生物与这些物质的接触机会。土壤动物消化植物残体后通过粪便排出体外,改变了这些物质的化学成分,大小等理化性状,导致了土壤微环境的改变。改变了土壤中细菌,真菌等不同微生物类群的竞争能力,引起土壤微生物群落结构的改变[ 25 ] 。(2)土壤动物的选择性捕食作用。土壤中的原生动物主要以细菌和酵母菌为食物,最适合的食物来源是一些假单胞菌( Pseudom onadaceae)和肠细菌( En terobacteriaeae ) , 酵母菌中的可勒克氏酵母(Kloeckera) 、红酵母( Rhodotorula ) 而有些细菌,放线菌,真菌能产生

对原生动物有毒害作用的细胞外物质[ 25 ] 。(3)土壤动物的传播作用。土壤动物对土壤微生物体或孢子的散布有作用,特别是在地表下,在干燥条件下,这时风和水对孢子的散步作用相对小。土壤动物的传播作用主要通过体表,口腔,粪便等途径。

1.2土壤理化性状对土壤微生物群落结构的影响

1.2.1土壤物理性状

ⅰ壤颗粒大小不同的颗粒等级的土壤其中的土壤微生物差异很大,粘粒部分土壤微生物多样性较高,细菌数量多,主要通过减少土壤微生物被土壤动物捕食的机会,增加微生物获得营养的机会,增加土壤环境的多样性如降低氧气浓度为厌氧菌提供生长条件等,相反在较大颗粒的土壤中真菌数量相对增加。土壤微生物群落结构由于土壤颗粒大小的不同而差异很大[ 13 ] 。

ⅱ水分水分保持能力极大影响了孔隙中的氧气条件, 进而影响了相关土壤中微生物的活性[ 14 ] 。Cook等( 1970 ) 就注意到土壤中细菌在高的水势(waterpotential)情况下活性高,而真菌,放线菌在相对低的水势情况下活性较高[ 15 ] 。在森林立地条件中土壤湿度是土壤微生物和土壤动物的一个重要控制因素[ 16 ] 。Joshua (1999)等研究了桦树凋落物分解过程中湿度对微生物活性和群落结构的影响,发现长时间干燥导致微生物呼吸和生物量降低,微生物群落结构变化,特别是潮湿和干燥的时间长度对土壤微生物影响很大[ 17 ] 。

ⅲ土壤温度通常每种微生物都有自己的最适生长温度。微生物生长速率随温度升高而加快,当达到最适生长温度后再升高温度,反而使微生物生长变慢,而且不同的微生物种类生长的最适温度不同,所以,由于土壤温度的差别,土壤微生物群落结构组成也不同,并且随温度变化而改变。土壤温度变化导致土壤中微生物群落结构发生改变,原因可能是某些微生物群落成员在较高的温度时有能力代谢那些在较低温度时不能被利用的基质[ 18 ] 。

ⅳ不同的气候条件下,由不同母岩发育而来的土壤其类型不同,决定了土壤颗粒组成、湿度、温度、pH值等理化性状的不同。因此,不同土壤类型的中的微生物区系多样性及组成的差别很大。Martina S. Girvan等(2003)用B IOLOG方法, rDNA - DGGE和16S rRNA多种方法对不同管理条件下土壤微生物群落结构及变化规律进行研究,发现所用研究的样地明显分为两组,其土壤微生物群落结构的

显著差异是由于土壤类型决定的,而不同有机物管理对土壤微生物群落结构影响不大。这是因为不同类型的土壤其物理、化学性状差异较大,而对于同一类型土壤来说由于土壤具有一定的缓冲能力所以土地不同经营措施对土壤微生物群落结构的短期影响较小。但是长期作用下,管理措施对土壤微生物影响可能更大,这些有待进一步研究[ 20 ] 。

1.2.2土壤化学性状

土壤中的微生物除了受土壤物理性状的影响外,更主要的是受到土壤中微生物可利用营养物质的影响。土壤中营养物质主要来源于地上植被的凋落物,植物根系分泌物,根的残体,此外还有土壤动物死后残体等,它们可以为微生物提供基本的碳源、氮源等物质[ 21 ] 。

ⅰ壤C、N元素土壤微生物群落结构受土壤C元素影响比较大,随着土壤中可利用C含量的减少土壤微生物数量降低, 微生物群落结构改变[ 4 ] 。Griffiths 等(1999)研究发现向土壤中施加含C量高的物质能提高土壤微生物群落中真菌和戈兰氏阴性细菌的比例, 降低放线菌和戈兰氏阳性菌的比例[ 22 ] 。Noath F. 等(2003)研究土壤微生物在土壤不同层面的分布得到同样的结论,虽土壤层面加深土壤中微生物数量减少,其中真菌和戈兰氏阴性细菌的比例减少,而放线菌和戈兰氏阳性菌的比例增加[ 4 ] 。土壤的N元素是土壤微生物生长的又一个限制因素,土壤中的N元素被微生物吸收利用后,在体内用于合成具有重要生理作用的蛋白质、核苷酸等生物大分子. 因此,土壤中N元素不足将严重限制土壤微生物的正常生长和活性。土壤微生物对土壤N源利用能力也有差别,通常N源易利用大小顺序为,铵态氮>硝态氮>有机氮。此外,不同土壤微生物利用N源能力也不同,这就使得土壤中N源的多少和种类将影响到土壤微生物的群落结构。土壤中可被土壤微生物利用营养的碳氮(C /N)比是表征土壤微生物生长是受C限制或是N限制的重要指标,影响到土壤微生物的群落结构。当C /N比等于或大于30: 1时土壤微生物生长受到N源限制,当C /N比等于或小于20: 1时土壤微生物的生长受到C源限制。一般, C /N比在25: 1时对土壤微生物生长最有利,也有利于维持土壤微生物在自然生态系统中的正常功能。

ⅱ壤pH值因素土壤pH值对于土壤中的微生物群落结构影响是相当复杂的,因pH对于营养的利用、微生物吸附、胞外酶的产生和分泌都会产生不同的影响。

不同微生物适合生长pH值也有差别,细菌、放线菌适宜生长在微碱性的条件下,而真菌适合生长在酸性条件,在大多数酸性土壤中( pH 值低于5) ,真菌数量相对较多,因此在这些土壤中,真菌所起的作用也比较大。除了土壤碳氮元素和pH 因素外,土壤中的其它营养元素,如磷、硫等也影响土壤微生物生长和群落结构。另外,土壤中一些Ca、Mg、Mn、Fe等微量金属元素,也影响土壤微生物生长。1.3不同经营措施对微生物群落结构的影响

1.3.1外施农药、化肥等措施

农药等杀虫剂作为一种外施入土壤生态系统的物质,它和土壤中其它物质一样能被土壤中的微生物或其分泌的酶降解,从而刺激或抑制了土壤中微生物的活性,引起土壤微生物群落结构的改变。A. C. Das(2000)研究不同杀虫剂对土壤微生物影响,发现HCH部分的有机磷杀虫剂等在田间合理的剂量下使土壤中细菌迅速增加,对放线菌、真菌刺激作用则不显著。通过对微生物具体种属的研究发现,对土壤中的优势种群影响不大,而次优种可能受到抑制导致其他种群大量生长,从而引起土壤微生物多样性其及结构的变化[ 35 ] 。同时,有一些杀虫剂不能被一种微生物降解,但可以微生物之间进行的共代谢分解[ 36 ] 。另外,还有一些杀虫剂对土壤中微生物产生毒害的影响[ 37 ] 。Novka等曾报道除草剂与微生物量的负相关性,尤其在水热条件差的情况下,增加剂量和高频率使用,以及几种除草剂的混合使用,微生物生物量和呼吸强度降低,群落结构发生变化[ 38 ] 。可见农药,除草剂等化学外源物质加入土壤对土壤微生物的影响比较复杂,受农药,除草剂类型、剂量、施用方式,以及土壤类型、温度和水分等条件的影响。施肥对土壤微生物影响也很大,张翔等(1998)通过15年定位研究发现施肥能明显增加微生物数量,长期施用化肥或配合施用有机肥和无机肥比不施肥,单施肥耕作层微生物数量增多[ 39 ] 。W. Borken (2000)研究了长期堆肥处理对森林土壤微生物呼吸、土壤微生物生物量碳、氮,土壤有机碳,土壤总氮的影响,结果发现施用堆肥初期土壤中微生物活性,数量增加,但是2年后土壤有机层微生物活性,呼吸下降,而土壤矿物层微生物活性、呼吸却升高,原因可能是由于熟化堆肥长期处理改变了堆肥养分的释放和土壤有机层的可溶性有机质量的改变,另外熟化堆肥使用量的不同对土壤微生物影响效应也有差异[ 40 ] 。施用肥料除了直接影响土壤化学成分变化,引起土壤微生物活性,土壤微生物群落结构改变外,

肥料能改变土壤的物理性状,影响地上植被的生长,从而间接的影响土壤微生物群落结构。Katarina and Erland ( 2004)研究了不同氮肥对根际微生物的影响,氮肥的增加引起根系分泌物的改变,铵态氮肥使根际微生物吸入胸腺嘧啶的量减少,根际pH值下降,植物茎长度比对照短,而硝态氮肥没有明显影响[ 41 ] 。将石灰、木灰等施入土壤中进行土壤恢复在农林生态系统管理上是一种常用的措施,并随近年来化肥施用引起环境污染, 使得这一措施更为重要。Zimmermann and Frey (2002)研究发现在酸性森林土壤中施入木灰(wood ash)以后土壤微生物活性短期急剧增加,而对土壤化学性状影响比较持久[ 42 ] 。另外,B?? th and Arnebrant (1994)研究发现WA应用对土壤微生物活性增加有长期效应[ 43 ] 。WA 应用于森林生态系统对森林土壤微生物影响,一方面增加了土壤中微生物可利用的营养元素,另一方面改变了土壤物理形状,从而引起土壤中微生物群落结构的改变。

1.3.2连栽、轮栽等措施

在农业和林业经营上有连载、轮作和间作等不同的模式,并且由于栽种不同的植物,导致土壤中微生物差别很大。这是因为不同的植被其凋落物,根系分泌物等进入土壤可以被土壤微生物利用的食物资源不同,而且地上植被能影响到土壤温度、湿度等环境因素,从而对微生物结构产生不同的影响。陈灏等通过对种植不同农作物的农田进行16SrNA分析发现种植不同作物的农田中存在其特殊的微生物种群[ 44 ] 。在森林生态系统中不同林型条件下土壤微生物群落结构差别更大,因为在森林系统中土壤微生物主要的营养来源是植被凋落物。在人工林系统研究中发现混交林土壤中微生物多样性比纯林多样性高,纯林土壤生物多样性下降可能是近年来人工纯林土壤衰退,森林生产力下降原因之一[ 45, 46 ] 。在农业和林业生产上存在一个普遍的现象是连作障碍。所谓连作障碍就是指在同一块地上连续栽种同一种作物或树木后,其生产力下降。对于这种现象科学家对其进行了广泛的研究,很多研究发现连栽后土壤中微生物多样性降低了,土壤中出现了一些产生有害物质的微生物,从而导致连栽杉木人工林土壤质量下降[ 19 ] ;杜国坚等(1995)研究发现连栽杉木林地土壤微生物中的细菌、放线菌数量下降而真菌数量出现增加[ 47, 48 ] ;也有研究发现杉木连栽后土壤中根际微生物数量增加,非根际微生物下降的现象,这可能是连栽导致根系分泌改变的缘

故[ 49 ] 。而进行轮作或栽种混交林后能使土壤微生物群落结构改善,陆地生态系统中物质、能量循环得以顺利进行,使林地生产力得以提高[ 45, 46 ] 。

1.3.3因物种的引入等措施

近年来,随着分子生物技术的发展与应用,越来越多的转基因植物被用于农林生产中. 转基因植物引入生态系统后,会对环境产生怎样的影响成为科学家关注的问题,转基因植物对土壤中微生物群落结构产生怎样影响也引起有关学者的重视。Donegan等(1995)研究了一种能产生内毒素的转基因棉花对土壤中细菌、真菌数量和结构的影响。他们发现产生内毒素的转基因棉花使土壤中微生物数量出现短暂的增多,用BIOLOG系统和DNA指纹技术等方法发现土壤微生物结构也发生变化。但是如果只加入纯净的毒素对微生物区系多样性影响则不显著。他们认为,不是由于外源底物引起微生物群落结构发生变化,可能是由于外源基因的引入使植物体内在的化学特性发生了改变,从而使植物分解加快,促使土壤微生物数量增加,土壤微生物群落结构变化[ 50 ] 。但是,究竟怎样影响土壤中微生物的群落结构,影响程度多大还有待今后进一步的研究。另外,也有大量转基因的微生物被释放到环境中用来降解环境中的污染物质,这些转基因微生物释放到环境中的会对土壤中原有的土著微生物群落结构产生怎样影响,都应该成为我们今后研究的问题。

2土壤微生物群落结构研究方法

2.1生物标志物（Biomarker）法

使用生物标志物来定量描述土壤微生物的群落结构组成是最常用的方法之一。这种生物标志物通常是微生物细胞的生化组成成分或是细胞外分泌产物。当测定土壤中这些化合物时，首先使用一种合适的提取剂直接把其从土壤中提取出来，然后对提取物进行纯化后用合适的仪器加以定量测定。用这种方法来定量描述土壤微生物的群落结构组成的优点是既不需要把微生物的细胞从环境样中分离，同时又能克服由于对微生物培养而导致不同微生物种

群可能会发生选择性生长所造成的麻烦。磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）图

谱分析、脂肪酸（fatty acid, MFA）谱图以及甲基脂肪酸酯（fatty acid methyl ester, FAME）谱图分析在群落动态分析上的应用十分广泛。磷脂是构成生物细

胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%[3]。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来[4]，然后用气相色谱分析，得出PLFA 谱图。群落的微生物结构发生变化，即可以通过谱图的变化得到快速有效的监测。甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，该法利用MIDI 系统（一种气相色谱分析系统）分析出全细胞的FAME 谱图。Wilkinson SC[5]等人用PLFA 谱图法找出了微生物群落与树木根系的关系。Haack[6]等人通过试验验证了FAME谱图法分析土壤微生物群落的可行性，还同时进行了生物量、分类结构实验，结果表明FAME 谱图法能够监测土壤微生物群落细微变化。为人们提供了一个监测土壤微生物群落结构的常规方法。Yao Huiying[7]等应用PLFAs 分析了8 个不同肥力水平和种植历史的中国红壤的微生物群落结构，发现PLFAs 总量与土壤有机C、总N、微生物量C和基础呼吸呈显著正相关，种植历史和植被类型对土壤微生物群落结构有很大影响。FAME 分析法为种内关系的建立提供了一个快速而可靠的方法，但不同属甚至不同科的微生物的FAME 有可能重叠，因在区分关系较远的微生物应用上有一些困难。但以FAME 的多样性来表示一

个不太复杂的生态系统的生物多样性仍有一定的参考价值。

2.2 BIOLOG 微平板研究单一碳源底物利用能

（Sole-Carbon-SourceUtilization，SCSU）

该方法最初由美国的 BIOLOG 公司于1989 年开发成功，最初应用于纯种微生物鉴定，至今已经能够鉴定包括细菌、酵母菌和霉菌在内的2000 多种病原微生物和环境微生物。1991 年Garland 和Mills开始将这种方法应用于土壤微生物群落的研究[8,9]。这种方法是基于微生物群落对 95 种不同C 源的利用度来描述群落中微生物的动态变化。微平板中有氧化还原指示剂和95 种不同C 源，加入样品后，由于样品对每种C 源的利用能力不同，导致氧化剂颜色变化不同，用分析系统分析结果，就可以得到群落代谢的变化情况。这样，这种C 源利用度的信息就可以用来研究不同环境条件引起的微生物群落变化。杨元根等[10]用Biolog方法研究了英国阿伯丁市城市土壤和邻近农村土壤的微生物群落结构和

功能多样性。结果表明，在重金属元素的胁迫下，城市土壤的微生物群落与农村土壤相比发生了显著的变化。

由于不同的微生物对同一 C 源的利用能力是有差异的，微生物对不同单一C 源的代谢指纹差异并不能简单地归纳为微生物群落数量和结构的差异，而且土壤微生物在BIOLOG 系统中生长时，由于温育环境的改变引起微生物对C 底物实际利用能力的改变，使得BIOLOG 方法在准确性方面受到一定限制，但BIOLOG 方法因快速、简便而受到人们的欢迎。

2.3 土壤总DNA 复性分析

通过测定土壤 DNA 的碱基组成和复杂性可估计出总的遗传结构及其复杂性。分析DNA 的溶解曲线可以得到碱基组成的G+C 百分比。对于一个恒定的DNA 浓度来讲，复性速率是DNA 多样性的倒数。Britten 和Dohne[11]引入C0t1/2 这个术语来表示基因组的大小，C0 表示实验开始时，单链DNA 中碱基对的原始摩尔浓度，t1/2 表示半数DNA 发生复性时所需要的时间，它是以秒为单位的

（C0t1/2=K-1）。他们证实从一个种中分离所得的DNA，在没有DNA 重复序列存在时，它的C0t1/2值和这个种的基因组大小成正比。从土壤中抽提所

得到的DNA 是各种不同类型微生物DNA 的混合物，其比例也有着很大的差异。

C0t1/2 值提供了DNA复杂性的资料。目前，已将C0t1/2 作为多样性的指标，它是测定群落总的遗传复杂性的方法之一，它反应了群落中信息的量以及这些量是如何分布的。Torsvik 等[12]用DNA 复性试验研究了挪威一处山毛榉树林土壤的微生物群落多样性。根据试验结果估计每克土壤中大约有4000 种微生物。土壤总 DNA 复性分析是较早应用的方法，该

方法对土壤微生物组成结构的估计是比较粗放的，准确性也差，提供的信息少，现在已很少使用。

2.4 以PCR 为基础的rRNA 及rDNA 的分析方法

rDNA 在细胞中相对稳定，拷贝数多，并存在于所有细菌中。rDNA 由保守区和可变区组成，在细菌中高度保守，素有“细菌化石”之称，是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。原核生物的rRNA 分为3 种，分别为5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA，并且它们位于同一操纵子上。其中，16S rRNA 序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法，23S rRNA 分子比较大，并且只有少

数种的核酸序列被报道，尚未在细菌分类和鉴定中得

到广泛应用。16S ~ 23S rDNA 间区（Intergenic SpacerRegion, ISR）由于没有特定功能和进化速率比16SrDNA 大十多倍，近几年来在细菌系统发育学，特别是在相近种和菌株的区分和鉴定方面占据一席之地。由于以上序列每年都以很快的速度补充到Genebank 中去，这使得微生物工作者能够比较方便地利用这一数据库进行微生物群体多样性研究。

Ⅰ性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE）

自从Myuzer[13]首先将DGGE 技术应用到分子微生物生态学后，已证明这类电泳技术是揭示土壤中微生物群体遗传多样性的有效手段，可用于污染土壤中微生物群落结构的研究、微生物种群动态的分析等。DGGE和TGGE开始时在医学上用于检测基因突变，后来被广泛应用于微生物生态的研究。同样大小的DNA 序列由于含有的碱基不同，各片段的Tm 值也就不同。甚至一个碱基对的不同，都会引起Tm 很大的差异，DGGE 或TGGE 就是应用这种差异来区分不同的基因序列。这种电泳方法在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺（DGGE），从正极到负极梯度递加，或是形成温度梯度（TGGE）。电泳中的DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到分离效果。而且染色后的凝胶用成像系统分析，还可以半定量地测定样品DNA 浓度的大小。反映微生物群落组成的变化。该方法扩增土壤样品的16S rRNA 的部分基因序列（100 ~ 400bp），通过DGGE 或TGGE 分离收集不同条带的DNA 测序，再同GENEBANK 中现有的序列比较即可确定微生物种类。该方法分析土壤微生物群落结构组成具有快速、重复性好等优点，目前在土壤微生物群落结构分析上应用最为广泛。但该方法在对土壤微生物群落结构进行精细解析上具有一定的限制性，因为对于G+C 含量相同但碱基序列不同的片段难以区分。Said EL Fantroussl 等[14]提取了长期使用3 种Phenylurea 类除草剂（diuron, linuron, and chloro toluron）的土壤中总DNA，采用16Sr RNA 通用引物PCR 扩增了16S rDNA，通过分析DGGE 的条带模式，发现除草剂污染的土壤和没有使用过除草剂的土壤微生物群落结构有显著的不同，并且使用过除草剂的土壤微生物多样性减少了。而且还通过测序几种变化的DGGE 条带，发现diuron 和linuron 污染后影响最大的属于几种未被培养的微生物类群。

Ⅱ 6S rDNA 的限制性片段长度多态性（RFLP）分析（ARDRA）

提取土壤中的微生物总DNA，以通用引物扩增16S rRNA 基因，并构建于载体上，转化大肠杆菌，建立16S rRNA 基因文库，随即选取一定数量的克隆，以特定的限制性内切核酸酶消化16S rRNA 基因，通过电泳分析消化后的片段长度多态性，来反映微生物群落结构的多样性。Dunbar 等[15]同时利用分离培养物和直接从土壤中提取的16S rDNA 基因的RFLP 图谱分析了松树根圈土壤（pinyon rhizosphere soil）和树间的土壤（between-tree soil）微生物的群落结构，他们通过Rsa_和BstU_两种限制性内切酶分别分析了179 种分离培养物和801 种直接从土壤中提取的16SrDNA 基因的RFLP 图谱，发现从土壤中直接提取的有498 种系统型（Phylotype）而在分离培养物中却只有34 种。并且还发现松树根圈土壤中的微生物丰富度大于树间的土壤。ARDRA 方法是基于碱基的排列顺序为依据的，更具有精确性，而且，土壤16S rRNA 基因文库越大，反映土壤微生物的结构越全面，该方法获得的序列还能准确的反映菌株的系统发育信息。ARDRA 方法最大的缺点是工作量大，目前，应用该方法进行微生物群落结构分析，还没有人设置重复。

Ⅲ 16S rDNA 末端标记限制性片段长度多态性分析（T-RFLPs）

由于16S rDNA 的限制性片段长度多态性（RFLP）分析（ARDRA）所产生的片段多，分析起来工作量大，人们在此基础上又发展了一种高效、灵敏的方法。该方法在用细菌通用引物PCR 扩增16S rRNA 基因时，在其中一条引物的5_末端用荧光素进行标记，然后对土壤样品DNA 进行PCR 扩增。扩增产物16S rDNA 经特定限制性内切酶消化后，经电泳分离，荧光素标记的末端片段经显色后，可以比较精确的确定标记末端的片段长度，或对其进行测序，末端标记限制性片段长度多态性分析是研究土壤微生物多样性和结构的一种有效而快速的手段。它克服了ARDRA 方法工作量大、分析烦琐的缺点，同时又保留了ARDRA 方法分析精度高、能获得土壤微生物系统发育信息的优点，是一种较为理想的方法。目前，RDP[16]数据库（http:// rdp. https://www.wendangku.net/doc/53885358.html,/html）已经建立了T-RFLP 数据库，研究者只需把自己的T-RFLP 片段类型与数据库已知类型比较，不必测序即可知道菌株的系统类群。Wen TL等[17]用T-RFLP 分析了活性污泥、生物反应器污泥等环境样品的微生物结构，揭示了高度的种群多样性。

2.5 单链构象多态性（single strand conformationalpolymorphism,SSCP）SSCP 本来是用于临床鉴定基因突变，近年来被用于微生物生态学研究[18 ~ 20]。单链DNA 片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的。当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。空间构象有差异的单链DNA 分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同。因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开。该方法主要包括以下步骤：①提取土壤基因组DNA；_用细菌通用的扩增16S rRNA 基因的引物扩增16S rDNA；将扩增后的产物变性，形成单链的DNA；用聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同的片段分离；回收DNA，测定不同条带的序列，同GENEBANK 的16S rDNA 序列比较，确定微生物的分类地位。Frank 等人[21]通过对根系微生物的分析表明SSCP 可以很好地分

析微生物群落的动态变化，并应用此方法研究了种植对土壤微生物群落的影响。

2.6 随机扩增多态性DNA（RAPD）分析

Williams 等[22]发展起来的随机扩增的多态性DNA（RAPD，Random Amplified Polymorphic DNA）分子遗传标记技术以检测多态DNA 为目的，因其快速、简便在物种分类和亲缘关系鉴定、基因组分析等方面得到广泛应用，也可用于在DNA 水平上反映微生物群落的多样性。Yang 等[23]用RAPD 方法分析了农业化学污染物（三双甲酮、碳酸氢铵及其中间产物）对4 个土壤微生物群落的DNA 序列多样性的影响，用14 个随机引物，有12 个引物扩增出共155 个可靠的片段，其中134 个具有多态性，经过对DNA 序列多态性

的分析和DNA 丰度、修饰丰度、Shannon-Weaver指数和相似性系数的计算，结合土壤微生物生物量的测定，结果表明农业土壤化学物质可在DNA 水平上影响微生物多态性。

2.7 ERIC-PCR 图谱分析

在肠道细菌中发现的 ERIC 序列（EnterobacterialPepetitive Intergenic Consensus，肠杆菌基因间的重复共有序列）是一段长为126 bp 的反向重复序列，定位于基因组内可转录的非编码区域或与转录有关的区域[24]。后来证明这种序列在许多微生物中存在。以 ERIC 序列设计的特异引物对土壤中直接提取的总DNA 进行PCR 扩增，通过电泳分析其图谱，可以快速地用来比较土

壤微生物的群落组成。ERIC-PCR 图谱分析和RAPD 方法一样具有简便、快速的特点，可用于比较不同土壤样品微生物结构的变化。但由于该方法不能反映土壤微生物系统发育方面的信息，所以无法对土壤微生物的群落结构进行精细的分析。

高通量测序：环境微生物群落多样性分析

(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究 热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面， 对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术 的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量 测序技术（尤其 是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵 敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我 们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重 要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通 过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以 对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微 生物群

落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传 染病病原微生物。研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四 类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学 方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分 子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包 括:DGGE/TGGE/TTGE 、 T-RFLP 、SSCP、FISH 、印记杂交、定量 PCR、基因芯片等。 DGGE 等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数 优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA 序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需 对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操 作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做 到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微

《土壤里地微生物》教学设计课题

《土壤里的微生物》教学设计（第1课时） “土壤里的微生物”是科版七年级下册第13章第2节的容。是上一节课容的基础上，让学生进一步认识到土壤里生物的多样性，以及它们对生物圈的平衡和稳定起着非常重要的作用，从而对本单元环境中生物的多样性具有全面的认识。同时为下一章引导学生对生物进行分类奠定基础。因此本节课的意义十分重要，是本章的重点和难点。 教材分析 课标对本节的要“描述细菌的主要特征以及与人类生活的关系”。本节从单细胞细菌到多细胞的真菌、从肉眼看不见的细菌到大型真菌，带领学生走进丰富多彩的微生物世界。土壤中的微生物，学生平时不易见到，细菌需要用高倍显微镜才能更好地观察到形态，细菌的结构更难观察，而初中又不要求使用高倍显微镜，教材呈现了细菌的形态结构图片，所以只能通过图片、视频引导学生观察、比较认识细菌的基本特征。 学情分析 七年级学生通过小学科学课和上一学期生物课的学习，对生物学科有了初步的了解，具有一定的生物基础知识和学习经验，能够通过观察图片、阅读材料、对比分析、合作讨论等方式获取有关信息。但在学习上仍以感性认识为主，好奇心强、注意力容易转移,但他们活泼好动，喜欢直观形象的事物，喜欢动手实践。 有关微生物的相关知识在上学期在生态系统的组成学习过程中及学生日常生活经验中对微生物的类型和作用从总体上有了一个初步的了解，特别是在生活过程中家长或者教师从卫生角度常常提到细菌这个概念，学生对这一概念还是比较熟悉，对细菌与人类的关系也有不同程度的了解。但在生活中微生物是肉眼看不见的生物，只有用高倍或电子显微镜才能观察到，与人类的关系和对生物圈的作用又是隐性和潜在的，很少有机会引起学生的关注，容易被学生忽视和轻视，学生缺乏相应的感性知识和学习兴趣。对土壤中的微生物的类型、形态特征，生殖、营养方式、分布以及与人类生活的关系，学生比较陌生，这些是课程标准的明确要求，也是学生学习的终极目标。教材中只用文字表述，学生不容易理解，在教学中一是通过组织学生阅读教材在自主学习中从理论上了解细菌、放线菌的有关知识。二是通过播放有关细菌、放线菌形态、结构等视频资料及图片引导学生观察分析细菌和放线菌的形态、结构。三是利用小组

土壤微生物测定方法

土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(MierobialBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。 因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施 用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 -1K2SO 4（图将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入100mL0.5mol·L 水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min -1），用中速定量滤纸过滤于125mL塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入100mlL0.5mol·L -1K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入10mL0.018 mol·L -1K2Cr2O7—12mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃ 磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，放入后温度恰好为175℃）。冷却后无损地转移至150mL三角瓶中，用去离子水洗涤消化管3~5次使溶液体积约为80mL， 加入一滴邻菲罗啉指示剂，用0.05mol·L -1硫酸亚铁标准溶液滴定，溶液颜色由橙黄色 变 为蓝色，再变为红棕色，即为滴定终点。 （4）结果计算

七年级：土壤里的微生物

初中生物新课程标准教材 生物教案( 2019 — 2020学年度第二学期 ) 学校： 年级： 任课教师： 生物教案 / 初中生物 / 七年级生物教案 编订：XX文讯教育机构

土壤里的微生物 教材简介:本教材主要用途为通过学习生物这门课程，可以让学生打开对世界的认识，提高自身的见识，本教学设计资料适用于初中七年级生物科目, 学习后学生能得到全面的发展和提高。本内容是按照教材的内容进行的编写，可以放心修改调整或直接进行教学使用。 一、教学目标 (一)认知目标 1．介绍细菌、放线菌和真菌的形态结构、营养方式和生殖方式。 2．介绍微生物在自然界里的作用 (二)技能目标 培养学生的观察能力、分析问题的能力 (三)情感目标 1．通过对微生物在生产生活中应用的学习，培养理论与实践相结合的习惯。 2．通过介绍我国人民利用微生物造福社会的事例，激发学生的民族自豪感。 二、教学重点与难点 1．教学重点：微生物的形态、结构、营养方式。 2．教学难点：微生物的营养方式和生殖。

四、教学过程 （一）导入 一、认识细菌： 引入新课，教师接着指出：细菌分布广泛，无论是空气、水、土壤还是每个人身上都有细菌生活。但它是单细胞生物，个体十分微小，所以我们用眼睛看不到，下面我们就要了解一下细菌的形态和结构特点。 细菌形态①用高倍显微镜演示细菌的三种形态；②可以用显微投影仪投影放大细菌的三种形态。③播放细菌显微结构和亚显微结构的录像片段。细菌三种形态的示意图。接着教师总结出细菌的形态：单细胞个体，从形态上分为：球菌、杆菌和螺旋菌三类。 （3）细菌的结构特点，让学生与前面所学过的植物细胞结构进行比较找出相同点和不同点。注意强调：细菌细胞没有成形的细胞核是细菌细胞与植物细胞在结构上的重要区别，所以细菌不属于植物范围。另外，有些细菌具有特殊结构如：①有的细菌具有鞭毛可在水中游动。②有的细菌在细胞壁外有荚膜、具有保护作用。 关于芽孢，教师应该指出：能否形成芽孢是细菌总的特征，不是所有细菌都能形成芽孢。芽孢是该菌种的休眠状态，称休眠体。注意说明芽孢的形成不是细菌的繁殖方式，一个细菌只能生成一个芽孢，在适宜条件下，一个芽孢萌发形成一个菌体。芽孢对恶劣环境有很强的

土壤微生物的分解作用

“土壤微生物的分解作用”探究活动解读 摘要本文通过教学参考的形式，结合探究过程，将人民教育出版社2004年版高中生物新教材中“土壤微生物的分解作用”这一实验预做情况展示出来，以便于有关师生在实际教学、学习中有所帮助。文中重点叙述了土壤微生物对落叶、淀粉的分解作用等几方面内容。 关键词土壤微生物微生物的分解作用生态系统的物质循环 一、活动目标 1.分析生态系统中的物质循环。 2.尝试探究土壤微生物的分解作用。 3.认同生物与环境是一个统一的整体。 制定以上教学目标是基于这样的认识：学生通过该实验可以探究土壤中落叶等物质的消失源于土壤微生物的分解作用，更好地理解生态系统的物质循环中从有机物到无机物的过程。从而巩固生态系统物质循环和生物与环境整体性等相关生态学知识，为今后开展土壤生态学的研究工作打下基础。 二、背景资料 “土壤微生物的分解作用”探究实验是土壤生态学中的一个重要实验，该实验的原理是：土壤中的微生物主要有细菌、真菌、放线菌、藻类和原生动物，它们在生态系统成分中主要充当分解者，通过自身产生酶的作用，将落叶、淀粉等较复杂有机物分解成简单有机物或无机物分子，在自然界物质循环中起重要作用。 土壤是微生物的良好生境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响。根际微生物与植物的关系特别密切，不同的土壤和植物对根际微生物产生显著影响，而不同的根际微生物由于其生理活性和代谢产物的不同，也将对土壤肥力和植物营养产生积极或消极的作用。土壤微生物不仅对土壤的肥力和土壤营养元素的转化起着重要作用，而且对于进入土壤中的农药及其他有机污染物的自净、有毒金属及其化合物在土壤环境中的迁移转化等都起着极为重要的作用。这其中对土壤微生物的分解作用的研究是最基础、最深入的，这次通过本探究实验，可以为今后研究土壤理化性质及土壤微生物的其它作用，更多涉足土壤生态学打下坚实基础。 三、操作指南 材料用具： 1.土壤微生物对落叶的分解作用： 土壤、落叶、玻璃容器、标签、塑料袋、恒温箱、纱布 2.土壤微生物对淀粉的分解作用：

污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法

第26卷第10期 2006年10月生 态 学 报ACT A EC O LOGIC A SI NIC A V ol.26,N o.10Oct.,2006 污染土壤微生物群落结构多样性及 功能多样性测定方法 陈承利,廖　敏3 ,曾路生 (污染环境修复与生态健康教育部重点实验室,浙江大学环境与资源学院,杭州　310029)基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”资助项目(2002C B410804);国家自然科学基金资助项目(40201026) 收稿日期:2005206227;修订日期:2006205220 作者简介:陈承利(1982～),男,浙江平阳,硕士,主要从事土壤环境化学与环境生态毒理学研究.E 2mail :clchen1982@1631com 3通讯作者C orresponding author.E -mail :liaom in @https://www.wendangku.net/doc/53885358.html, or liaom inzju1@1631com Found ation item :The project was supported by National K ey Basic Research Support F oundation of China (N o.2002C B410804)and National Natural Science F oundation of China (N o.40201026) R eceived d ate :2005206227;Accepted d ate :2006205220 Biography :CHE N Cheng 2Li ,M aster ,mainly engaged in s oil environmental chem istry and ecotoxicology.E 2mail :clchen1982@1631com 摘要:土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用,土壤微生物群落结构和组成的多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量。为了更好地了解土壤健康状况,非常有必要发展有效的方法来研究污染土壤微生物的多样性、分布以及行为等。回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法,包括生物化学技术和分子生物学技术,现将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述,同时指出结合这两种技术可为微生物群落分析提供一个更全面的、精确的方法。 关键词:污染土壤;微生物多样性;分子生物学;BI O LOG;P LFA ;PCR ;DNA 文章编号:100020933(2006)1023404209　中图分类号:Q143,Q938,S154　文献标识码:A Methods to measure the microbial community structure and functional diversity in polluted soils CHE N Cheng 2Li ,LI AO Min 3,ZE NG Lu 2Sheng (MOE K ey Laboratory ,Environmental Remediation and Ecosystem H ealth ,College o f Environmental and Resources Sciences ,Zhejiang Univer sity ,Hangzhou ,310029,China ).Acta Ecologica Sinica ,2006,26(10):3404～3412. Abstract :S oil m icroorganisms ,such as bacteria and fungi ,play im portant roles in prom oting soil quality and im proving plant health and nutrition ,thus in fluencing terrestrial ecosystems.Increasing anthropogenic activities ,such as spraw ling urbanization ,agricultural development ,pesticides utilization ,and pollutions from all sources ,can potentially affect soil m icrobial community com position and diversity ,leading to deterioration of soil quality and fertility.H owever ,it is yet to be determ ined how these changes in m icrobial diversity can in fluence surface and ground ecosystems.T o that end ,there is an acute need for reliable and accurate methods to study the community structure and tax onomy of soil m icroorganisms.W ithout the development of effective methods for studying the m icrobial diversity ,distribution ,and behavior in polluted soil ,a thorough understanding of m icrobial diversity ,as well as its im pact on soil health ,cannot be achieved. The determ ination of species diversity depends on several factors including the intensity of each species ,the total number of species present ,species evenness ,and the spatial distribution of species.M ethods to measure m icrobial community structure and functional diversity in polluted soils can be classified into tw o groups ,i.e.,biochem ical 2based techniques and m olecular biological 2based techniques.T ypically ,diversity studies include the relative com parisons of communities across a gradient of stress and disturbance.W ith current techniques ,it is difficult to study true diversity due to lack of know ledge on com position and the techniques to determ ine the accuracy of the extraction or detection methods.T raditionally ,the analysis of soil m icrobial

《土壤里的微生物》教学设计

《土壤里的微生物》教学设计（第1课时） 教材分析 “土壤里的微生物”是苏科版七年级下册第13章第2节的内容。是上一节课内容的基础上，让学生进一步认识到土壤里生物的多样性，以及它们对生物圈的平衡和稳定起着非常重要的作用，从而对本单元环境中生物的多样性具有全面的认识。同时为下一章引导学生对生物进行分类奠定基础。因此本节课的意义十分重要，是本章的重点和难点。 课标对本节的要求是“描述细菌的主要特征以及与人类生活的关系”。本节从单细胞细菌到多细胞的真菌、从肉眼看不见的细菌到大型真菌，带领学生走进丰富多彩的微生物世界。土壤中的微生物，学生平时不易见到，细菌需要用高倍显微镜才能更好地观察到形态，细菌的结构更难观察，而初中又不要求使用高倍显微镜，教材呈现了细菌的形态结构图片，所以只能通过图片、视频引导学生观察、比较认识细菌的基本特征。 学情分析 七年级学生通过小学科学课和上一学期生物课的学习，对生物学科有了初步的了解，具有一定的生物基础知识和学习经验，能够通过观察图片、阅读材料、对比分析、合作讨论等方式获取有关信息。但在学习上仍以感性认识为主，好奇心强、注意力容易转移,但他们活泼好动，喜欢直观形象的事物，喜欢动手实践。 有关微生物的相关知识在上学期在生态系统的组成学习过程中及学生日常生活经验中对微生物的类型和作用从总体上有了一个初步的了解，特别是在生活过程中家长或者教师从卫生角度常常提到细菌这个概念，学生对这一概念还是比较熟悉，对细菌与人类的关系也有不同程度的了解。但在生活中微生物是肉眼看不见的生物，只有用高倍或电子显微镜才能观察到，与人类的关系和对生物圈的作用又是隐性和潜在的，很少有机会引起学生的关注，容易被学生忽视和轻视，学生缺乏相应的感性知识和学习兴趣。对土壤中的微生物的类型、形态特征，生殖、营养方式、分布以及与人类生活的关系，学生比较陌生，这些是课程标准的明确要求，也是学生学习的终极目标。教材中只用文字表述，学生不容易理解，在教学中一是通过组织学生阅读教材在自主学习中从理论上了解细菌、放线菌的有关知识。二是通过播放有关细菌、放线菌形态、结构等视频资料及图片引导学生观察分析细菌和放线菌的形态、结构。三是利用小组合作学习并结合观察、对比的方法，引导学生主动获取知识。四是注重发掘生活资源，

土壤微生物群落多样性研究方法及进展_1

第27卷增刊V ol 127,Sup 1广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric 1and Biol 1Science 2008年6月June,2008 收稿日期:20080122。 基金项目:广西大学博士启动基金项目(X05119)。 作者简介:姚晓华(广西大学副教授,博士;E -mail:x hy ao@g xu 1edu 1cn 。文章编号:10083464(2008)增008405 土壤微生物群落多样性研究方法及进展 姚晓华 (广西大学农学院,广西南宁530005) 摘要:微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。研究 土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等) 和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DN A ,进行G+C%含量的分析,或杂交分析,或进 行PCR,产物再进行D GGE/T GG E 等分析)。现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面 地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。 关键词:微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;DN A 中图分类号:.Q 938115 文献标识码:A Advancement of methods in studying soil microbial diversity YAO Xiao -hua (Co llege of Ag ricultur e,G uangx i U niv ersit y,N anning 530005,China) Abstract:Species div ersity consist o f species richness,the total number of species,species ev enness,and the distribution of species 1Methods to measure microbial diversity in so il can be categ orized into tw o g roups:biochemica-l based techniques and m olecular -based techniques 1The fo rmer techniques include plate counts,sole carbon so urce utilizatio n patterns,fatty acid methy l ester analysis,and et al 1The latter techniques include G +C%,DNA reassociation,DNA -DNA hy br idization,DGGE/TGGC,and et al 1Ov er all,the best w ay to study soil microbial diversity w o uld be to use a variety of tests w ith differ ent endpoints and degr ees o f r esolutio n to o btain the bro adest picture possible and the most inform ation r eg ar ding the microbial co mmunity 1 Key words:microbial diversity;biochem ica-l based techniques,mo lecular -based techniques,DNA 微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。微生物在土壤中普遍存在,对环境条件的变化反应敏捷,它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1] 。但土壤微生物的种类庞大,使得有关微生物区系的分析工作十分耗时费力。因此,微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成,即通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响,揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的关系。利用分子生物学技术和研究策略,揭示自然界各种环境中(尤其是极端环境)微生物多样性的真实水平及其物种组成,是微生物生态学各项研究的基础和核心,是重新认识复杂的微生物世界的开端。

群落的结构优秀教案

第四章种群和群落 第3节群落的结构 授课人：授课时间: 授课地点： 一、教材分析 本节属于高中生物必修3第四章种群与群落中第三节，是之后要学习的群落演替以及生态系统的基础，因此，是本章的重点内容之一。 群落的结构在课程标准中相关的具体内容标准为“描述群落的结构特征”。该条内容标准属于了解水平，要求同学们能够对群落的结构进行简单的描述，能从生命系统的角度说出群落是具有一定的组成和结构。 二、学生分析 在前面的学习中，学生就已经掌握了种群的相关知识，这为本节的学习奠定了基础。但学生毕竟有着基础和其它方面非智力因素的差异，因此要进行因材施教。从疑问的设置，到问题的回答要适合不同层次的学生；从基础知识的掌握，再到能力的培养，包括探索创新能力，学习兴趣等，教师要对不同层次学生进行相应点拨。 三、教学目标 1、知识与能力 1).学生能识别群落，说出群落水平上研究的问题。 2)学生能分析群落的物种组成，并说明不同群落有不同物种组成的原因。 3)学生能举例说出一个群落中不同生物种群间的种间关系。 4)学生能说出群落的空间结构，理解群落的空间结构形成是生物适应环境的结果。 2、过程与方法 通过分析讨论让学生学会合作学习，培养分析归纳问题的能力。凭借概念对具体的生物学现象作出判断和推理，训练学生应用知识、解决问题的能力。 3、情感态度与价值观 通过对群落动态规律的研究，懂得合理开发利用生物资源、保护生态平衡的重要意义，从而进一步树立环保意识。 四、教学重点和难点 1、教学重点 1)群落的结构特征； 2)丰富度的概念； 3)生物种群内各物种之间的关系； 4)种群的空间特征及应用。 2、教学难点 1)生物种群内各物种之间的关系； 2)种群的空间特征及应用。 五、教学思路 在引入课题中，通过设问，引导分析池塘中的各种种群，从而引出群落的概念。在此基础上，进一步引导学生探究的欲望，通过剖析某池塘中的生物群落，引出群落水平上所研究的问题和群落结构

土壤中的微生物

1．土壤是微生物生长和栖息的良好基地 土壤具有绝大多数微生物生活所需的各种条件，是自然界微生物生长繁殖的良好基地：其原因在于土壤舍有丰富的动植物和微生物残体，可供微生物作为碳源、氮源和能源。土壤台有大量而全面的矿质元素，供微生物生命活动所需。土壤中的水分都可满足微生物对水分的需求。不论通气条件如何，都可适宜某些微生物类群的生长。通气条件好可为好氧性微生物创造生活条件；通气条件差，处于厌氧状态时又成了厌氧性微生物发育的理想环境。土壤中的通气状况变化时，生活其问的微生物各类群之间的相对数量也起变化。土壤的pH值范围。3．5～10．0之间，多数在5.5～8．5之间，而大多数微生物的适宜生长pH也在这一范围。即使在较酸或较碱性的土壤中．也有较耐酸、喜酸或较耐碱、喜碱的微生物发育繁殖，各得其所地生活着。土壤温度变化幅度小而缓慢．夏季比空气温度低，而冬季又比空气温度高，这一特性极有利于微生物的生长。土壤的温度范围恰是中温性和低温性微生物生长的适宜范围。 因此，土壤是微生物资源的巨大宝库。事实上，许多对人类有重大影响的微生物种大多是从土壤中分离获得的，如大多数产生抗生素的放线菌就是分离自土壤。 2．土壤中的微生物数量与分布 土壤中微生物的类群、数量与分布，由于土壤质地发育母质、发育历史、肥力、季节、作物种埴状况、土壤深度和层次等等不同而有很大差异。lg肥沃的菜园土中常可含有108个甚至更多的微生物，而在贫瘠土壤如生荒土中仅有103～107个微生物，甚至更低。土壤微生物中细菌最多，作用强度和影响最大，放线菌和真菌类次之，藻类和原生动物等数量较少，影响也小。 (1)细菌 土壤中细菌可占土壤微生物总量的70％～90％，其生物量可占土壤重量的 1/10000左右。但它们数量大，个体小，与土壤接触的表面积特别大，是土壤中最大的生命活动面，也是土壤中最活跃的生物因素．推动着土壤中的各种物质循环。细菌占土壤有机质的1％左右。土壤中的细菌大多为异养型细菌，少数为自养型细菌。土壤细菌有许多不同的生理类群，如固氮细菌、氨化细菌、纤维分解细菌、硝化细菌、反硝化细菌、硫酸盐还原细菌、产甲烷细菌等在土壤中都有存在。细茼在土壤中的分布方式一般是黏附于土壤团粒表面，形成菌落或菌团，也有一部分散布于土壤溶液中，且大多处于代谢活动活跃的营养体状态。但由于它们本身的特点和土壤状况不一样．其分布也很不一样。 细菌积极参与着有机物的分解、腐殖质的合成和各种矿质元素的转化； (2)放线菌 土壤中放线菌的数量仅次于细菌．它们以分枝丝状营养体缠绕于有机物或土粒表面，并伸是于土壤孔隙中。1g土壤中的放线菌孢子可达107～108个．占土壤微生物总数的5％～30%．在有机物含量丰富和偏碱性土壤中这个比例更高。

土壤微生物研究进展

哈尔滨师范大学 学年论文 题目植物与微生物关系研究进展 学生李春葳 指导教师王全伟副教授 年级 2009级 专业生物科学 系别生物科学系 学院生命科学与技术学院 哈尔滨师范大学 2012年5月

论文提要 植物与其生长环境中的微生物关系密切，两者形成了植物—微生物共生体系统。植物影响着其周围及体内的微生物的群落结构，这些微生物又通过其生命活动影响植物的生长发育。了解与认识植物与微生物的相互作用对于农业生产具有重要意义。本文就植物类型及植物根系分泌物对微生物群落结构及多样性的影响,植物根际微生物、叶围微生物和内生菌(包括内生真菌、内生细菌以及内生放线菌)对植物生长发育的影响等进行综述，并就其将来的研究方向做了展望。

植物与微生物关系研究进展 李春葳 摘要:植物与其生长环境中的微生物关系密切,两者形成了植物—微生物共生体系统。植物影响着其周围及体内的微生物的群落结构,这些微生物又通过其生命活动影响植物的生长发育。了解与认识植物与微生物的相互作用对于农业生产具有重要意义。本文就植物类型及植物根系分泌物对微生物群落及其多样性的影响,植物根际微生物、叶围微生物和内生菌(包括内生真菌、内生细菌以及内生放线菌)对植物生长发育的影响等进行综述,并就其将来的研究方向做了展望。 关键词:植物植物根际微生物内生菌叶围微生物 植物与微生物的相互作用主要包括植物与根际微生物的互作、植物与叶围微生物的互作、植物与内生菌的互作及植物对微生物多样性的影响等。植物与周围环境生物的相互作用在自然界中普遍存在,其中以植物与微生物的互作为重要形式之一。本文就植物类型及植物根系分泌物对微生物群落及其多样性的影响,植物根际微生物、叶围微生物和内生菌(包括内生真菌、内生细菌以及内生放线菌)对植物生长发育的影响等进行综述,并就其将来的研究方向做了展望。 １植物根际有益微生生物与植物的关系 植物根际有益微生物主要指对植物生长和健康具有促进作用的土壤微生物。这些微生物可以通过一些途径，促进植物定植、生长和发育[1、2]。根据根际有益微生物主要作用可以将其分为植物根际促生微生物PGPM（plant growth promoting micribiology）和生防微生物BCA（biological control agents）2大类。 1.1植物促生微生物 植物促生微生物主要包括根瘤菌（Rhizobium）、菌根菌等。固氮微生物（自生固氮菌、联合固氮菌和共生固氮菌）可以通过固定大气中的Ｎ 从而增加植物对氮素的吸收。ＷｕＦ ２ Ｂ发现，苗期海岛棉(Gossypium barbadense)接种自生固氮菌（Azotobacter sp.）、巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）、多糖芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）和根瘤菌后，其功能叶中氮、磷、叶绿素含量以及生物学产量均明显提高[3]。尽管固氮微生物在非豆科植物以外的其他植物根际所占比例很小（1％），但对某些植物来说其根际固氮微生物所固定的氮素对其生长来说仍是重要氮源[1]。有些植物根际促生微生物（主要是菌根真菌）可以通过影响植物根系形态及生理特征，如增加植物根系吸收面积、改变植物根系通透性从而影响植物对N、P、K的吸收[4]。陈洁敏等[5]研究表明，分别接种3种AMF（泡囊丛枝菌根真菌）的玉米（Zeamays）对氮和磷的吸收比未接种的玉米增加了41.14％～78.29％。一些植物根际促生微生物可以通过产生有机酸或酶一类的代谢产物作用于土壤中以螯合形式存在的营养元素，从而使其活化，特别是许多AM真菌对P直接进行活化，从而增加了土壤中植物可利用的P。也有研究表明，菌根可以增加植物对水分的吸收，从而提高植物的抗旱能力。

生活污水处理厂微生物群落结构解析

生活污水处理厂微生物群落结构解析 发表时间：2018-11-27T16:00:33.133Z 来源：《建筑学研究前沿》2018年第21期作者：安海金[导读] 其中共有19种优势微生物的丰度在1%以上，共有355中菌属的所占比例高于0.01%。通过试验结果可以分析得到A城的城市污水处理厂的水质中有比较丰富的微生物资源，这些微生物资源也为污水处理提供微生物基础。 安海金 山西华瑞鑫环保科技有限公司山西省太原市 030024摘要：本文的研究对象是A城的城市生活污水处理厂，研究方法为高通量测序技术，最终获得解析功能单元中微生物群体结构结果。通过高通量测序得出ACE指数为20653.4，Chaol指数为12145.8，Shannon指数为6.6，Simpson指数为0.005。其中共有19种优势微生物的丰度在1%以上，共有355中菌属的所占比例高于0.01%。通过试验结果可以分析得到A城的城市污水处理厂的水质中有比较丰富的微生物资源，这些微生物资源也为污水处理提供微生物基础。 关键词：生活污水；微生物群体；结构解析引言：随着工业经济的不断发展，国家越来越重视对工业污染的处理要求，污水处理也是一项重要内容。如果污水处理不达标，排放出不符合要求的污水，会直接对湖水、河水产生负面影响，比较常见的就是水体富营养化。在城市污水处理的过程中，脱氮除磷是重要内容，污水处理厂中存在大量的微生物菌属，了解其群落结构特征可以为脱氮除磷在理论上提供帮助，便于脱氮除磷工作在实际工作中的推 进。目前，城市污水处理厂使用的主要方法是氧化沟工艺，从微生物群体结构出发来解析的还比较少。本文以A城的污水处理厂为例，使用污水处理厂中的活性污泥作为研究对象，采用高通量测序技术从各级分类水平上分析污水处理厂中的微生物多样性以及其群落结构特征，希望能为氧化沟污水处理提供补充性的理论支持。 1材料与方法 1.1污水处理厂概况 A城污水处理厂位于市区东南河边，每天处理污水量达10—15吨。该污水处理厂的进水水质中TP（总磷）为2.7mg/L，氨氮为18.7mg/L，YN（总氮）为24.5mg/L，化学需氧量为242.8mg/L，升华需氧量为109.5mg/L。处理污水主要使用氧化沟，水力停留时间为十小时。 1.2高通量测序 该方法是指将氧化沟厌氧池中的活性泥污放入冰盒后带回实验室立即试验，借助试剂盒的帮助提取微生物基因组DNA，为了检测抽取基因的完整性，需要使用到1%的琼脂糖凝胶电泳，之后用试剂盒来检验基因组DNA的浓度。每个样品需重复三道工序，首先进行3分钟的95℃预变；之后是保持30s的95℃、55℃、72℃的循环，包含25个循环；最后是在72℃下保持5分钟。对PCR产物进行琼脂糖电泳并回收，使用Qubit2.0DNA检测产物的定量，再通过IlluminaMiseq测试平台对PCR产物做高通量测序。 1.3微生物群落结构分析 通过对所得序列的质量控制除去不合格的引物序列、短片段和低质量序列，对剩下的序列进行相似性分析，使用uclust软件划分操作分类单元。同时对所选序列进行物种分类，分为门、纲、目、科、属这几个基本单位，根据各单位内的序列数量进行统计分析，绘制物种有关图表。 2结果与讨论 2.1污水处理效果 试验时的污水温度处于25—35℃的区间内，笔者对该污水处理厂的进水浓度进行了累计频率分析，结果为该污水处理厂的出水水质是符合一级B类排放标准的。在该污水处理厂升级改良后，出水水质满足一级A类排放标准。 2.2污泥中微生物多样性分析 最初共获得了28560条有效序列，通过质量控制后分为4435个分类操作单元，即OUT。对有效序列进行的是α指数多样性分析，结果为ACE指数为20653.4，Chaol指数为12145.8，Shannon指数为6.6，Simpson指数为0.005。后续可根据OUT数目、ACE指数、Chaol指数等绘制丰富度稀疏图或Shannon指数图等，从数值中可以分析出序列数量是接近饱和的，这也表明了污泥中有较多的微生物物种，并且其丰度与多样性都很高。 3微生物群落结构解析 3.1门水平群落结构分析 试验结果表明大部分的细菌为变形菌门和浮霉菌门这两类，这两类细菌也是比例超过了20%比例的细菌。变形菌门细菌都是革兰氏阴性菌，有学者指出变形菌门有利于污水中有机物的祛除。浮霉菌门对去除水体中的氨氮和亚硝酸盐氮也有很大的作用，它主要存在于淡水水体、海洋沉积物、污水处理系统、土壤等厌氧环境中。其他占比比较大的细菌还有酸杆菌门、衣原体门、放线菌门、厚壁菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门，这些细菌都可以处理污水中的有机物，具有相似的作用。 3.2纲水平群落结构分析 在纲水平下，浮霉菌纲是最主要的，比例达23%左右，其他比较重要的有γ-变形菌纲、α-变形菌纲、β-变形菌纲等，加起来的比例在25%左右。α-变形菌纲是一种自养微生物，可以在硝化过程中发挥作用；γ-变形菌纲与β-变形菌纲具有相同点，都为兼性异氧菌，参与COD 的降解过程，在污水处理中发挥重要作用。 3.3目水平群落结构分析 目水平下的细菌种类较多，比例最高的是浮霉菌目，比例在20%以上，明显高于其他目。变形菌门比例也不低，但种类很多，包括根瘤菌目、红螺菌目、假单胞菌目、黄色单胞菌目、军团菌目、交替单胞菌目、脱硫弧菌目、伯克氏菌目、交替单胞菌目等。衣原体目的比例也比较多，同样包括很多种类，比如鞘脂杆菌目和暖绳菌目等。 3.4科水平群落结构分析

土壤里的微生物

第2节土壤里的微生物 一、教学目标： 1．知识目标： （1）概述土壤里主要的微生物种类。 （2）说出细菌的三种形态和基本结构，并与植物细胞和动物细胞比较细胞结构的异同点。 （3）说出放线菌的结构特点。 （4）识别青霉和匍枝根霉，并说出它们的繁殖方式和营养方式。 2．能力目标： （1）学会培养和观察青霉、匍枝根霉。 （2）探究土壤里的微生物。 3．情感态度与价值观目标： 体验培养霉菌的过程，并交流成功或失败的感受。 二、教学重点和教学难点： 教学重点：细菌、放线菌和真菌（青霉和匍枝根霉）的主要特征。 教学难点：细菌与植物细胞、动物细胞比较细胞结构的异同点。 三、教学方法：观察、讨论、比较等 四、教学过程： 引言：土壤里除了生活着一些小动物外，还有一些我们肉眼看不见或看不清的小生物，我们通常把这些小生物叫做微生物。那么土壤里都有哪些微生物呢？（学生讨论，教师小结。） 土壤里微生物主要有细菌、真菌、放线菌等，它们能分解植物的枯枝烂叶，动物的遗骸等，将土壤中的有机物分解成无机物，增加了土壤的肥力。 这些微生物到底是什么形态？它们有那些特征呢？这节课就让我们一起来认识它们。 一、认识细菌： 1．细菌的分布范围： 细菌在生物圈中数量最多，占土壤微生物总量的70%～90%，你认为在生物圈中哪些地方会分布有细菌？ 学生：土壤、水里、空气，人、动物、植物体内、体表等。

教师：由此可见，细菌的分布非常广泛。 2．形态特征： （1）大小： 资料：细菌的直径一般只有1um左右，电子显微镜才能观察到细菌的形态和结构。 学生阅读资料，发现细菌个体十分微小。 （2）形状： 教师：展示图片：三种细菌 人们在电子显微镜下观察到细菌，请根据图片描述细菌有哪三种形态。 学生：球形、杆形、螺旋形。 教师：根据它们的形态，我们可以分别称它们为：球菌、杆菌、螺旋菌。3．结构特征： 不同种类的细菌虽然形态不同，但它们的基本结构却是相同的。 学生看图12-5：细菌细胞的结构示意图。观察讨论： 细菌有哪些结构？细菌的结构与动植物细胞的结构有何异同？ 4．生活方式：

环境微生物群落多样性分析

环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面，对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量测序技术（尤其是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微生物群落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传染病病原微生物。 研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包括:DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片等。DGGE等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不