人上皮型钙黏蛋白ECad酶联免疫分析ELISA

人上皮型钙黏蛋白(E-Cad)酶联免疫分析(ELISA)

试剂盒使用说明书96t

目的:

本试剂盒用于测定人血清,血浆及相关液体样本中人上皮型钙黏蛋白(E-Cad)的含量。

检测范围:

5.0ng/L -100ng/L

实验原理:

本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中人上皮型钙黏蛋白(E-Cad)水平。用纯化的抗原包被微孔板,制成固相抗原,往包被抗原的微孔中依次加入人上皮型钙黏蛋白(E-Cad),再与HRP 标记的抗原结合,形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人上皮型钙黏蛋白(E-Cad)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),通过标准曲线计算样品中人上皮型钙黏蛋白(E-Cad)浓度。

试剂盒组成:

Reagent Quantity

酶标包被板12well×8strips

标准品: 480pg/mL1×0.5ml

标准品稀释液1×1.5ml

酶标试剂1×6ml

样品稀释液1×6ml

显色剂A液1×6ml

显色剂B液1×6ml

终止液1×6ml

30倍浓缩洗涤液1×20ml×30flod

说明书 1

封板膜 2

密封袋 1

样本处理及要求:

1. 血清:室温血液自然凝固10-20 分钟,离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。

2. 血浆:应根据标本的要求选择EDTA 或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20 分钟后,离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。

3. 尿液:用无菌管收集,离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4. 细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100 万/ml 左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。

5. 组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保

存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20 分钟左右(2000-3000 转/分)。仔细收集上清。分

装后一份待检测,其余冷冻备用。

6. 标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能

马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.

7. 不能检测含NaN3 的样品,因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

操作步骤:

1.标准品:其浓度为1,00pg/mL(贮液)。先将其稀释为100pg/mL(标准曲线最高浓度)后,再准备5个稀释标准品的EP 管,每个EP 管中加入150μL 的标准品稀释液,如图所示依次倍比稀释成100pg/mL, 50pg/mL,25pg/mL, 1

2.5pg/mL, 6.25pg/mL,

3.12pg/mL,,标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液Tube 0 1 2 3 4 5

pg/mL 1.00 50 25 12.5 6.25 3.12

2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为 5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。

3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。

4. 配液:将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用。

5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。

6. 加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。

7. 温育:操作同3。

8. 洗涤:操作同5。

9. 显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15 分钟.

10. 终止:每孔加终止液50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。

11. 测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。

注意事项:

1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。

2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。

3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间

最好控制在 5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。

4.请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD 值大于标准品孔第一孔的OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n 倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。

5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

6.底物请避光保存。

7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

9.本试剂不同批号组分不得混用。

人上皮型钙黏蛋白ECad酶联免疫分析ELISA

计算:

以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,

在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD

值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释

倍数;或用标准物的浓度与OD 值计算出标

准曲线的直线回归方程式,将样品的OD 值

代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释

倍数,即为样品的实际浓度。

(此图仅供参考)

试剂盒性能:

1.样品线性回归与预期浓度相关系数R 值为0.990 以上。

2.批内与批见应分别小于9%和11%

3.保存条件及有效期:

a.试剂盒保存:2-8℃。

b.有效期:6 个月

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