PKCζ降低表达削弱了乳腺癌细胞的趋化运动和黏附能力
乳腺癌细胞的趋化运动和黏附能力1
万五洲，张宁
北京大学化学与分子工程学院化学生物学系，北京(100871)
E-mail: nzhangchina@https://www.wendangku.net/doc/5d6317992.html,
摘要：目的研究蛋白激酶 C ζ (PKCζ) 降低表达对乳腺癌细胞趋化运动和黏附能力的影响。方法利用RNA干扰技术特异性降低PKCζ蛋白在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达，通过滤膜小室法 (Mircro-Boyden Chamber) 检测细胞的趋化运动能力，通过细胞黏附实验检测细胞的黏附能力。结果 RNA干扰有效的降低了乳腺癌MDA-MB-231细胞中PKCζ蛋白的表达。在表皮生长因子受体 (EGFR) 诱导下，与参照细胞相比，PKCζ降低表达后的细胞趋化运动能力和黏附能力都显著下降。结论 PKCζ降低表达削弱了乳腺癌细胞的趋化运动能力和黏附能力。
关键词：蛋白激酶C ζ，表皮生长因子受体，乳腺癌，趋化运动，黏附
中图分类号：R737
1.引言
PKCζ是蛋白激酶C (PKC) 家族的成员之一，属于非典型性PKC；与经典型PKC和新型PKC不同，PKCζ的激活不依赖于钙离子 (Ca2+) 或二酯酰甘油 (DAG)[1]。研究表明，PKCζ在细胞的凋亡、极化及黏附过程中都发挥着重要作用：在人Caco-2细胞中，PKCζ可以抑制胶原蛋白依赖性及不依赖性的细胞增殖，促进细胞凋亡[2]；在星形胶质细胞的迁移过程中，PKCζ与Par6/Cdc42 形成了复合物，共同控制细胞的极化[3,4]；在嗜中性粒细胞的运动过程中，PKCζ可能还参与了Gi 蛋白所诱导的细胞黏附和肌动蛋白聚集过程[5]。许多肿瘤细胞，如乳腺癌、肺癌、胃癌等的恶性转化都和细胞内 PKC 的表达水平升高或突变有关，但是对于PKC在癌细胞运动过程中的作用目前还研究较少[6]。本文以乳腺癌MDA-MB-231细胞为模型，探讨了PKCζ降低表达对乳腺癌细胞趋化运动能力和黏附能力的影响。
2.材料和方法
2.1 MDA-MB-231细胞的培养和传代
人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞购自美国细胞菌种库 (American Type Culture Collection, ATCC) (Manassas, VA, USA)，来源是人乳腺器官，属于上皮细胞腺癌。该细胞的表皮生长因子受体 (EGFR) 表达呈阳性，是研究 EGFR 诱导癌细胞转移的理想模型。细胞培养采用加了 Penicillin-Streptomycin 和10% FCS 的RPMI1640完全培养基，在37 oC、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。待细胞融合后用0.1%胰酶/EDTA 消化传代。
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1本课题得到高等学校博士学科点专向科研基金（20040001019）资助。
PKCζ siRNA 质粒是利用 pRNAT-U6.1/Hygro 作为表达载体，正义链(5'→3'): GGAAGUGAGAGACAUGUGUTT；反义链 (5'→3'): ACACAUGUCUCUCACUUCCTC。该序列是针对基因上的特异靶点所设计，一段和 siRNA 同样长度的随机序列被插入此载体作为参照。这些质粒均直接购自GenScript 公司 (Piscatwaway, NJ, USA)，载体可以同时表达绿色荧光蛋白，作为细胞筛选的标记。
2.3 细胞转染以及单克隆细胞系的建立
利用转染试剂Lipofectamine TM 2000 转染siRNA进入乳腺癌细胞：1）转染前一天，在不包含抗生素的适量RPMI1640完全培养基中接种细胞，转染时细胞的汇合度要达到80-90％；转染前两小时，换成无血清无双抗的RPMI1640培养基。2）准备质粒siRNA - Lipofectamine? 2000复合物：a. 在适量的无血清RPMI1640培养基稀释质粒siRNA，轻轻混匀；b. 使用前轻轻混合Lipofectamine? 2000，然后稀释适量的试剂到无血清RPMI1640培养基，轻轻混匀后在室温下孵育5分钟；c. 孵育5分钟后，混合稀释质粒siRNA和稀释的Lipofectamine? 2000，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，以便允许复合物的形成。3）将质粒siRNA - LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中，通过轻轻地前后摇动培养板混合。4） 37 oC，5% CO2 培养箱孵育24-96小时，直到适合进行基因阻断分析。
对于稳定转染，24小时后细胞用抗生素 Hygromycin B (0.8 mg/ml) 筛选一周，细胞重新生长之后利用高速流式细胞分选仪 (FACS) 将表达绿色荧光的单个细胞分选到96孔板中。然后利用 Western blotting 检测每个孔细胞里目标蛋白的表达情况，找到目的克隆后将其进一步扩增为稳定的细胞系。
2.4 细胞趋化运动分析
细胞的趋化运动运动能力是通过滤膜小室法 (Micro-Boyden Chamber) 来检测的，通常用48孔的趋化小室进行实验。该小室分为两层，上层小室加所研究的细胞，下层小室加不同浓度的趋化因子 (如 EGF)，用10μm 滤膜分隔上下小室。滤膜在使用之前用10μg/ml 纤维连接蛋白 (fibronectin) 4 oC过夜包被以增强细胞对其黏附性。实验过程中，用特定培养基(RPMI 1640, 0.1% BSA, 25 mM HEPES) 将细胞重悬至 5 × 105/ml 加入上层小室。待小室在37 oC、5% CO2 孵箱中孵育3小时后取出趋化膜，去除膜上层非特异趋化的细胞。然后将膜固定、染色，在倒置显微镜下计数 (400 × 视野)。每孔计3个视野的平均数作为该孔的趋化细胞数。样品孔的趋化细胞数，与对照孔的细胞数的比率即为趋化指数。结果用3个孔的平均趋化指数±标准差 (Mean ± SD) 表示。每个实验至少重复 3 次。
2.5 细胞黏附性分析
将对照细胞和特定蛋白降表达的细胞重悬于RPMI1640完全培养基中 (4 × 105/ml)，在
孵箱中孵育20min，然后把每种细胞分为两组。第一组细胞悬液直接滴到
2
预先包被了纤维连接蛋白 (fibronectin) 的盖玻片中央，37 °C分别孵育5min或15min。然后
用冷的PBS终止，并简单洗涤两次，用4% PFA固定。另一组细胞悬液在滴到玻片之前加入
终浓度为10 ng/ml的EGF，然后按第一组的步骤进行。最后在显微镜下计数 (200 × 视野) ，
每个玻片随机计5个视野，结果用5个视野的平均数±标准差 (Mean ± SD) 表示。每个实
验至少重复3次。
2.6 统计分析
所有数据的显著性差异统计分析均使用PRIZM 4 软件的二阶ANOVA (Analysis of Variance，方差分析) 进行。
3.结果
3.1 RNA干扰技术降低PKCζ蛋白在乳腺癌细胞中的表达
为了研究PKCζ在EGFR 所诱导乳腺癌细胞趋化运动中的作用，我们利用RNA干扰
技术降低了PKCζ蛋白在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达，得到了PKCζ表达降低的稳
定MDA-MB-231 细胞系。Western Blotting 分析的结果表明，参照细胞 (Control) 中PKCζ
的蛋白表达水平与MDA-MB-231 细胞相似，而经过筛选得到的稳定细胞系 (siPKCζ/MDA) 中PKCζ的蛋白表达水平则显著降低 (图1)。
图1. 在MDA-MB-231 细胞中降低PKCζ蛋白的表达。Western Blotting 检测 MDA-MB-231 细胞、参照细胞 (Control) 和PKCζ降低表达的 siPKCζ/MDA细胞中PKCζ蛋白的表达水平。3.2 PKCζ降低表达之后乳腺癌细胞的趋化运动能力减弱
趋化运动分析结果表明，EGF能够以剂量依赖的方式诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞
的趋化运动，10 ng/ml 的EGF诱导细胞趋化运动的趋化指数达到12左右。参照细胞(Control) 表现出了和MDA-MB-231细胞相似的趋化运动能力，证明siRNA的转染载体本
身并不影响乳腺癌细胞的趋化运动性。但是在MDA-MB-231细胞里降低PKCζ表达之后，
细胞的趋化运动能力被严重削弱，表皮生长因子(EGF) 所诱导siPKCζ/MDA细胞的趋化运
动能力降低了70-80% (图2)。这说明PKCζ在EGF 所诱导的乳腺癌细胞趋化运动中起着非
常重要的作用，而且其功能是特异性的。
图2. PKCζ降低表达抑制了MDA-MB-231细胞的趋化运动。MDA-MB-231细胞、参照细胞(Control) 、PKCζ降低表达的siPKCζ/MDA细胞趋化运动能力对比。
3.3 PKCζ降低表达之后乳腺癌细胞的黏附能力降低
黏附性在细胞的迁移过程中起着非常关键的作用， EGF (10 ng/ml) 刺激使参照细胞(Control) 的黏附性在5分钟内增强了4倍，刺激 15 分钟可以使细胞的黏附性进一步增强。
但是PKCζ表达降低后，EGF 所诱导的细胞黏附性却显著降低，特别是在5分钟这一时间点，与参照细胞相比其黏附性降低了约80% ( 图3)。在EGF 刺激 15分钟时，参照细胞(Control) 和PKCζ表达降低细胞之间的黏附性区别不如5分钟时显著，这可能是由于时间
延长细胞在载玻片上表现出了沉积效应。
图3. PKCζ降低表达削弱了MDA-MB-231细胞的黏附能力。参照细胞 (Control) 、PKCζ降低表达的siPKCζ/MDA细胞细胞在没有EGF 或EGF刺激5、15 分钟前后黏附能力变化对比。
我们的研究表明，PKCζ参与了表皮生长因子受体 (EGFR) 所诱导的乳腺癌细胞趋化运动过程，并影响了细胞的运动能力和黏附性。曾有人提出在EGFR所诱导的乳腺癌细胞趋化运动中发挥作用的是经典型PKCα或新型PKCε[7,8]，但是我们之前的实验结果表明，抑制经典型和新型PKC的活性对EGFR所诱导的乳腺癌细胞趋化运动并没有影响，说明此过程起作用的是非典型PKC [9]。利用PKCζ亚型特异性的假底物短肽抑制PKCζ亚型的活性后，EGFR所诱导的乳腺癌细胞趋化运动被完全抑制，提示是 PKCζ参与了乳腺癌细胞趋化运动的信号传递[9]。此处我们利用RNA干扰技术降低乳腺癌MDA-MB-231细胞中PKCζ蛋白的表达之后，发现表皮生长因子受体 (EGFR) 所诱导的乳腺癌细胞趋化运动能力和黏附性被严重削弱，这进一步证明了PKCζ在此过程中的特异性。曾有研究表明，PKCζ的特异抑制剂能阻止趋化因子所诱导的嗜中性细胞黏附及肌动蛋白聚集，并且PKCζ可能参与调节了integrin β1 的活化[10]。这和我们的实验结果是一致的，并且部分解释了PKCζ降低表达之后细胞黏附能力降低的原因。
我们发现抑制PKCζ的活性还可以削弱G蛋白偶联的受体(GPCR) 所诱导的乳腺癌细胞趋化运动能力(未发表)，这提示PKCζ可能是表皮生长因子受体(EGFR) 和G蛋白偶联的受体(GPCR) 两条信号通路共用的信号分子。很多癌细胞的表面都过量表达表皮生长因子受体(EGFR) 和G蛋白偶联的受体(GPCR)，这些细胞在生长因子和趋化因子的诱导下会向着分泌因子的器官或组织发生迁移[11]。癌细胞的转移与趋化运动的密切关系已被众多研究所证实，如果能够抑制细胞的趋化运动，将能够有效的抑制肿瘤的转移[12,13]。例如，乳腺癌细胞向肺、淋巴结、骨髓、和肝的转移均是由于细胞的表面过量表达了趋化因子受体CXCR4 (GPCR家族的成员之一) 所导致的，如果用抗特异抗体阻断CXCR4的功能，则能够抑制肿瘤向正常组织的转移和生长[14]。表皮生长因子受体 (EGFR) 与多种恶性肿瘤的发生、发展及预后等有密切的关系，参与了一系列的癌症发展过程，包括促进细胞增殖、细胞迁移、新生血管形成和抗凋亡等[15,16]。但是研究表明，单纯阻断表皮生长因子受体(EGFR) 或G蛋白偶联的受体(GPCR) 信号通路均不能完全的抑制癌细胞的转移，这提示两条信号通路可能在同时发挥作用或者存在其他的信号通路[17,18]。鉴于PKCζ为两条信号通路所共享，以PKCζ作为靶点设计抗癌药物将不仅能够有效抑制表皮生长因子受体(EGFR) 所诱导的乳腺癌细胞的转移，还能够抑制由G蛋白偶联的受体(GPCR) 所诱导的乳腺癌细胞的转移，在此基础上经过筛选将能发展出有效的治疗乳腺癌的药物。
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Reduction of PKCζ expression inhibits chemotaxis and adhesion of human breast cancer cells
Wan Wuzhou, Zhang Ning
Beijing National Laboratory for Molecular Sciences, Department of Chemical Biology, and State Key Laboratory of Molecular Dynamic and Stable Structure,
College of Chemistry, Peking University, Beijing, 100871
Abstract
Objective The effect of PKCζ knockdown on the chemotaxis and adhesion ability of human breast cancer cells was investigated. Methods RNA interference was used to reduce the expression of PKCζin human breast cancer MDA-MB-231 cells. The chemotaxis and adhesion ability of the cells were detected by Micro-Boyden Chamber assay and cell adhesion assay. Results The expression of PKCζprotein in MDA-MB-231 cells was effectively down-regulated by RNA interference. Both EGFR-induced cell chemotaxis and adhesion ability were inhibited. Conclusion Reduction of PKCζexpression impaired the chemotaxis and adhesion ability of human breast cancer cells.
Keywords: PKCζ; EGFR; breast cancer; chemotaxis, adhesion
如何看懂乳腺癌常见免疫组化指标
如何看懂乳腺癌常见免疫组化指标乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，它的发病常与遗传有关，以及40-60岁之间、绝经期前后的妇女发病率较高。仅约1-2%的乳腺患者是男性。通常发生在乳房腺上皮组织的恶性肿瘤。是一种严重影响妇女身心健康甚至危及生命的最常见的恶性肿瘤之一。治疗乳腺癌主要有手术、化学药物治疗、放射治疗和现代中药治疗等手段，临床必须根据病期早晚，选择不同方法联合应用，选择合理时，比单一方法疗效好。 乳腺癌为激素依赖性肿瘤，就是说乳腺癌细胞的生长依赖雌激素和孕激素的刺激，雌孕激素通过与乳腺癌细胞上相应受体结合发挥作用，免疫组化表现为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）阳性。PR 的形成直接受ER的控制和调节，故PR阳性的乳腺癌，ER大多为阳性。但有些细胞在癌变过程中，其受体系统保留很少或完全丧失，不能再作为激素的靶细胞，其生长不再受激素的控制与调节，表现为ER阴性乳腺癌。 乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）临床上可以通过对雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的检测，得出肿瘤细胞内激素受体含量的水平，从而提示乳腺癌的预后信息和指导内分泌治疗。据报道高分化肿瘤或临床分期较低的肿瘤ER、PR更可能阳性；乳腺癌ER阳性率约为50%～80%,PR阳性率约为50%。ER及PR阳性肿瘤对内分泌治疗反应性高，有效率达55％～60％，受体阴性者有效率5％～8％。ER和(或)PR阳性患者较ER和(或)PR阴性患者有较好的预后。
乳腺癌常见免疫组化指标：雌激素调节蛋白PS2 雌激素调节蛋白PS2是由激素依赖细胞分泌的，可以通过自分泌和旁分泌起作用，是预测乳腺癌预后和内分泌治疗疗效的另一项重要指标。通常ER阳性乳腺癌细胞，PS2也呈现高水平表达。PS2在乳腺癌表达的阳性率在43%～58%之间。PS2与ER表达的正相关性，在绝经前的妇女(50岁以下)表现更为明显。PS2(+)ER(+)病例大约占83%，很少ER(-)和PR(-)，而PS2(+)(约4%)。作为乳腺癌抗雌激素治疗预测指标，PS2可能优于ER、PR，若三者结合则可达到满意的预测效果。 乳腺癌常见免疫组化指标：预后指标PS2 PS2作为预后指标，对无淋巴结转移者的意义尤为重要。No(无淋巴结转移)的乳腺癌患者，在采取单纯手术治疗的情况下,约20%～30%的患者会复发。有研究发现，PS2阳性与阴性两组在N0患者复发率相差31%,死亡率相差13%。因此PS2成为确定N0组患者属于危险组或非危险组的参考指标之一。PS2检测对淋巴结阳性(N+)患者也同样可分成危险组和非危险组,两组预后差别非常明显。乳腺癌ER(-)、PR(-)、PS2(-)的患者预后差,治疗失败率为83%,5年存活率仅为41%。 乳腺癌常见免疫组化指标：标记细胞增殖状态的抗原Ki67 Ki67是一种标记细胞增殖状态的抗原，其功能与有丝分裂密切相关，在细胞增殖中是不可少的，阳性说明癌细胞增殖活跃。Ki67的监测多用于判断肿瘤的良、恶性及恶性程度，也用于探讨细胞增殖活性、细胞周期与肿瘤的生长方式、浸润方式、复发、转移等生物学行为及预后的关系。 乳腺癌常见免疫组化指标：细胞周期蛋白(CyclinD1)
乳腺癌细胞
形态生长方式类型培养条件 人乳腺癌细胞MCF7 上皮样贴壁生长常规该细胞是从一名69岁的白人女性 乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立的。该细胞保留了多个分化乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成隆突结构( domes );该细胞表达WNT7B 癌基因；TNF- a可以抑制MCF-7细胞的生长；抗雌激素处理能调节细胞胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)的分泌。ER(+),PR(+),Her-2(-) 人乳腺癌细胞MDA-MB-231 上皮样贴壁生长三阴MDA-MB-231是从一名 51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7B癌基因。属于高转移性恶性乳腺癌细胞系，易成瘤，且常用 于肿瘤转移研究 人乳腺导管癌细胞MDA-MB-435S 上皮样贴壁生长三阴，转移性乳腺导管腺 癌MDA-MB-435S 是一种纺锤形的细胞，1976年由其亲本(MDA-MB-435)中筛选得到。MDA-MB-435是从一名31岁的转移性乳腺导管腺癌女性患者胸水中分离得到的。但近来证明MDA-MB-435细胞被M14黑色素瘤细胞污染。 人乳腺癌细胞MDA-MB-453 上皮样；多角形贴壁生长三阴，转移性乳腺癌 该细胞系由Cailleau R在1976年从一名48岁的患有转移性乳腺癌的白人女性的心包渗出液中分离建立的。该细胞表达FGF的受体。 人乳腺癌细胞MDA-MB-157 上皮样贴壁生长髓样癌该细胞源自一位患有 乳腺髓样癌的44岁黑人女性，表达WNT7B癌基因，细胞与细胞边界处有细胞桥粒、微绒毛、张力细丝。 人乳腺癌细胞SK-BR-3 上皮样贴壁生长这株细胞是1970年由Trempe G和 Old LJ从一位43岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离得到的。该细胞亚显微结构特征包括微丝和桥粒、肝糖原颗粒、大溶酶体、成束的细胞质纤丝；过表达 ______________ HER2/c-erb-2 基因产物。 人乳腺导管癌细胞ZR-75-1 上皮样贴壁生长该细胞产生高水平的黏液素 MUC-1 mRNA，低水平的MUC-2 mRNA，但不表达MUC-3基因；表达雌激素受体。 人乳腺导管癌细胞HCC38 上皮样贴壁生长该细胞于1992年从一位50岁的白 人女性乳腺导管癌组织中分离建立，该患者曾有平滑肌肉瘤的病史，其母亲死于乳腺 癌；该细胞癌基因her2/neu- , p53+ ;上皮细胞特异性标志物EGP2 (上皮糖蛋白2) 和CK19
乳腺癌细胞培养
MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞
细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代；每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基 +5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37℃ 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA溶液，消化5-10min 传代的比例：1：2~1：4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO
逍遥散提取液对乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响
逍遥散提取液对乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响 张 虹 季有波 1 （长春医学高等专科学校，吉林长春130031） 〔关键词〕逍遥散；乳腺癌；细胞周期〔中图分类号〕R737.9 〔文献标识码〕A 〔文章编号〕1005-9202（2012）24-5611-02；doi ：10.3969/j.issn.1005- 9202.2012.24.1381 吉林大学第二医院 通讯作者：季有波（1976-），男，主治医师，讲师，主要从事慢性疼痛性疾 病研究。 第一作者：张 虹（1977-），女，讲师，硕士，主要从事方剂学研究。 中医认为乳腺癌或癌前病变属于“乳岩”、“乳癖”范畴，乃由情志不畅、肝郁气滞、血瘀、脾气消沮等所致。而逍遥散行气疏肝，调畅神志，具有抗焦虑、抗抑郁作用，从而影响癌症的发生发展 〔1〕 。本课题组在前期研究中证实了逍遥散提取液对乳 腺癌细胞MCF-7有显著的生长抑制作用〔2〕 。本实验进一步探 讨逍遥散提取液对细胞周期的影响，为古方新用及乳腺癌的防 治进一步提供实验依据。 1材料与试剂1.1试剂DMEM 培养基（Invitrogen ）、RNase 、PI 购自Sigma 公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所。1.2 药物 逍遥散的药物组成及用量为：柴胡、当归、白术、茯 苓、 芍药各30g ，炙甘草15g ，煨姜、薄荷各1g ，购自市售药店，并经过严格鉴定。按上述组方和单品药当归取生药，加蒸馏水回流提取3次， 每次分别为60、30、30min ，浓缩药液，再加入DMEM 培养液稀释，配成浓度为1g /ml 药液，过滤除菌，4?保存备用。1.3 细胞培养 人乳腺癌细胞系（MCF-7）购自吉林省肿瘤研究所，置于含10%胎牛血清的DMEM 培养基中，在37?、5%CO 2空气及饱和湿度条件下培养。以每5?104 细胞/瓶接种，24h 换液1次并加入相应浓度的逍遥散提取液。1.4 FCM 检测细胞检测细胞周期 取对数生长期细胞用于 实验，随机分5组：对照组、逍遥散提取液低剂量组（2mg /ml ）、中剂量组（5mg /ml ）、高剂量组（10mg /ml ）、当归组（5mg /ml ）。 按照常规方法用PI 染色，流式细胞仪检测细胞周期 〔3〕 。 经低、中、高剂量的逍遥散提取液和当归分别作用48h ，收集MCF-7细胞，用PBS 冲洗两次， 70%冷乙醇固定过夜。PBS 冲洗2次，加RNase ，37?水浴30min 降解RNA ；再用PBS 洗2次后，加PI 染液，4?避光反应30min ，经PBS 洗涤后上机检测。用FACScan 流式细胞仪Cellfit 软件收取细胞测定DNA 含量的 变化，每个样品收集细胞数为1?104 个。 1.5统计学分析所有数据均采用SAS 统计软件进行检测， 数据用x ?s 表示，两组间比较采用t 检验。2 结 果 经流式细胞仪检测，不同剂量的逍遥散提取液和当归提取液对乳腺癌细胞MCF-7作用48h 后，各周期细胞比例见表1。 表1 逍遥散提取液对乳腺癌细胞MCF-7细胞周期的影响（x ?s ， %）组别G 0/G 1 S G 2/M 逍遥散低剂量组 63.813?0.78335.828?0.9551）0.480?0.1231）中剂量组55.615?1.4532）28.258?3.7201）0.207?0.1001）高剂量组54.463?2.6962） 25.430?4.2461）0.190?0.1471）对照组64.763?2.20236.238?1.1100.597?0.076当归组 68.250?3.990 31.500?4.210 0.250?0.250 与对照组比较：1）P ＜0.05， 2）P ＜0.013讨论 细胞周期是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期（M 期）两个阶段。分裂间期是物质准备和积累阶段，分裂期则是细胞增殖的实施过程。间期又分为休眠期（G 0期）、 DNA 合成前期（G 1期）、DNA 合成期（S 期）与DNA 合成后期（G 2期），在此期间主要完成染色质中的DNA 复制和相关蛋白质的合成。M 期为细胞分裂期， 在此期间进行细胞物质的平均分配，一个细胞经过分裂形成两个新的细胞。 在细胞周期中，S 期是细胞增殖的关键，其最主要的特征是
【CN109694853A】一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法【专利】
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910151712.6 (22)申请日 2019.02.28 (71)申请人 贵州省人民医院 地址 550002 贵州省贵阳市南明区中山东 路83号 (72)发明人 侯净 倪青 魏娜 贾琦 刘欣 胡诗航 (74)专利代理机构 北京栈桥知识产权代理事务 所(普通合伙) 11670 代理人 潘卫锋 (51)Int.Cl. C12N 5/09(2010.01) C12N 15/85(2006.01) (54)发明名称 一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构 建方法 (57)摘要 本发明公开了一种HER2基因过表达的乳腺 癌细胞系的构建方法，包括以下步骤：S1：对乳腺 癌细胞进行培养；S2：通过对乳腺癌细胞PCR扩 增，建立表达系统；S3：对乳腺癌细胞系进行构 建，S4：进行细胞观察和荧光强度对比。本发明通 过实时荧光定量PCR检测HER2基因在mRNA中的表 达情况，以证明细胞系构建成功。本发明构建的 乳腺癌细胞系可以稳定表达HER2基因，具有整合 效率高，假阳性率低等优点，为进一步研究HER2 基因乳腺癌发生、发展、治疗及后续耐药过程中 提供基本且有力的研究工具。权利要求书2页 说明书7页CN 109694853 A 2019.04.30 C N 109694853 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109694853 A 1.一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： S1：将新鲜的乳腺癌细胞在含有10％FBS的液体培养基中，在温度为30-35℃条件下培养1-2h,然后用FBS充分洗涤后，置于转动频率为50-80r/min、温度为20℃的恒温摇床上进行悬浮细胞培养，对培养后的细胞通过灭菌处理，再100目过滤，进行转接培养3-5次，再在水浴温度为30℃、通气量为5-10m3/h的条件下震荡处理2-4h，得到乳腺癌细胞； S2：提取乳腺癌细胞的总mRNA，将总mRNA进行稀释后放入到反应离心管，在温度为60-75℃的条件下，加入反转录缓冲液，然后温度按照1.5℃/min的降温速率下降至20-30℃，向其加入反转录酶、DNA聚合酶，期间不断用磁力棒搅拌处理，处理30-45min，得到cDNA，再对得到的cDNA通过上下引物分别进行PCR扩增，通过切酶SnaBI剪切，进行琼脂凝胶电泳，通过pBS-T Mini Kit中片段连接的方法，分别克隆到pBS-T载体中，通过电泳结果筛选及其琼脂糖凝胶电泳，获得质粒； S3：所述质粒作为模板，pGenesil-1载体，构建出相应的pGenesil-ETV1A、pGenesil-ETV1B、pGenesil-ETV1C、pGenesil-NC重组siRNA表达载体；在200μlPCR管中配制如下连接体系：pGenesil-1/HindⅢ/BamHⅠ载体大片段1μl；双链片段DNA5ul；T4DNAligase1ul；10×T4DNAligasebuffer1ul；ddH2O2μl。以上体系配制好后放入金属浴，16℃反应4小时，将连接产物全部加入到100μlDH5α感受态中，冰浴15min，加入500μlLB液体培养基，在温度为30℃，70rpm条件下，振荡培养1h，然后在35℃热激90s后立即冰浴100s，取150μl培养物涂布于LB/ Kan平板上37℃倒置培养10小时； S4：对培养后培养物进行转染Marc-145细胞，通过消化，振荡过滤将Marc-145细胞重选，调节细胞悬浮液密度，培养3-6h，然后将培养后的Marc-145细胞放入到四孔板中培养，待细胞密度为60-70％时，向四孔中分别加入转染试剂离心搅拌，观察细胞病变，培养4代后，加入含有乳腺癌细胞的新鲜培养基培养3-5h，洗涤，观察细胞状态及荧光强度。 2.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中液体培养液为硝酸铵15-20g/L、黄豆粉3-7g/L、磷酸氢二钾0.03-1g/L。 3.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中液体培养液为黄豆粉3-7g/L、磷酸氢二钾0.03-1g/L、硝酸铵15-20g。 4.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中PCR反应体系及反应条件：通过无菌超纯水稀释至10μM/L；取已经稀释好的两条互补的mRNA靶点序列片段各1.5μl，10×T4buffer1μl，加水至总体积20μl，放于200μl的PCR管中，RT产物8.7uL，4×PCR缓冲液3uL，15mM的氯化钾3uL，PCR引物溶液1.5uL，DNA聚合酶0.5uL混匀后加入到87孔样品板上进行PCR反应，反应条件：85℃，8min；90℃，25min，60℃，30秒钟，65℃，2min，循环30次；70℃1min；4℃直至收取PCR产物。 5.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中所得的质粒通过阳性克隆筛选，进行阳性克隆筛选时，先平均取得质粒，均匀涂布到含去去甲基金霉素培养基平板上，培养6h，然后抽提质粒，将培养物在温度为20-30℃的条件下，滤膜过滤，通过EcoRI进行单酶切鉴定，被EcoRI切开的可能是阳性克隆。 6.如权利要求1所述的一种HER2基因过表达的乳腺癌细胞系的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中从-70℃中取出质粒细胞，冰上放置4min，待质粒细胞解冻后，加入9μL连接产物，轻柔混匀内容物，冰中放置10min；然后将之放到预加温到30℃的水浴锅中，静置70s；快 2
乳腺癌细胞培养
MCF-7是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10- 15%的小 牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25%的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml 培养瓶)静置消化2—5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该 细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-a受体和WNT7BS基因 培养基L15: Leibovitz Medium 血清10%FBS 细胞传代方法1:2~1:4 传代；每周2~3次 细胞传代情况C5 细胞冻存条件MDA-MB-231人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37 C 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA 溶液，消化5-10min 传代的比例：1 : 2~1: 4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度：1-2 X 10 6/管，液氮保存 MDA-MB-231人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37 C水浴中，震荡解冻2 min , 酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入 5 ml 37 C预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心( 1000 rpm , 5 min),弃去上清液，再加入 2 ml培养■基，转入培养瓶中培养。 产品名称：人正常乳腺细胞Hs 578Bst 规格：70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点：细胞代数为4-5代左右 包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书 细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC
乳腺癌细胞培养
MCF-7 就是一种很好养的人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或RPMI1640均可, 10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基,加入0、25％的胰酶1ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶(25ml培养瓶)静置消化2－5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用,感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过。需要注意的就是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231就是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体与WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代;每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS 支原体检测阴性 说明 培养基:DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件:37℃ 5% CO2 消化条件:0、25% (w/v) Trypsin-0、53mM EDTA溶液,消化5-10min 传代的比例:1:2~1:4 换液时间:2~3天换液一次 冻存液比例:85%培养基,10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度:1-2 ×10 6/管,液氮保存 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法:取出冻存管后,投入37 ℃水浴中,震荡解冻2 min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5 ml 37 ℃预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心(1000 rpm,5 min),弃去上清液,再加入2 ml培养基,转入培养瓶中培养。 产品名称:人正常乳腺细胞 Hs 578Bst 规格:70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点:细胞代数为4-5代左右 包装:内层无菌自封袋;专用防压泡沫盒;外层防压保温气泡袋;说明书 细胞来源:ATCC、sciencell、ICLC
小鼠乳腺癌模型的建立
小鼠乳腺癌模型的建立 乳腺癌是一种严重危害妇女健康的恶性肿瘤，目前，国内外乳腺癌发病率均呈显著上升趋势，在西方发达国家和我国主要城市女性乳腺癌发病率已居妇女恶性肿瘤的首位。与某些恶性肿瘤不同的是，及时正确的诊断与干预能显著改善乳腺癌患者的生存率及生活质量，甚至能获得终生治愈的效果。为了探索乳腺癌的生物学特征和探讨新的治疗方法，国内外研究者借助乳腺癌动物模型，对乳腺癌的病因、发病机制、早期诊断和治疗等方面开展研究。 目前乳腺癌动物模型的建立可分为自发型、诱发型和移植型三种，每种方法各有利弊，实验室使用最多的是移植型。自发型乳腺癌模型多采用近交系小鼠，如C3H，其生长到一定年龄便自然发生乳腺肿瘤。这种模型最大的特点是实验动物未经任何有意识的人工处理，其发生的条件比较自然，与人类患病过程更为相似。目前此种动物模型是乳腺肿瘤多级预防、治疗和研究发病机制的良好模型。但自发型乳腺癌模型生长缓慢，不易同时获得大批病程基本一致的动物，观察时间长，实验耗费大。诱发型乳腺癌模型是通过经口、涂抹、注射和埋藏等方法应用于实验动物，使之发生乳腺癌。用二甲基苯蒽为诱癌剂诱发乳腺癌，是应用较多的一种方法。这种方法形成的肿瘤与人体肿瘤增殖动力学基本类似，但诱癌过程较长，成功率不高，肿瘤发生的潜伏期个体变异较大，不易同时获得病程或肿块大小均一的模型。相比之下，移植型动物模型克服了上述缺点。迄今，进入移植型动物
模型实验研究的人乳腺癌细胞系有20多种，其中较为常用的有MCF7、MDA．MB-231和MDA．MB-435等。采用移植法建立的乳腺癌模型周期短，成本低，可使实验动物均带有同样的肿瘤，生长速度也较一致，个体差异小，无自发缓解，成瘤率高，是目前实验室应用最多的模型。 对此，重点查阅资料关于移植性乳腺癌动物模型制作的具体步骤。 材料与方法 （1）实验材料 a.动物及分组：取20只昆明鼠随机分成A组（10只），B组（5只），C 组对照组（5只），编号饲养。 b.试剂：无菌水，生理盐水，台酚蓝，2%冰醋酸，甲醛，乙醇，二甲苯，石蜡等。 c.仪器：离心机，显微镜，计数板，电子称，超净工作台，温箱，切片机等。 （2）实验方法 a.模型建立：取H22肿瘤细胞，3000转离心分钟，再用无菌生理盐水洗涤肿瘤细胞3次，并做适当稀释，取40微升细胞悬液加入10微升0.4%台酚蓝染色并镜检计数，制成浓度为3*106个/ml的肿瘤细胞悬液，每只小鼠右腋皮下接种肿瘤细胞悬液0.2毫升。 b.细胞计数：细胞计数液2%冰醋酸溶液。取50微升细胞悬液加入450微升的细胞计数液中计数。 （3）记录： 接种完成后,逐日观察接种部位有无感染,肿瘤生长后有无自然消退,
乳腺癌细胞株
细胞英文名称MDA-MB-231 细胞中文名人乳腺癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因。 培养基L15: Leibovitz Medium 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:2~1:4传代；每周2~3次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 同工酶染色体58~61，有巨核 使用权限A类实物状态可用 细胞英文名称MDA-MB-468 细胞中文名人乳腺癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞是1977年由Cailleau R等从一位患有转移性乳腺癌的51岁黑人女性的胸腔积液中分离得到的。虽然供体组织的G6PD等位基因杂合，但此细胞株始终表现为G6PD A表型。P53基因273位密码子存在G→A突变，从而导致Arg→His替代。每个细胞上存在1×106个EGF 受体。 培养基L15: Leibovitz Medium 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:2~1:4传代；每周换液2~3次。传代情况C4 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 细胞英文名称SK-BR-3 [SKBR-3；SKBR3] 细胞中文名人乳腺癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性这株细胞是1970年由Trempe G和Old LJ从一位43岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离得到的。该细胞亚显微结构特征包括微丝和桥粒、肝糖原颗粒、大溶酶体、成束的细胞质纤丝；过表达HER2/c-erb-2基因产物。 培养基RPMI 1640 (w/o Hepes) 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:2传代；每周换液2~3次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 同工酶染色体69~80 细胞英文名称MCF7 [MCF-7] 细胞中文名人乳腺癌细胞 形态特性上皮样生长特性贴壁生长 特征特性该细胞是从一名69岁的白人女性乳腺癌患者的胸腔积液中分离建立的。该细胞保留了多个分化乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成隆突结构（domes）；该细胞表达WNT7B癌基因；TNF-α可以抑制MCF-7细胞的生长；抗雌激素处理能调节细胞胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP）的分泌。 培养基DMEM-H: Dulbecco＇s Modified Eagle＇s Medium (DME H-21 4.5g/Liter Glucose) 血清10%FBS其它因子无 传代方法1:3~1:6传代；每周2~3次。传代情况C5 冻存条件基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性 同工酶染色体72~84 查询培养基,定制缺陷型培养基,规模培养用培养基订购(可参与实验) 培养用常用试剂各品牌评定\推荐(您用过好的产品也可以列出\说明理由,统计后的结果共享) 细胞培养条件查询.细胞订购,细胞规模培养技术交流,培养条件方案交流,
基因敲除MDA-MB-231细胞系,乳腺癌研发福音
MDA-MB-231细胞系是从一名51岁的白种女性转移性乳腺癌的胸腔积液建立的人乳腺细胞系。该上皮细胞系是医学研究实验室中使用最广泛的乳腺癌细胞系之一，特别是涉及CRISPR/Cas9基因敲除的那些。 由于缺乏ER和PR表达以及HER2扩增，该细胞系最初被归类为“基础”乳腺癌细胞系。然而，由于它表现出claudin-3和claudinin-4的下调，Ki-67增殖标记物的低表达，与上皮-间质转化有关的标记物的富集，因此现在被认为属于claudin-低分子亚型。以及与乳腺癌干细胞（CSC）相关的特征的表达，例如CD44 + CD24- /低表型。这就是为什么许多研究一直专注于基因编辑 MDA-MB-231细胞系的原因。 应用：
1. CRISPR / Cas9诱变使靶向MDA-MB-231细胞的推定癌症依赖性无效。癌细胞需要表达某些基因的表达，这些基因编码肿瘤生长所必需的蛋白质。沉默这些基因的表达或阻断蛋白质的活性可以触发细胞死亡和持久的肿瘤消退。因此，识别和表征癌症依赖性是临床前癌症研究的关键目标。MELK被认为是多种癌症类型的癌症依赖性和推定药物靶标，其中之一是MDA-MB-231细胞系。MELK在乳腺癌细胞中过表达，与患者预后不良有关。此外，据报道，使用RNAi 敲低MDA-MB-231细胞中的MELK可阻止癌细胞增殖并触发细胞周期停滞或有丝分裂灾难。 研究人员设计了针对MELK的七个指导RNA（gRNA），并将每个指导RNA 克隆到一个表达GFP的载体中，并将该指南转导到了三个表达Cas9细胞系中：三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231据报道会上瘾。MELK表达。对过表达的MDA-MB-231细胞中MELK蛋白水平的蛋白质印迹分析证实，CRISPR系统可有效消除MELK表达。
乳腺癌动物模型的研究现状与评价
乳腺癌动物模型的研究现状与评价 【摘要】乳腺癌动物模型的建立方法主要可分为自发性、诱发性和移植性3种，每种方法都有其各自的特点和应用条件。 【关键词】乳腺癌;动物模型;现状与评价;综述 乳腺癌是一种严重威胁女性健康和生命安全的恶性肿瘤。乳腺癌在世界范围内呈上升趋势［1］，乳腺癌动物模型的制作对进一步研究乳腺癌的病因、发病机理，从而对其进行有效预防、提高治疗效果将起到非常关键的作用。在这方面，国内外有关学者已做了大量工作，现将其研究状况作一综述。 1 实验动物的选择 建立乳腺癌模型时对动物一般要求其癌诱发率高，饲养方便。常选用的动物主要有大鼠、小鼠、裸鼠、猫、犬及兔。其中，大鼠、小鼠由于成本低，易饲养，且诱癌周期相对较短，故多用于大批量的实验研究。但由于不同科系、性别乃至不同鼠龄的大鼠均会直接影响到诱癌率和造模时间，因此，诱癌率较高的Wistar系雌性大鼠常被选用。 裸鼠因先天性缺乏胸腺，T细胞免疫功能接近于零，所以人体肿瘤异种移植时无排斥反应，移植后的人体肿瘤保持其原有的组织形态，免疫学特点以及特有的染色体组型和对抗肿瘤药的原有敏感
性，且对培养条件等要求比SCID鼠低，无毛，易于动态观察肿瘤的生长状态，同时浸润与转移是人类恶性肿瘤的两个重要特征，在裸鼠上可以通过接种方式、部位的选择，达到较满意的转移效果，因此，目前多选择其进行人乳腺癌细胞异位移植。 2 造模方法 2.1 自发性乳腺癌动物模型 实验动物各群中自然发生或通过遗传育种而保留下来的一类肿 瘤称为自发性肿瘤。C3 H小鼠最常用于自发产生乳腺癌的动物，一般生后6个月可100%产生乳腺癌。自发性肿瘤模型有一定的优点，首先从肿瘤发生来看，与人类肿瘤相比更相似，实验结果更易于外推于人;其次，对影响肿瘤发生、发展的原因更有可能被发现。但其肿瘤发生、发展的时间参差不齐，使实验时间延长，实验所需动物数量多，耗费大。 2.2 诱发性乳腺癌动物模型 使用化学物质、物理、生物因素等可在实验动物中诱发乳腺癌的发生 ［2］，目前较多用的是化学诱导方式。用致癌物质二甲基苯蒽（DMBA）和甲基胆蒽可诱发乳腺癌。以灌胃［3］、局部涂抹［4］或皮下注射来作用于Wistar雌性大鼠。胃管灌注低剂量DMBA，持续3个月，可建立乳腺癌癌前病变动物模型［5］。化学诱导乳腺癌发生的动物模型常用于乳腺癌的病因学研究及预防性研究［6］。实验性肿瘤诱
乳腺癌细胞培养电子版本
乳腺癌细胞培养
MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。 MDA-MB-231人乳腺癌细胞 细胞中文名称人乳腺癌细胞 细胞英文名称 MDA-MB-231 物种人 细胞形态特征上皮样 细胞生长特性贴壁生长 细胞特种特性 MDA-MB-231是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体和WNT7B癌基因 培养基 L15: Leibovitz Medium 血清 10%FBS 细胞传代方法 1:2~1:4传代；每周2~3次 细胞传代情况 C5 细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS
支原体检测阴性 说明 培养基：DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10% 培养条件：37℃ 5% CO2 消化条件：0.25% (w/v) Trypsin-0.53mM EDTA溶液，消化5-10min 传代的比例：1：2~1：4 换液时间：2~3天换液一次 冻存液比例：85%培养基，10%FBS, 5% (v/v) DMSO 冻存密度：1-2 ×10 6/管，液氮保存 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法：取出冻存管后，投入37 ℃水浴中，震荡解冻2 min，酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入5 ml 37 ℃预热的培养基，并清洗冻存管一次，将离心管离心（1000 rpm，5 min），弃去上清液，再加入2 ml培养基，转入培养瓶中培养。 产品名称：人正常乳腺细胞 Hs 578Bst 规格：70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶 特点：细胞代数为4-5代左右 包装：内层无菌自封袋；专用防压泡沫盒；外层防压保温气泡袋；说明书 细胞来源：ATCC、sciencell、ICLC 货期：1-2周 运输方式：快递运输
MDA-MB-231人乳腺癌细胞
MDA-MB-231人乳腺癌细胞 Cat Number：KG033 For Research Use Only 一、组成: 组份KG033 细胞一瓶25cm2 细胞说明书1份 细胞培养注意事项1份 二、客户自备试剂: 1、PBS (凯基货号：KGB5001) 2、Complete growth medium (凯基货号：KGM 41300-500) 3、0.25% （W/V） Trypsin-0.53mM EDTA (凯基货号：KGY0012) 三、细胞简介: Growth Properties: adherent Organism: Homo sapiens (human) Source: Organ: mammary gland; breast Cell type: epithelial Disease: adenocarcinoma Derived from metastatic site: pleural effusion Age: 51 years adult Gender: female Ethnicity: Caucasian Propagation: Complete growth medium: L-15+10%进口FBS+P/S Temperature: 37.C Atmosphere: Without(CO2) Subculturing: Protocol: 1.Remove and discard culture medium. 2.Briefly rinse the cell layer with 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA solution to remove all traces of serum that contains trypsin inhibitor. 3.Add 2.0 to 3.0 ml of Trypsin-EDTA solution to flask and observe cells under an inverted microscope until cell layer is dispersed. Note: To avoid clumping do not agitate the cells by hitting or shaking the flask while waiting for the cells to detach. Cells that are difficult to detach may be placed at 37°C to facilitate dispersal.