穿心莲内酯调控硫代乙酰胺诱发小鼠肝纤维化的作用机制
华西药学杂志W C J ·P S
2016，31（4）∶368 374
基金项目：赣州市指导性科技计划基金资助项目（2010）
作者简介：刘志勇，从事医院临床工作。Email ：barton123321@163．com
穿心莲内酯调控硫代乙酰胺诱发小鼠肝纤维化的作用机制
刘志勇1
，易
坚1，邹小明
2
（1．赣南医学院第一附属医院，江西赣州341100；2．哈尔滨医科大学附属第二医院，黑龙江哈尔滨150086）摘要：目的利用硫代乙酰胺（TAA ）诱发小鼠肝纤维化的动物模型，探讨穿心莲内酯（AG ）减缓肝纤维化的作用及其分子机制。方法
每周给予小鼠2次100mg ·kg －1TAA ，分别于第1、4周取样，并同时喂食高（100mg ·kg －1）、低（20mg ·
kg －1）剂量AG ，于第4周后取肝脏组织做组织切片、免疫组织化学染色、双重免疫荧光染色，收集血清做丙氨酸氨基转移酶分析。结果AG 可降低TAA 所诱发肝内炎性物质与过氧化反应的表达，降低肝组织中Neutrophil 、CD11b 、F4/80的表达以及NF －κB 、COX －2、p －cPLA2、Nrf2蛋白质等的表达量，并能调控肝内脂质过氧化作用，上调SMP30蛋白质水平；组织切片染色显示：给予TAA4周后的小鼠肝脏有明显纤维化，而随着给予AG 剂量的增加有显著改善作用；随着AG 剂量的增加减少了肝脏内α－SMA 、TGF －βＲ1蛋白质的表达量；使用双重免疫荧光染色法发现AG 减缓肝纤维化的作用与调控星状细胞活化相关。结论AG 能调控肝内炎性病变进而减缓TAA 所引起的肝脏纤维化。
关键词：硫代乙酰胺；穿心莲内酯；小鼠；肝纤维化；机制；免疫组织化学染色；双重免疫荧光染色；马森三色染色法中图分类号：Ｒ96
文献标志码：A
文章编号：1006－0103（2016）04－0368－07
DOI ：10．13375/j．cnki．wcjps．2016．04．012
Mechanism of andrographolide regulation thioacetamide －induced liver fibrosis in mice
LIU Zhiyong 1，YI Jian 1，ZOU Xiaoming 2
（1．The First Affiliated Hospital of Gannan Medical University ，Ganzhou ，Jiangxi ，341100P．Ｒ．China ；2．The Second Affiliated Hospital of Haerbin Medical University ，Haerbin ，Heilongjiang ，150086P．Ｒ．China ）Abstract ：OBJECTIVE
To investigate the effect and the underlying molecular mechanisms of andrographolide （AG ）against thioac-etamide （TAA ）－induced mice with hepatic fibrosis．METHODS
All experimental groups except the normal control group ，received
100mg ·kg －1TAA twice a week for either 1st week or 4th weeks．The mice were intraperitoneally injected with TAA （100mg ·kg －1）two times per week for 4weeks ，and co －treated with AG of low （20mg ·kg －1）or high （100mg ·kg －1）dose．Mice were sacrificed after 1or 4weeks ’treatment ，then the liver and serum of mice were collected for histopathology assay ，immunohistochemistry ，doubling immuno-fluorescences stain and plasma Alanine transaminase assay．ＲESULTS
AG reduced TAA －induced liver inflammation and oxidative
stress ，relative to down －regulated hepatic neutrophil ，CD11b ，F4/80expression ，proinflammatory mediator COX －2，p －cPLA2，NF －κB ，
Nrf2protein levels ，lipid peroxidation and up －regulated SMP30protein levels．Histological examination showed a significant change in liver fibrosis after the treatment with AG for 4weeks．AG also dose －dependently suppressed protein expression of α－smooth muscle actin and TGF －βＲI．The doubling immunofluorescence stain showed that the anti －fibrotic mechanism of AG may be related to the modulation of hepatic stellate cells activation．CONCLUSION The study demonstrates that AG modulates hepatic inflammation to
reduce angiogenesis and liver fibrosis in TAA －induced mice．
Key words ：Thioacetamide ；Andrographolide ；mice ；Hepatic fibrosis ；Mechanism ；Immunohistochemistry ；Doubling immunofluorescences
stain ；Mason ’s three color stain
CLC number ：Ｒ96
Document code ：A
Article ID ：1006－0103（2016）04－0368－07
穿心莲在临床上用于清热解毒、消肿止痛等症，对发炎感染性疾病或湿热黄疸等症也有一定作
用［1］
。穿心莲内酯（andrographolide ，AG ）为其中主要的活性成分，具有抗炎、抗氧化等作用
［2］
。肝纤
维化为慢性肝脏发炎发展至肝硬化的一种持续性病
理变化，病理过程复杂。中草药具多环节、多靶点的药理学特性，可使其在肝纤维化的治疗上显示出明
显的优势及价值［3］
。现研究AG 减缓肝纤维化的作
用及其可能参与的分子机制。
1
实验部分
1.1
试药与动物
穿心莲内酯（AG ，长雅生物科技公司）；蛋白质
染剂（美国Bio －Ｒad ）；一级抗体SMP30、
Nrf2、cPLA2、NF －κB 、TGF βＲⅠ、TGF βＲⅡ（Santa Cruz 公
司）；COX －2、
p －cPLA2（Cell Siganl 公司）；α－SMA
（Chemicon公司）。Hamster小鼠（国家动物中心），体重100 120g，饲养于24?环境中，自由摄取饲料及饮水。
1.2方法与结果
1.2.1小鼠的分组、给药与分析小鼠试验分为正常组（每天2次经由胃管连续喂食生理盐水，分别持续1周、4周）、TAA1周组（每周2次由腹腔注射100mg·kg－1TAA，持续1周）、TAA4周组（每周2次由腹腔注射100mg·kg－1TAA，持续4周）、TAA4周喂食20mg·kg－1AG组（每周2次由腹腔注射100 mg·kg－1TAA，每日经由胃管喂食20mg·kg－1AG，持续4周）、TAA4周喂食100mg·kg－1AG组（每周2次由腹腔注射100mg·kg－1TAA，每日经由胃管喂食100mg·kg－1AG，持续4周），每组4只小鼠。在注射TAA的同时，每日在小鼠清醒的状态下经由胃管分别喂食生理食盐水或高、低剂量AG，4周后，处死，收取血液及肝脏组织做后续分析。分别切取相同位置的肝脏组织做病理切片，以HE染色、马森三色染色、免疫组化染色分析neutrophil、CD11b、F4/ 80、α－SMA等的表现及用双重免疫荧光染色分析α－SMA、desmin等的表达；检测血清中丙氨酸氨基转移酶的变化。
1.2.2肝功能、丙二醛（MDA）的测定和Western Blot分析丙氨酸氨基转移酶（ALT）主要存于肝细胞的粒线体中，只在肝细胞被大量破坏时，ALT才会大量释放，故ALT在肝损伤的指标上具有代表性的意义。取血清，用分光光度计检测ALT，使用ALT 试剂，测其在340nm处的吸光度。以ddH20作为空白对照。以下列数值公式计算：ALT（IU·L－1）=［第2次吸光度（扣除空白对照吸光度）－第1次吸光度（扣除空白对照吸光度）］?1768。正常组的ALT=54．6IU·L－1，而TAA1周组的ALT升高至338．7IU·L－1，TAA4周组高达455IU·kg－1，与正常组比较，有显著性差异（P＜0．05）。给予AG后，随着剂量的增加，ALT值随之降低，20mg·kg－1AG组的为299．1IU·L－1，而100mg·kg－1AG组的为191.2IU·L－1，有显著性差异（P＜0．05）（图1）。取适量组织（0．5?0．5cm2）于研磨棒中，加入400μL 20mmol·L－1PPB（含0．025mmol丁羟甲苯与1.15%KCl）研磨。将研磨后的组织液以1?104r·min－1于4?下离心10min，取上清液置玻璃管中，用10mmol·L－1TMP及20mmol·L－1PPB（含1．15% KCl）配制500μL不同浓度的标准品作为标准浓度。与待测样品依序加入0．5mL3%SDS、2mL 0.1mol·L－1HCl、0．3mL10%磷酸钨酸、1mL 0.7%戊硫巴比妥，混合均匀后，用水浴加热至100?、30min以促反应，置自来水下冷却10min 后，加入5mL1－丁醇，混合均匀后，于室温下以2?103r·min－1离心10min。取上层液以荧光光谱仪在532nm处检测吸光度。取适量检体分别置研磨棒中，加入1mL蛋白质萃取缓冲液，置冰上研磨。待检体完全溶解，以1．3?104r·min－1在4?下离心15min。取上清液置冰上，待蛋白质定量后，分装，置－80?冷冻柜中保存。利用Bio－Ｒad公司生产的蛋白质染剂来测定蛋白质的浓度，目的在于定量由细胞中萃取的蛋白质含量；配制十二基硫酸钠（SDS－PAGE）。根据蛋白质分析所得检体的总蛋白质浓度，吸取等量蛋白质，置水浴槽中，于95?加热7min，加热后立即将样品离心1min。将已煮好的检体蛋白质加入承载胶内，在电泳槽中以电压70V进行电泳，SDS－PAGE上可见染色的带状移动至凝胶的底端时才停止电泳，达3h。将分离的蛋白质由SDS－PAGE转移到蛋白质转印模上，转印的时间为90min。将蛋白质转印膜放入夹链袋中，加入稀释后之一级抗体，即SMP30、Nrf2、cPLA2、NF－κB、TGFβＲⅠ、TGFβＲⅡ、COX－2、p－cPLA2、α－SMA。以β－actin作为内控。取出蛋白质转印膜，先以5%脱脂乳清洗5min，再以TTBS清洗5min，加入接有HＲP（辣根过氧化物酶）的二级抗体于室温下摇晃反应1h。以5%脱脂乳清洗5min两次，再以TTBS清洗5min。于暗房内将蛋白质转印膜与ECL试剂盒的试剂作用5min，以X光片于暗房中进行显影，观察蛋白质的表达。
A
L
T
/
I
U
·
L
-
1
---20100
mg·kg-1)
AG(mg·kg-1)
Groups
图1小鼠血清中ALT的含量
Figure1ALT contents in the mice serum
1.2.3HE染色、马森三色染色、双重免疫荧光染色及免疫组织化学染色法小鼠的肝细胞经固定、石腊包埋、切片、脱蜡后，分别以递减浓度的乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）各浸泡2min后，静置于PBS中5min。以苏木精染色5min，用自来水洗冲未染色的苏木精，使组织切片呈蓝色即可。再以曙红浸泡约30s。以95%、100%、100%乙醇作为
963
第4期刘志勇，等。穿心莲内酯调控硫代乙酰胺诱发小鼠肝纤维化的作用机制
梯度脱水溶液，每次各5min。结束后，静置于二甲苯中，等待封片。使用光学显微镜观察其细胞核及细胞质特性（细胞核为蓝色，细胞质为红色），了解细胞的损伤程度。组织病理学检查显示：正常组小鼠的肝小叶结构完整，肝纤维板排列整齐；TAA1周组正常肝小叶的结构被破坏或消失；TAA4周组的肝细胞排列紊乱，部分肝组织有坏死的情形；给予穿心莲内酯治疗后可改善组织结构破坏的情形；AG 高剂量组（100mg·kg－1）在中央静脉周围的细胞坏死情形有明显改善（图2）。小鼠的肝细胞经切片、固定、脱蜡、水洗，以Weigert氏铁苏木紫溶液染色10min，再水洗15min，用猩红－酸性复红溶液染色2min，略加水洗后，再以苯胺蓝进行染色，再浸于磷钨酸－磷钼酸溶液中15min，略加水洗后，再以苯胺蓝染色5min，水洗，用1%冰乙酸溶液洗涤5min，水洗，脱水、透明、封片。马森三色染色主要看肝内的胶原纤维分布的状态，染色细胞核呈黑色，胶质纤维呈蓝紫色。正常组的中央静脉周围，看不到蓝紫色的胶原堆积。随着给予TAA时间增长到4周，在中央静脉区有胶原推积，且有纤维间质的产生。给予AG后在中央静脉周边仍有胶原的染色，但比TAA组的纤维间质明显减少，但仍比正常组多；随着给予剂量的增加，胶原堆积的情形随之改善（图2）。将小鼠肝细胞的石蜡切片浸于二甲苯中5min 3次脱蜡后，再分别以递减浓度的乙醇（100%、95%、75%、50%）各浸泡2min，静置于PBS中5min，将阻断液覆盖在玻片上作用30min，用PBST 清洗后，加入一级抗体：Desmin、α－SMA，将稀释后抗体覆盖在玻片上避光培养60min，然后以PBST 清洗3次，各5min，再加入二级抗体覆盖在玻片上避光培养60min，用PBST清洗3次，各5min，加入DAPI避光作用4min进行细胞核的染色，再以PBST清洗3次，各5min后即可封片，置荧光显微镜下观察染色结果。使用双重免疫荧光染色可观察α－SMA与Desmin的表达。α－SMA讯号以红光标示，Desmin以绿光标示，细胞核使用DAPI染色，以蓝光标示。发现两者在TAA4周组中皆沿着纤维间质位置上表达（橘光）；给予高剂量AG（100mg·kg－1）治疗后能降低两者的表达量（图3）。小鼠肝细胞的石蜡切片脱蜡3次后，分别以递减浓度的乙醇（100%、95%、75%、50%）各浸泡2min后，将3% H
2
O
2
覆盖在玻片上2次，各10min，去除内原性氧化酶。将阻断液覆盖在玻片上30min，用PBST清洗，加入一级抗体neutrophil、CD11b、F4/80和α－SMA，将稀释后的抗体覆盖在玻片上避光培养60 min，以PBST清洗3次，各5min，加入二级抗体覆盖在玻片上，避光培养60min，以PBST清洗3次，各5min，加上共轭链霉亲和素过氧化物酶作用30 min，用PBST清洗3次，各5min，最后以DAB作为呈色剂，避光10min，加水洗涤后，以苏木素作为背景染色，再以水清洗5min3次，即可封片，置显微镜下观察染色结果。
1.2.4AG对小鼠肝脏组织外观的影响直接观察肝脏外观，正常组的肝脏色泽红润，表面平滑且触感柔软，而经TAA处理后的色泽偏黄，肝脏表面呈现颗粒粗糙状且触感坚实，TAA4周组肝脏的体积相较于正常组的有明显缩小情形。喂食AG后，随着给予剂量的增大，而病变的情形有所缓减（图4）。
A1B
1C1D
1
E1
A2B
2
C2D2E2
图2正常组（A）、TAA1周组（B）、TAA4周组（C）、TAA4周+20mg·kg－1AG组（D）和TAA4周+100mg·kg－1AG组（E）小鼠肝脏切片的HE染色（1）和马森三色染色（2，肝脏胶原纤维呈蓝紫色）的染色图（?200）
Figure2HE（1）and Marson three－color（2）staining of mouse liver of control group（A），TAA－1week group（B），TAA－4weeks group （C），TAA－4weeks treated with20mg·kg－1AG group（D）and TAA－4weeks treated with100mg·kg－1AG group（E）073华西药学杂志第31卷
Normal
TAA 4weeks
TAA 4weeks+
AG 100mg
·kg
-1Groups
图3小鼠肝细胞的双重免疫荧光染色、α－SMA 和Desmin 图（?200）
Figure 3
Doubling immunofluoreseance ，α－SMA and Desmin figures of mouse liver cells （?200）
1.2.5AG 对肝脏内氧自由基的影响使用West-
ern blot 发现：给予AG 可以增加因TAA 所致肝脏内SMP30蛋白质的表达量下降（P ＜0．05）；而Nrf2在TAA 1周组中表达量上升（P ＜0．05），注射TAA 4周后表现量趋缓，给予AG 治疗后能降低其表达量（P ＜0．05）。在MDA 检测肝内脂质过氧化反应中，TAA 4周组的明显增加了MDA 的表达量（P ＜0．05），喂食AG 后可降低肝内脂质过氧化的反应（图5）。
1.2.6
AG 对炎症反应因子的影响用Western
blot 观察AG 对体内炎症反应物质的影响。NF －κB
（p65）在TAA 4周组的表达量较正常组明显上升（P ＜0．05），给予低、高剂量（20、100mg ·kg －1）AG 后，皆能减少其表达量。COX －2为合成前列腺素
的关键酶，
COX －2在TAA 4周组中的表达量相较于正常组的明显上升（P ＜0．05），给予AG 后，
可见COX －2的表达随着AG 剂量的增加，明显被逐渐抑制（P ＜0．05）；c －PLA2为合成类花生酸类物质速率的关键酶，分析肝内c －PLA2总蛋白量及磷酸化蛋白质相对量的变化。给予高剂量AG （100mg ·kg －1）可降低给予TAA 4周所诱发c －PLA2蛋白质的表达（P ＜0．05）（图6）。肝脏受损时，首先启动
嗜中性球及库氏细胞至发炎部位，然后再吸引大量
淋巴细胞浸润。而在免疫组织化学染色法结果中发现：neutrophil （棕黄色的细胞）在TAA 1周组即被诱
发其表达，随着TAA 给予时间至4周时，
neutrophil 的表达量增加，多分布在纤维间质周围，
ig AG 后，能显著减少其在肝脏中的表达量，在100mg ·kg －1
AG 组几乎看不见neutrophil 的讯号（图7）。CD11b
和F4/80为巨噬细胞表面抗原，进一步使用免疫组
织化学染色观察肝内巨噬细胞（库氏细胞）的表达，染上深褐色的细胞为其讯号的表达。在TAA 给予1周时就诱发了CD11b 和F4/80的表达，给予TAA 至4周，
CD11b 和F4/80的表达量增加并沿着纤维间质而表达，给予高剂量AG （100mg ·kg －1
）治疗后，能显著减少两者的表达量（图7）。
A
B
C
D
E
图4正常组（A ）、TAA 1周组（B ）、TAA 4周组（C ）、TAA 4周+20mg ·kg －1AG 组（D ）和TAA 4周+100mg ·kg －1AG 组（E ）小鼠肝脏外观的比较
Figure 4
Outlook of mouse liver from control group （A ），TAA －1week group （B ），TAA －4weeks group （C ），TAA －4weeks treated with 20mg ·kg －1AG group （D ）and TAA －4weeks treated with 100mg
·kg －1AG group （E ）TAA(100mg ·kg -1)
AG(mg
·kg -1
)M D A /I p m o l ·m g -1
5
43210
W e s t e r n b l o t d e n s i t o m e t r y
(r e l a t i v e U r i t s )
-1wk 4wks 4wks 4wks ---20100SMP30Nrf2
---20100A
B
-1wk 4wks 4wks 4wks ---20100
SMP30Nrf2
茁-actin
Groups
图5Western blot 分析（A ）、Western blot 量化图（B ）与脂质过氧化能力的检测（C ）
Figure 5
Western blot anlysis （A ），
Western blot figure （B ）and lipid oxidative stress （C ）1
73第4期刘志勇，等。穿心莲内酯调控硫代乙酰胺诱发小鼠肝纤维化的作用机制
A
B
TAA(100mg ·kg -1)AG(mg ·kg -1)
-1wk 4wks 4wks 4wks ---20100---20
100
COX-2cPLA2p-cPLA2NF-资B(p65)
茁-actin
86420
W e s t e r n b l o t d e n s i t o m e t r y (r e l a t i v e U n i t s )
COX-2
p-cPLA2/CPLA2NF-资B(p65)
Groups
-1wk 4wks 4wks 4wks 图6小鼠肝内炎症相关因子蛋白质的Western blot 分析（A ）和Western blot 量化图（B ）
Figure 6
Western bolt anlysis （A ）and Western blot figure （B ）of mouse live inflammation －related factprotein
1.2.7
α－SMA 的表达正常组中无α－SMA 的
表达，随着给予TAA 时间的延长，α－SMA 多沿着
胶原纤维沉积处分布，纤维间隔区均有大量的表达。给予AG 能减少α－SMA 的表达，在高剂量AG （100mg ·kg －1）组中只见在中央静脉周围有些许
的α－SMA 表达（图8）。同样，从Western Blot 对
α－SMA 蛋白质的表达量看，随着给予TAA 时间的延长，α－SMA 的表达量增加。ig AG 后，随着剂量的增加，显著地降低了α－SMA 的表达量（P ＜0.05）（图9）。
A 1
B 1
C 1
D 1
E 1
A 2
B 2
C 2
D 2
E 2
A 3
B 3
C 3
D 3
E 3
图7正常组（A ）、
TAA 1周组（B ）、TAA 4周组（C ）、TAA 4周ig 20mg ·kg －1AG 组（D ）、TAA 4周ig 100mg ·kg －1AG 组（E ）小鼠肝细胞的Neutrophil （1，?200）、CD11b （2，?100）、F4/80（3，?100）的免疫组织化学染色图
Figure 7
Immunohistochemical staining of neutraphil CD11b and F4/80in mouse lives from control group （A ），TAA －1week group （B ），TAA －4weeks group （C ），TAA －4weeks treated with 20mg ·kg －1AG group （D ）and TAA －4weeks treated with 100mg ·kg －1AG group （E ）
A B C D E
图8正常组（A ）、
TAA 1周组（B ）、TAA 4周组（C ）、TAA 4周ig 20mg ·kg －1AG 组（D ）、TAA 4周ig 100mg ·kg －1AG 组（E ）小鼠肝细胞的α－SMA 免疫组织化学染色图（?200，呈棕黄色）
Figure 8
Immunohistochemical staining of mouse liver cell α－SMA from control group （A ），TAA －1week group （B ），TAA －4weeks group （C ），TAA －4weeks treated with 20mg ·kg －1AG group （D ）and TAA －4weeks treated with 100mg ·kg －1AG group （E ）
1.2.8AG 对肝纤维化关键细胞素蛋白质表达的影
响
随着长时间给予TAA ，
TGF －βＲⅠ的表达量随之上升（P ＜0．05）。给予低、高剂量（20、
100mg ·kg －1）AG 后，均降低了TGF －βＲⅠ的表达（P ＜
2
73华西药学杂志
第31卷
0.05）；而TGF－βＲⅡ在各组间的表达无差异（图9）。
1.2.9统计方法实验结果以单项变异数分析（one way ANOVA）来决定多组间差异。若具显著性差异，再进行Student Newman－Keuls多变性分析来决定其差异。两组间的差异则以t检验分析。实验数据以珋x?s表示，P＜0．05为差异有统计学意义。
琢-SMA TGF-茁RⅠIGF-茁RⅡ
茁-actin
25
20
15
10
5
W
e
s
t
e
r
n
b
l
o
t
d
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n
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(
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A B
TAA(100mg·kg-1)
AG(mg·kg-1)
-1wk4wks4wks4wks
---20100
---20100
COX-2
p-cPLA2/CPLA2
NF-资B(p65)
Groups
-1wk4wks4wks4wks
图9小鼠肝细胞的肝纤维化关键细胞素蛋白质表达的Western blot分析（A）和Western blot量化图（B）
Figure9Western bolt anlysis（A）and Western bolt anlysis figure（B）of mouse live fibrosis－key protein expression
2讨论
肝脏受损时，肝细胞会促使星状细胞活化。星状细胞是产生细胞外基质的主要细胞，在肝纤维化形成中起着关键作用，其活化伴随一系列的功能改变，包括合成大量细胞外基质、表达α－SMA、分泌大量肝内TGF－β1及其他多种细胞因子及其受体等［4］，因此，抑制肝细胞凋亡、星状细胞活化和星状细胞活化后所产生的一系列反应，是中西医结合治疗肝纤维化的探讨内容［5］。文中实验发现：NF－κB （p65）蛋白质等炎症调控因子的表达皆随着给予硫代乙酰胺（TAA）的时间延长而增加，给予穿心莲内酯（AG）后能显著降低其表达；在炎症反应中，血管的渗透性增加，使单核巨噬细胞、血小板和其他的白血球等受到趋化素的吸引而聚集。从免疫组织化学染色中发现：在给予TAA时，CD11b和F4/80等巨噬细胞表面抗原，肝脏内CD11b和F4/80的表达随着给予AG而降低。肝脏内neutrophil及库氏细胞被活化，随着TAA刺激时间越长，表达量也随之增加，并沿着纤维间质区域而表现，给予AG后也能减缓两者被活化的情形，证实了AG的抗炎症特性。近来COX－2/prostanoid的路径也被证实与许多肝脏疾病有关［6］。文中研究发现：静止态的星状细胞无COX－2的表达，但活化态的星状细胞有表达，显示COX－2/prostanoid路径也参与在肝纤维化中［7］。实验中发现：给予TAA会诱发肝脏内COX－2、cpLA2等发炎反应因子的表达，给予AG治疗后能显著降低两者的表达。由此可推论：AG抑制COX－2的表现与减缓肝纤维化的情形有相关。衰老标记蛋白SMP30，又名regucalcin，其功能与体内钙离子调控及老化有关，在人体组织中分布较广，以肝脏中表达特别明显［8］。当肝脏损伤时，肝细胞中的SMP30会释放至血液中，显示SMP30可以当作慢性肝病的一个生物检测标志［9］。在抗氧化作用机制上，SMP30可以增加大鼠肝细胞中超氧化物歧化酶（SOD）的活性，提高肝细胞的抗氧化能力［10］。实验中也发现：给予AG能改善TAA所造成肝脏内SMP30蛋白质的表现量降低的情形，进而参与调控肝内氧自由基的表达。Desmin为目前用来标示肝脏星状细胞的主要抗体，可用于区别纤维母细胞［11］；而星状细胞活化时会大量表达α－SMA。AG 能显著降低α－SMA蛋白质的表达量，进一步使用双重免疫荧光染色方法确认Desmin与α－SMA在肝脏组织中的分布，归并后发现两者皆表达于纤维间质，给予高剂量AG后能减少两者的表达量，证实了AG减缓TAA所造成肝纤维化与调控肝内星状细胞活化有关。TGF－β1是肝纤维化过程中最主要的刺激因子，能促使星状细胞分化为肌纤维母细胞来调控星状细胞的增生［12］。当给予穿心莲内酯后能降低TGF－β的表达。总之，穿心莲内酯能够通过抗氧化、抗炎反应来抑制肝纤维化；通过研究肝纤维化相关因子来研究穿心莲内酯减缓肝纤维化的作用及其分子机制，有望成为抗肝纤维化的新型药物。
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收稿日期：2014－11－20
作者简介：李朋（1989—），
男，正攻读生药学专业的硕士学位。Email ：240258231@qq．com *通信作者（Correspondent author ），Email ：zhanghhx@vip．sina．com
虎杖中白藜芦醇及其甲基化衍生物对高脂血症小鼠降血脂和
抗氧化作用的研究
李
朋，陈
萍，张
浩
*
（四川大学华西药学院，四川成都610041）摘要：目的比较虎杖中白藜芦醇、
3，4'－二甲基化白藜芦醇、3，5，4'－三甲基白藜芦醇对高脂饲养小鼠动脉粥样硬化作用的影响。方法
小鼠用高脂饲料喂养8周，从第5周开始，给予白藜芦醇组、
3，4'－二甲基化白藜芦醇组、3，5，4'－三甲基白藜芦醇组单日单剂量30mg ·kg －1，阳性对照组10mg ·kg －1辛伐他丁，通过测定小鼠血清中一系列参数来判断白藜芦醇及其甲基化衍生物在降血脂和抗氧化方面的效果。结果
白藜芦醇及其甲基化衍生物均能显著降低小鼠血清中TG 、
TC 、LDL －C 、ox －LDL 、MDA 的含量（P ＜0．05或P ＜0．01），提高血清中NO 、HDL －C 的浓度（P ＜0．01），并增强SOD 酶的活力（P ＜0．01）；3，5，4'－三甲基白藜芦醇还可以可显著提高血清中CAT 的活性（P ＜0．01），白藜芦醇两个甲基化产物可降低LDL －C 、升高HDL －C ，增强CAT 酶的活力与白藜芦醇比较，显著增强（P ＜0．01）。结论
白藜芦醇及其甲基化衍生物均能有效地降低高脂症小
鼠动脉粥样硬化的风险，且白藜芦醇甲基化衍生物可能有更显著的效果，这可能与其增加生物利用度和延长半衰期有关。关键词：白藜芦醇衍生物；虎仗；氧化性低密度脂蛋白；一氧化氮；高脂血症中图分类号：Ｒ96
文献标志码：A
文章编号：1006－0103（2016）04－0374－04
DOI ：10．13375/j．cnki．wcjps．2016．04．013
Effect of resveratrol and its methylated derivatives in Polygonurn cuspidatum on hyperlipi-demia mice by inhibition of lipid peroxidation
LI Peng ，CHEN Ping ，ZHANG Hao *
（West China School of Pharmacy ，Sichuan University ，Chengdu ，Sichuan ，610041P．Ｒ．China ）Abstract ：OBJECTIVE
To compare the anti －atherosclerotic effect of resveratrol from Polygonurn cuspidatum and its methylated
derivatives on hyperlipidemia mice．METHODS
Mice were fed with high －fat diet for 8weeks and administered a single dose of
resveratrol ，3，4'－dimethoxy trans －stilbene and 3，5，4'－trimethoxy －trans －stilbene （TMS ）（30mg ·kg －1）a day from the 5th week ，with Simvastatin （10mg ·kg －1）as a positive control．Anti －hyperlipidemia and antioxidant effects were determined by a series
APJ拮抗剂Apelin13(F13A)对肝纤维化大鼠肝脏Beclin1、LC3和p62表达的影响
APJ拮抗剂Apelinl3 ( F13A)对肝纤维化大鼠肝脏 Beclin 1. LC3和p62表达的影响 刘明;曾斌;肖婷筑王珊;姚梦娜 【期刊名称】《医学信息》 【年(卷)，期】2015(000)025 【摘要】目的观察血管紧张素受体ATI相关的受体蛋白(APJ)拮抗剂Apelinl3(F13A)对肝纤维化大鼠肝脏中自噬相关基因Beclin 1、LC3和p62表达的影响。方法30只雄性SD大鼠随机分为对照组、肝纤维化模型组和Apelinl3(F13A)(100pg/kg)处理组。采用四氯化碳(CCI4)诱导大鼠肝纤维化模型。Apelinl3(F13A)通过腹腔注射给药。取肝左叶同一部位,苏木精-伊红(HE) 染色观察肝脏的病理形态学变化。Western blot检测肝脏中自噬相关基因Beclin 1、LC3和p62的表达。结果对照组大鼠肝脏的肝小叶结构完整，肝索排列整齐,结构完整,肝细胞排列整齐，没有发现明显的胶原纤维增生，纤维化程度分级为0级；肝纤维化模型组大鼠肝小叶结构破坏严重,肝细胞排列紊乱,汇管区发现明显的坏死细胞和炎性细胞，可见大量胶原纤维增生,形成纤维纵隔，纤维化程度分级为多为3-4级；与模型组比较,Apelinl3(F13A)组大鼠肝脏组织肝细胞变性和坏死明显减少，纤维化程度明显减轻,纤维化程度分级多为1-2级。与对照组t出交，肝纤维化大鼠Beclin 1和LC3的表达显著增加，而p62的表达显著降低(均＜0.05)。与肝纤维化模型组大鼠比较，Apelinl3(F13A)降低了Beclin 1和LC3的表达,而增加了p62的表达(均＜ 0.05)。结论APJ拮抗剂Apelinl3(F13A)抑制了CCI4诱导的大鼠肝纤维化，其机制可能与Apelinl3(F13A)抑制细胞自噬有关。
肝纤维化指标正常值
肝纤维化指标正常值 肝纤维化指标正常值，指的是对肝脏进行纤维化程度检查时，所参考的几个有意义的项目的正常范围。 具体来说，肝纤维化指标正常值就是：PCⅢ(即III型前胶原)的正常值、IV-C(即IV型胶原)的正常值、LN(即层粘连蛋白)的正常值、HA(即透明质酸酶)的正常值、CG (即甘胆酸)的正常值、PLD (即脯氨酸肽酶)的正常值、MAO (即单胺氧化酶)的正常值、PINP (即Ⅰ型前胶原氨端肽原)的正常值。 肝纤维化指标是对肝纤维化程度的一个评估标准。及早发现肝纤维化指标和正常值存在偏差，及早展开治疗，有利于遏制肝纤维化向更坏的趋势发展。因此，肝纤维化指标正常值相当重要。 想要得到肝纤维化指标正常值的准确数据，需要在检查前注意以下事项。 首先，检查前不能进食。肝脏抽血检查要求空腹，空腹时间一般为8—12个小时。 其次，检查前一天不能喝酒。喝酒会导致转氨酶升高，从而影响检查结果。 再次，检查前不要服用药物。有些药物会加重肝脏负担，造成肝功能暂时性损伤，从而引起肝纤维化指标检查结果的准确性。
第四，检查前要注意保证充足的睡眠，且不要进行剧烈运动。因为这些都有可能影响检查结果的准确性。 最后，接受肝穿刺活检时，一定要经过患者的同意。 在接受完静脉抽血后，就可以得到检查者的肝纤维化指标数据了。将这一数据和肝纤维化指标正常值相对比，就可以判断肝脏内的肝纤维化水平处于哪一阶段，以及是否需要治疗了。 肝纤维化指标正常值 指标具体项目正常值 PCⅢIII型前胶原低于18ng/mL IV-C IV型胶原30—140ng/mL之间 LN 层粘连蛋白50—180ng/mL之间 HA 透明质酸酶低于120ng/mL PLD 脯肽酶1107±19.5u/L之间 MAO 单胺氧化酶 3.3—15.1nmol/(s·L)之间有纤维化指标正常值，就有异常情况。肝纤维化指标的异常结果，主要有： PCⅢ超出纤维化指标正常值，连续上升，提示病情可能有恶化并向肝硬变发展。 IV-C超出纤维化指标正常值，能反映肝纤维化的程度逐渐加重。 LN水平超出纤维化指标正常值，数值越高，患者的食管
肝纤维化四项指标及其意义
肝纤维化四项指标及其临床意义 HA ,Hyaluronidase（透明质酸酶）： 为基质成分，可较准确灵敏地反映肝内已生成的纤维量及肝细胞受损状况，有认为本指标较之肝活检更能完整反映出肝全貌，是肝纤维化和肝硬变的敏感指标。 1）血清HA在急肝、慢迁肝时轻度升高；慢活肝时显著升高；肝硬化病人血清HA极度升高。 2）血清HA水平是反映肝损害严重程度、判断有无活动性肝纤维化的定量指标。 3）对慢迁肝与慢活肝的鉴别诊断，慢迁肝HA浓度与正常人无差别，而慢活肝的升高明显。 4）反映肝细胞功能，肝脏纤维化形成和程度，反映肝脏炎症性病变。 5）有助于估价肝病发展趋势，在急性肝炎→慢活肝→肝硬化发展中，血清HA逐步并优于其他肝硬化诊断指标等。 6）肝硬化时，有些病人HA却不升高，与其肝脏合成功能有关 LN ,Laminin （层粘连蛋白）： 为基底膜中特有的非胶原性结构蛋白，与肝纤维化活动程度及门静脉压力呈正相关，慢活肝和肝硬变及原发性肝癌时明显增高，LN也可以反映肝纤维化的进展与严重程度。另外，LN水平越高，肝硬变病人的食管静脉曲张越明 显。 1）反映肝纤维化：正常肝脏间质含少量LN，在肝纤维化和肝硬化时，→肌成纤维细胞增多→大量合成和分泌胶原、LN等间质成分→形成完整的基底膜（肝窦毛细血管化）。肝窦毛细血管化是肝硬化的特征性病理改变， LN与纤维化程度和门脉高压正相关，纤维化后期升高尤为显著。 2）可诊断酒精肝是否存在门脉高压 3）与基底膜相关疾病有关：如先兆子痫孕妇血清较正常妊娠者显著升高，提示可能与肾小球及胎盘螺旋动脉损伤有关。血清LN与糖尿病、肾小球硬化等疾病有关。 PCIII ,Procollagen Ⅲ（III型前胶原）： 反映肝内III型胶原合成，血清含量与肝纤程度一致。 1）PCIII与肝纤维化形成的活动程度密切相关，但无特异性，其它器官纤维化时，PCIII也升高。 2）持续PCIII升高的慢活肝，提示病情可能会恶化并向肝硬变形成发展，而PCIII降至正常可预示病情缓解，说明PCIII 不仅在肝纤维化早期诊断上有价值，在慢性肝病的预后判断上也有意义。 3）肝纤维化病变程度呈密切相关，反映肝纤维合成状况和炎症活动性，早期即显著升高，而陈旧性肝硬化和部分晚期肝硬变、肝萎缩患者血清PCⅢ不一定增高。
水飞蓟素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠肝纤维化作用
水飞蓟素抑制单核细胞来源的巨噬细胞肝脏浸润抗小鼠肝纤维 化作用 研究背景肝纤维化是由多种慢性肝病引起的肝脏炎症和修复失调所导致的,如病毒感染、毒物损伤、代谢紊乱和酒精滥用等,其特征是细胞外基质(extracellular matrix.ECM)过度沉积。肝脏中的纤维沉积,尤其是I型胶原, 可以保护肝细胞免受各种毒性刺激。 然而,过度的纤维沉积和调节失调会导致肝脏结构破坏、肝功能衰竭和肝硬化。到目前为止,临床上还没有有效的治疗肝纤维化的药物。 为寻找更好的治疗靶点,近年来对肝纤维化的病理生理机制进行了深入研究。大量的研究表明,固有免疫,特别是巨噬细胞在肝纤维化中起着关键作用。 肝巨噬细胞可通过多种途径促进肝纤维化,如释放促炎症因子,如肿瘤坏死 因子(TNF)-α、白细胞介素-1β和白细胞介素-6,诱导肝细胞坏死,促纤维化细胞因子,如转化生长因子(TGF)-β1直接激活肝星状细胞(HSC)。肝脏中巨噬细胞的来源主要有两种:一种是来源于胚胎祖细胞的存活时间长、自我更新的常驻库弗细胞(KF)。 在稳定状态下,肝脏中巨噬细胞数量的平衡主要依赖于KFs细胞的自我更新和增殖。另一种是在病理状态下从骨髓和外周血中迁移而来的单核细胞。 肝脏损伤后,外周血中的单核细胞大量趋化进入肝脏,并被活化成为巨噬细胞,释放促炎症因子和促纤维化因子,加剧了肝损伤和纤维化。这些发现表明抑制单核细胞浸润可能是治疗肝纤维化的一个新靶点。 进一步的研究发现,单核细胞主要根据细胞表面分子Ly6C分为两大亚群:经典单核细胞(Ly6Chi单核细胞)和非经典单核细胞(Ly6C]o单核细胞)。经典的单
核细胞表达高水平的CCR2和Ly6C,并表达低水平的CX3CR1,具有促炎症和促纤维化作用。 而非经典的单核细胞表达高水平的CX3CR1和低水平的CCR2和Ly6C,具有抗炎和抗纤维化作用。Ly6Chi单核细胞高表达的CCR2受体可与急慢性肝病时升高的趋化蛋白1(MCP-1)结合,导致Ly6Chi单核细胞向肝脏的趋化。 与野生小鼠相比,MCP-1-/-和CCR2-/-小鼠在毒性(四氯化碳,CCL4)和代谢(methionine choline-deficient)两种肝纤维化模型中显示较少的肝纤维化。药理抑制MCP-1的小鼠也出现类似现象。 因此,通过MCP-1/CCR2轴减少单核细胞浸润已成为肝纤维化治疗的重要靶点。水飞蓟是菊科药用植物。 水飞蓟素是一种含有水飞蓟全部药用成分的化合物,主要含有水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟宁和水飞蓟亭。水飞蓟素作为一种传统的保护肝的药物,具有特殊的疗效和极低的毒性,广泛应用于肝病的治疗。 许多临床和动物研究已经证实水飞蓟素具有保护肝细胞和抗肝纤维化的作用,但潜在机制仍然模糊不清。因此,本研究旨在研究水飞蓟素是否可以通过抑制Ly6Chi单核细胞的浸润而减轻四氯化碳诱导的肝纤维化。 以此来揭示水飞蓟素的保肝和抗肝纤维化的作用机理,为临床上更好的应用水飞蓟素提供充足的理论支持,且为今后治疗肝纤维化疾病提供新方向。研究方法本论文分为理论研究和实验研究两部分。 第一部分总结了中西医对肝纤维化的研究进展。第二部分研究了水飞蓟素抗纤维化的作用机制。 在理论研究部分,完整的叙述了中医先贤对肝纤维化病因病机、辨证和治疗
四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型改良的研究_邵佳亮
收稿日期:2011-05-18 基金项目:国家自然科学基金(30760230) 作者简介:邵佳亮(1980-),男,硕士,住院医师,主要从事肝纤维化的研究。 通信作者:胡国信,副教授,E -mail:hug uo x in8228@sina.co m 。 四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型改良的研究 邵佳亮,万赞燕,胡国信 (南昌大学第一附属医院感染科,南昌330006) 摘要:目的 构建肝纤维化大鼠模型,并对经典四氯化碳(CCl 4)复制模型方法进行适当改进。方法 取Sprague -Daw ley(SD)大鼠40只,雌雄各半,按随机数字表法分为A 组10只、B 组14只和C 组16只。B 组给予大鼠腹腔注射40%CCl 4花生油溶液2mL kg -1,2次 周-1,同时给予普通全价饲料喂养(改良方法);A 组为正常对照组,给予等量花生油腹腔注射,2次 周-1,同时给予普通全价饲料喂养;C 组给予大鼠腹腔注射40%CCl 4花生油溶液5mL kg -1,2次 周-1,同时给予添加10%猪油及2%胆固醇的饲料喂养(经典方法)。实验第8周末处死各组剩余大鼠:采用酶联免疫吸附法检测血清肝功能(A L T 、AST 、A L B 、T P 、A/G)水平;H E 及M asson 染色观察大鼠肝组织病理学变化。结果 实验第8周B 、C 组均可见明显肝功能损害表现。B 组可见部分标本肝脏假小叶形成,达到早期肝硬化,肝细胞少量脂肪变性,死亡率28.6%。C 组均已形成明显肝硬化,弥漫性肝细胞脂肪变性,死亡率43.7%。结论 低剂量CCl 4诱导并给予普通饲料喂养可成功建立大鼠肝纤维化模型,并明显降低大鼠死亡率,提高了模型质量及实验效率。 关键词:四氯化碳;肝纤维化模型;改良;动物,实验;大鼠 中图分类号:R-332 文献标志码:A 文章编号:1000-2294(2011)07-0040-03 Improved Rat Model of Liver Fibrosis induced by CCl 4 SHAO Jia -liang,WAN Zan -yan,HU Guo -xin (Dep ar tment of I nf ectious Diseases ,the First A f f iliated H osp ital of N anchang Univ ersity , N anchang 330006,China) ABSTRACT:Objective To establish a rat m odel of liver fibrosis,and to improv e the classical CCl 4induction method.Methods Forty SD r ats (20female and 20male)w ere r ando mly divided into three gro ups.Gro up B (n =14)w as given intraperitoneal injection of 2mL kg -1of 40%CCl 4solution (a mix ture of CCl 4and peanut oil)tw ice a w eek and the feeding of no rmal complete diet.Gro up A (n =10)w as given intraperitoneal injection of 2mL kg -1of peanut oil tw ice a w eek and the feeding of nor mal com plete diet.Gro up C (n =16)w as given intr aper ito neal injec -tion of 5mL kg -1of 40%CCl 4solution tw ice a w eek and the feeding of diet containing 10%lar d and 2%cholesterol.Rats w ere killed at the end of 8w eeks,and the levels o f ser um ALT ,AST ,Alb,T P and A/G w ere determined by ELISA.The patho logical changes in liver tissue w ere ob -served by H E and M asso n staining.Results Liv er function w as damag ed apparently by CCl 4in -jectio n.Some specimens in g roup B pro duced false flo cculus and achieved the ear ly stage of liver fibro sis,w ith fatty deg ener ation in a few liver cells.A ll specimens in gr oup C had cirrhosis w ith diffuse hepatic steato sis.The m ortality w as 28.6%and 43.7%in gro up B and g roup C,respec -tively.Conclusion Liv er fibrosis can be induced by injection o f low do ses of CCl 4and feeding of norm al co mplete diet in rats.In addition,the improved m ethod can reduce the mortality and im -40南昌大学学报(医学版)2011年第51卷第7期 Jou rnal of Nanch ang University(M edical Science)2011,Vol.51No.7
肝纤维化的诊断指标及联合测定的临床意义
肝纤维化的诊断指标及联合测定的临床意义 大部分的慢性肝脏损伤都会引起肝纤维化和肝硬化，治疗终末期肝硬化的唯一有效手段就是肝移植，但是，即使是在发达国家，由于的供肝的不足和受者对手术不能耐受，肝移植技术无法完全解决肝硬化问题。近年来肝纤维化日益受到人们的重视，已成为肝病研究领域的热点。诸多病因如病毒、酒精、药物等所致的肝细胞炎症、坏死均可引起肝纤维化，肝纤维化为慢性肝病发展至肝硬化过程中的病理组织学变化，是发展到肝硬变的必经阶段.，其机理相当复杂，目前认为它主要是多种因素造成肝细胞外基质的过度增多和异常沉积，其主要成分包括胶原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖和弹力纤维。尤其我国是世界公认的乙肝大国，发病人数居高不下，肝纤维化继续发展可导致肝硬化外，部分可发生癌变。 现认为肝纤维化尚有逆转至正常肝的可能，而肝硬变则否，认为阻止或延缓肝纤维化的发生和发展就能治愈大部分慢性肝病患者，给予有效治疗还可防止发展为肝硬化、肝癌。因此，人们期望对肝纤维化作出早期诊断，如何诊断肝纤维化，超声波、影像等一旦发现多数已在中期以上肝硬化阶段，能够早期诊断肝纤维化的方法至今主要依靠肝活检，临床称之为金标准。但，因其属损伤性检查，患者多不愿接受，作为抗肝纤维化药物疗效考核指标更难，因需多次活检、穿刺部位及样本大小等有其局限性； 肝脏B超是了解肝脏形态结构的非创伤性检查； 常用的肝功能检查法仅反映肝脏炎症、坏死及功能的改变；在肝穿刺不易推广的情况下与肝纤维化相关的血清学诊断方法受到关注，其项目日益增加； 血清肝纤维化标志物测定是无创伤性的，是从生化代谢方面判定肝纤维化的活动度，可进行动态观察，虽不能代替肝活检，但其与肝纤维化程度密切相关，因此临床上有其实用诊断价值，现临床所测肝纤维化的血清学指标只反映了慢性肝病肝纤维化过程的某个阶段及成分的变化，其临床意义应作综合分析评价。 肝纤维化的诊断指标 肝纤维化的诊断指标四项内容：透明质酸、Ⅲ型前胶原、Ⅳ型胶原、层粘连蛋白。 透明质酸(hyaluronic Acid HA) 【正常参考值】血清：<100 ng/ml 【临床意义】HA是一种产生于间质细胞的氨基多糖，分子量4，000-8，000万，由肝内皮细胞摄取、降解，其广泛存在于结缔组织、皮肤、关节液及玻璃体液中，
肝纤维化机制
一：我的建议是在肝纤维化的检测和发展过程中引入星状细胞作为一个评价标准。 1..现在研究肝纤维化的中心很多都是放在肝星状细胞这一块。它是引起肝纤维化的主要细胞，它激活变成纤维母细胞然后分泌细胞外基质，促使纤维化发生。 2.星状细胞的激活标志是视黄醇(维生素A）的有无（有：未激活；无：激活）。 3.我们本来就打算做切片，所以不会增加额外的费用。还是HE染色？正常情况下能看到视黄醇的脂滴吗要确定切片需要观察的内容，以及可能出现的现象 4.假如松弛素有去纤维化的作用那么可以使含有视黄醇的星状细胞数目增多。（对比每周制成的切片，希望可以建立一个动态的视黄醇含量的分析过程）具体方法可以在完善以下文献资料： 肝纤维化是病毒性肝炎等各种慢性肝病向肝硬化乃至肝癌发展的必经途径和必然阶段，而肝星状细胞（HSC）的激活则是肝纤维化形成的中心环节，但其分子机制及其调控基因尚不十分清楚。就此，朱丽影教授开展了血小板衍生生长因子调节人肝星状细胞基因的研究，应用抑制性消减杂交和基因芯片两项分子生物学技术，筛选PDGF刺激人HSC前后表达有变化的基因，旨在从基因水平深入探讨肝纤维化形成的分子生物学“奥秘”，为临床确立抗肝纤维化新的治疗靶点提供新认识。 课题组利用抑制性消减杂交技术，成功筛选出13个上调表达的HSC基因，同时利用基因芯片技术，筛选出2个上调和11个下调表达的HSC基因。这些差异表达基因，涉及细胞分化、细胞信号传导、细胞结构、细胞成分、细胞周期、细胞凋亡、免疫调节、能量代谢等生物过程，揭示了PDGF参与肝纤维化的发生机制是以上多因素、多水平调控的结果。研究结果显示，在上调基因中，最具代表性的蛋白是层粘连蛋白B1。在下调基因中，最重要的蛋白是激酶MEKK。 肝星状细胞激活的分子机制与抗肝纤维化治疗 肝纤维化发生机制的研究进展陈乃玲贾克明2004-8-2 17:15:32 中华内科杂志1999年2月第38卷第2期 作者单位：100700北京军区总医院、解放军肝病研究所 一、肝纤维化时肝内的三个基本现象 肝炎后肝纤维化的病因一般认为是肝细胞坏死及凋亡所引起的，是组织坏死、凋亡时血流中血小板释放对纤维化有促进作用的因子———血小板衍生生长因子（platetetderivedgrowthfactor，pDGF）所致。然而在其他组织损伤时血流中也出现pDGF，却未见肝发生纤维化，说明pDGF可能不是肝纤维化的主要原因。肝脏发生纤维化时有三个基本现象值得重视：（1）肝细胞外基质的增加；（2）星状细胞转变为肌纤维母细胞；（3）
肝纤维化四项指导
肝纤四项 肝纤四项即肝纤维化四项检查，该检查主要用来检查诊断慢性肝病患者病情发展状况和治 疗效果，衡量炎症活动度、纤维化程度的重要依据。诊断肝纤维化需要进行肝纤四项检查。肝纤四项主要包括以下四个检查指标：（HA,LN,CIV,PIIINP，）其主要参考值： （<84ng/ml,<133ng/ml,<84ng/ml,<120ng/ml）。 1. PCIII （III型前胶原） 反映肝内III型胶原合成，血清含量与肝纤程度一致，并与血清γ－球 蛋白水平明显相关。PCIII与肝纤维化形成的活动程度密切相关，但无特异性，其它器官纤维化时，PCIII也升高。持续PCIII升高的慢活肝，提 示病情可能会恶化并向肝硬变形成发展，而PCIII降至正常可预示病情缓解，说明PCIII 不仅在肝纤维化早期诊断上有价值，在慢性肝病的预后判断上也 有意义。 血清PCⅢ水平与肝纤维化病变程度呈密切相关，反映肝纤维合成状况和 炎症活动性，早期即显著升高，而陈旧性肝硬化和部分晚期肝硬变、肝萎缩 患者血清PCⅢ不一定增高。 2. IV－C（IV型胶原） 为构成基底膜主要成份，反映基底膜胶原更新率，含量增高可较灵敏反 映出肝纤过程，是肝纤的早期标志之一。 1) 在肝纤维化时出现最早，适合于肝纤维化的早期诊断。 2) 能反映肝纤维化程度，随着慢迁肝→慢活肝→肝硬化→肝癌病程演病，Ⅳ-C胶原在血清含量逐步升高。 3)对重症肝炎和酒精性肝炎也显高值。 4)是药物疗效和预后观察重要依据，血清Ⅳ-C水平与肝组织学的改变完 全一致。 5)在与基底膜相关疾病可出现Ⅳ-C水平的异常,如甲状腺机能亢进,中晚 期糖尿病、硬皮病等。 3. LN（层粘连蛋白） 为基底膜中特有的非胶原性结构蛋白，与肝纤维化活动程度及门静脉压 力呈正相关，慢活肝和肝硬变及原发性肝癌时明显增高，LN也可以反映肝 纤维化的进展与严重程度。另外，LN水平越高，肝硬变病人的食管静脉曲张 越明显。 1）反映肝纤维化：正常肝脏间质含少量LN，在肝纤维化和肝硬化时， →肌成纤维细胞增多→大量合成和分泌胶原、LN等间质成分→形成完整的基 底膜（肝窦毛细血管化）。肝窦毛细血管化是肝硬化的特征性病理改变， LN与纤维化程度和门脉高压正相关，纤维化后期升高尤为显著。
四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化机理研究
四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化 机理研究 【摘要】目的观察四氯化碳腹腔注射制作大鼠肝纤维化模型时相关细胞因子 的变化，初步探讨四氯化碳腹腔注射致大鼠肝纤维化的机理。方法以四氯化碳腹腔注射的方法[四氯化碳 mL (用花生油1∶6稀释)/次，每周3次，共14周]制作大鼠肝纤维化模型，设立正常、溶剂对照组，检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原含量;ELISA法检测转化生因子ββ1)、肿瘤坏死因子α);化学法检测血清氧化亚 氮(NO)。肝行HE和Masson胶原染色，光镜下观察病改变，并按SSS计分系统进行评分。免疫组化染色观察肝组织血小板源生长因子的变化，专业像分析进行图像分析。结果与正常对照组、溶剂对照组比较，模型组血清ALT、AST、HA、LN、、NO、β1 、α明显升高
()，大鼠肝组织肝纤维化评分明显升高()，肝组织表达明显增多()。结论促进相关细胞因子的表达可能是四氯化碳腹 腔注射致大鼠肝纤维化的机理之一。 【关键词】四氯化碳;肝纤维化;细胞因子 Abstract:Objective To investigate the variation of correlated cytokine when the rat models of hepatic fibrosis were induced by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride,and to the relevant molecular mechanism. Methods Rat models of hepatic fibrosis were made by intraperitoneal injection of carbon tetrachloride at mL(diluted 1∶6 with peanut oil),three times a week,a total of 14 weeks. The normal and dissolvent groups were prepared as controls. Serum β1 and α were detected by ELISA method. Serum levels of NO were detected by
大鼠肝纤维化模型的制备
中文摘要 目的本文通过对SD大鼠腹腔注射四氯化碳以诱导大鼠肝纤维化动物模型。 方法取15只SD大鼠，180—220g，分为A组10只，B组5只，A组为模型组：40%CCL4橄榄油混合液按0.12ml/100g腹腔注射，一周两次，共八周。B组为对照组：纯橄榄油按0.12ml/100g腹腔注射，一周两次，共八周，八周后，禁食12小时处死全部大鼠，解剖取肝组织。病理学检测：HE染色，MASSON染色,PAS染色。基因学检测：1.3.4型胶原蛋白 结果八周试验期间B组大鼠全部存活，肝组织标本结构清晰，无异常情况；A组大鼠出现明显的病态，肝组织标本均已达到肝纤维化S3以上，多数标本可见小叶被纤维结构分割包围，假小叶形成，干细胞可见脂肪变性； 结论该方法肝损伤明显，死亡率低，周期短，能够成功作为慢性肝损伤，肝纤维化的模型。 关键词肝纤维化，四氯化碳，动物模型 Abstract Objective: Established animal model of hepatic fibrosis in rats induced by carbon tetrachloride. Methods: Take 15 SD rats,180-220g, divided into 10 group A, group B 5 只, A group of model group: 40% CCL4 0.12ml/100g by abdominal injection of a mixture of olive oil, twice a week, a total of eight weeks. Group B was the control group: pure olive oil press 0.12ml/100g abdominal injection twice a week, a total of eight weeks, eight weeks later, all rats were fasted for 12 hours were sacrificed, dissected liver tissue. Pathology: HE staining, MASSON staining, PAS staining. Genetics testing: 1.3.4 collagen Results: During the eight-week test group B rats survived, liver tissue specimens clear structure, no exceptions; significant morbidity A rat liver tissue fibrosis S3 have reached above, the majority of samples are split fiber structure visible lobular surrounded pseudo lobule formation, stem cell degeneration visible fat. Conclusion: This method obviously liver injury mortality, the period is short, to be successful as chronic liver damage, liver fibrosis model. Key words: Fibrosis, carbon tetrachloride, animal model 前言
肝纤维化形成机制的研究进展
肝纤维化形成机制的研究进展 丁 宁 (沈阳市传染病院,辽宁沈阳110006) 收稿日期:2008-05-12 修订日期:2008-06-03 作者简介:丁宁(1976-),女,主治医师,硕士,从事感染科工作。 【中图分类号】R57512 【文献标识码】A 【文章编号】1001-5256(2009)01-0073-05 肝纤维化(Hepatic fibr osis )是指肝脏纤维结缔 组织的过度沉积,是细胞外基质合成和降解不平衡的结果,是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径。目前认为肝纤维化的形成是由于各种损肝因子引起肝细胞损伤、坏死、凋亡及肝组织炎症反应,激活枯否细胞分泌多种细胞因子,与肝细胞、血小板及窦内皮细胞分泌的细胞因子、脂质过氧化物等化学递质,共同作用于肝星状细胞(HSC ),并激活转变为肌成纤维细胞发生表型及功能改变,通过旁分泌或自分泌机制,使肌成纤维细胞增殖,合成大量的胶原和蛋白多糖等细胞外基质(EC M )。在这一过程中细胞—细胞因子—基质之间相互作用,构成了复杂的网络系统,参与肝纤维化的发生及发展。1 细胞外基质111 正常肝脏的细胞外基质 正常肝内细胞外基质占肝湿重的015%。EC M 的组成包括胶原、非胶原性糖蛋白、蛋白多糖即细胞—基质黏附分子。11111 胶原 是细胞外基质最重要成分,目前已发 现人体共有19种基因序列不同的胶原蛋白,占人体蛋白总量的1/3。在肝脏含量较高的仅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型胶原,Ⅰ、Ⅲ型胶原各占33%,Ⅰ/Ⅲ型约为1,Ⅳ型胶原占1%。Ⅴ型占1%,Ⅵ型占011%-1%。 11112 非胶原糖蛋白 为EC M 的另一重要组分。 其分子中有多个功能区,可与其他EC M 及多种细胞膜的跨膜蛋白的受体结合,从而影响细胞的生长、分化、代谢等各种生物学行为。包括纤维连接蛋白、层连蛋白、Entactin (nidogen )、Tenascin (Hexabra 2chi on )、富含半胱氨酸的分泌性蛋白(SP ARC,Secre 2ted p r otein,acidic and rich in cysteine )血栓粘合素(Thr ombos pondin,TS -P )、玻璃体连接蛋白(V itr on 2ectin )。 11113 蛋白多糖(Pr oteoglycan,PG ) 由蛋白质作 为骨架,侧链为糖胺多糖(Glycosa m ino glycan, G AG ),依侧链不同可分为硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、透明质酸、无蛋白核心也属这一类,PG 中的G AG 是肝脏EC M 中的重要成分。正常肝脏每克去脂干重含水量(100-200)μg,其中HS 占(60-80)%,CS 占(1-15)%,PS 占(2-30)%,HA 占(115-15)%。11114 细胞-基质黏附分子 广义的EC M 还包括细胞-基质黏附分子,细胞和细胞外基质成分之间的分子相互作用就是通过特定的质膜蛋白(即各种黏附分子)来实现的。黏附分子主要包括整合素家族和CD 44蛋白家族。112 肝纤维化时细胞外基质 肝纤维化时,EC M 的量和质均发生显著改变。量的改变表现为肝内过量胶原形成及沉着,是3个因素综合作用的结果:11新的胶原合成增加,是由于单个细胞胶原合成能力增加或者合成胶原的数量增加;21已经形成的纤维凝集增加;31胶原降解减少,缘于基质金属蛋白酶(MMP )以及基质金属蛋白酶组织抑制剂(TI M P )表达改变。肝损伤早期MMP 一过性增加,且主要为MMP -2增加,降解基底膜,破坏正常基底膜结构,进一步促进HSC 活化,但随纤维化的进展MMP 下降,伴随TI M Ps 的表达上调,致TI M Ps/MMP 比值增加,胶原降解减少,结果总体EC M 增加(3-8)倍。 EC M 质的改变主要表现为EC M 在局部重建或 重新分布。早期主要沉积在D isse 腔内皮下,纤维 连接蛋白超过Ⅰ、Ⅳ型胶原及层粘蛋白,随后内皮下形成连续的基底膜,内皮窗孔消失,即肝窦毛细血管化,至晚期正常含非纤维形成胶原的低密度基底膜胶原(Ⅳ、Ⅵ型)转化为富含纤维形成胶原的高密度间质胶原(Ⅰ、Ⅲ型),E MC 亚群比例失调,不溶性Ⅰ型胶原显著增加取代Ⅲ型胶原而成为肝内主要胶原。 EC M 质和量的改变反过来又可激活静止状态 的HSC,进一步加重EC M 沉积,形成恶性循环。2 肝星状细胞是肝纤维化中EC M 的主要细胞来源 肝星状细胞位于肝细胞与肝窦内皮细胞(SEC )
什么是肝纤维化
1.什么是肝纤维化? 肝纤维化是指干细胞发生坏死及炎症刺激时，肝脏内纤维结缔组织异常增生的病理过程。几乎任何能造成慢性肝损害的病因都可导致肝纤维化。也就是说，慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、脂肪性肝炎(酒精性或非酒精性)、免疫性肝病、血吸虫病、药物性肝病等都可以引起肝纤维化。 2.什么是肝硬化？ 肝硬化是指有一种或多种原因长期或反复损害肝脏，导致广泛的肝实质损害，肝细胞坏死，纤维组织增生，肝正常结构絮乱，质地变硬。可并发脾肿大、腹水、浮肿、黄疸、食道静脉曲张、出血、感性昏迷等。 3.肝纤维化和肝硬化的关系？ 肝硬化发病机制的中心关键环节是肝脏进行性纤维化，但具体演变机制未明。研究认为是各种肝脏损害因素导致干细胞弥漫性反复变性坏死及炎症，进而大量纤维组织增生和残余肝细胞结节状再生，使得肝小叶原有结构和血液循环通路不断发生改建，从而最终形成肝硬化。 因为慢性肝病经由肝纤维化发展到肝硬化，后期乃至发生门静脉高压，腹水，肝性脑病甚至引起肝癌等严重并发症。所以如能阻断、减轻乃至逆转肝纤维化，就能在很大程度上改善肝病的预后。因此，肝纤维化的及时诊断和治疗，对于肝病病人的诊治有着重要的价值。
病毒性肝炎→弥漫性肝细胞变性坏死（结构破坏） 慢性酒精中毒→进行性肝纤维组织大量增生 胆管炎或长期於胆→（肝纤维化） 中毒或代谢疾病→残存肝细胞结节状再生 寄生虫感染（血吸虫病等）→（假小叶形成） 4.肝纤维化的血清学诊断的方法有哪些？ 肝纤维化并无特殊的临床症状的体征，因此其诊断主要靠病理组织学、血清标志物及影响手段。鉴于肝脏穿刺组织病理检查和影像检查两种诊断方法的局限性，人们一直致力于寻找血清学指标来监测肝纤维化的发展过程和判断抗纤维化的疗效。经过动物实验和临床病理研究发现了不少对诊断肝纤维增生有一定价值的指标。 肝纤维化不同诊断方法的比较
CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化模型
CCl4诱导的小鼠肝脏纤维化模型 肝纤维化是指肝脏内弥漫性细胞外基质（特别是胶原）过度沉积，不是一个独立的疾病，是许多慢性肝病共同的病理过程，几乎各种慢性肝病（化学毒性、感染性、遗传代谢性、自身免疫性，以及胆汁淤积性）都可以导致肝纤维化。 CCl4是诱导实验动物产生肝纤维化和肝硬化最广泛使用的化学性肝毒物。在肝细胞内质网中，经肝微粒体内依赖于细胞色素P450 的具有混合功能的氧化酶激活后，CCl4产生了自由CCl3·及Cl，它们与肝细胞内大分子发生共价结合，可攻击膜不饱和脂质，引发活性氧自由基的产生和脂质过氧化，损伤肝细胞，从而导致狄氏间隙内原本静止的贮脂细胞活化，释放出Ⅳ型胶原酶，降解Ⅳ型胶原。同时该细胞由合成分泌Ⅲ型胶原改为合成分泌I 型胶原，取代了Ⅳ型胶原，促使肝脏纤维化 1.实验动物 SPF级BablC小鼠，健康，雄性，体重为18g-20g 2.实验分组 实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。 3.实验周期 6W 4.主要试剂 CCl4（上海国药集团） 5.建模方法 按5ml/kg 体重皮下注射体积分数为20% CCl4的油剂溶液（CCl4：橄榄油=1:4）, 每3天1次，连续6W。对照组动物皮下注射等量等次的橄榄油溶剂。正常饮食饲养，观察动物活动、精神状况和饮食量,实验前后称量小鼠体重。 完成持续给药6W后，称体重，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80℃冰箱冻存。同时取肝左叶组织1.5cm×1cm×0.2cm于10%中性福尔马林中固定，石蜡包埋；其余肝组织液氮冷冻-80℃保存。 6.模型评价
肝纤维化的细胞分子机制研究进展
万方数据
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肝纤维化的细胞分子机制研究进展 作者：涂传涛， 王吉耀， Tu Chuantao， Wang Jiyao 作者单位：复旦大学附属中山医院消化科, 上海,200032 刊名： 中华肝脏病杂志 英文刊名：Chinese Journal of Hepatology 年，卷(期)：2014,22(1) 参考文献(37条) 1.Sohrabpour AA;Mohamadnejad M;Malekzadeh R Review article:the reversibility of cirrhosis 2012 2.Mallat A;Lotersztajn S Cellular mechanisms of tissue fibrosis.5.Novel insights into liver fibrosis 2013 3.Lemoinne S;Cadoret A;E1 Mourabit H Origins and functions of liver myofibroblasts 2013 4.Blois SM;Piccioni F;Freitag N Dendritic cells regulate angiogenesis associated with liver fibrogenesis 2014 5.Meng F;Wang K;Aoyama T Interleukin-17 signaling in inflammatory,Kupffer cells,and hepatic stellate cells exacerbates liver fibrosis in mice 2012 6.Seki E;de Minicis S;Inokuchi S CCR2 promotes hepatic fibrosis in mice 2009 7.Heymann F;Hammerich L;Storch D Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C-C motif chemokine receptor 8 in mice 2012 8.Pradere JP;Kluwe J;De Minicis S Hepatic macrophages but not dendritic cells contribute to liver fibrosis by promoting the survival of activated hepatic stellate cells in mice 2013 9.Mentink-Kane MM;Cheever AW;Wilson MS Accelerated and progressive and lethal liver fibrosis in mice that lack interleukin (IL)-10,IL-12p40,and IL-13Rα2 2011 10.Tu CT;Li J;Wang FP Glycyrrhizin regulates CD4+T cell response during liver fibrogenesis via JNK,ERK and PI3K/AKT pathway 2012 11.McHedlidze T;Waldner M;Zopf S Interleukin-33-dependent innate lymphoid cells mediate hepatic fibrosis 2013 12.Schuppan D;Kim YO Evolving therapies for liver fibrosis 2013 13.Connolly MK;Bedrosian AS;Mallen-St Clair J In liver fibrosis,dendritic cells govern hepatic inflammation in mice via TNF-alpha 2009 14.Coulon S;Heindryckx F;Geerts A Angiogenesis in chronic liver disease and its complications 2011 15.Taura K;De Minicis S;Seki E Hepatic stellate cells secrete angiopoietin 1 that induces angiogenesis in liver fibrosis 2008 16.Das A;Shergill U;Thakur L Ephrin B2/EphB4 pathway in hepatic stellate cells stimulates Erk-dependent VEGF production and sinusoidal endothelial cell recruitment 2010 17.Van Steenkiste C;Ribera J;Geerts A Inhibition of placental growth factor activity reduces the severity of fibrosis,inflammation,and portal hypertension in cirrhotic mice 2011 18.Yao Q;Lin Y;Li X Curcumin ameliorates intrahepatic angiogenesis and capillarization of the sinusoids in carbon tetrachlorideinduced rat liver fibrosis 2013 19.Xie G;Diehl AM Evidence for and against epithelial-tomesenchymal transition in the liver 2013 20.Popov Y;Schuppan D Epithelial-to-mesenchymal transition in liver fibrosis:dead or alive 2010 21.Scholten D;Osterreicher CH;Scholten A Genetic labeling does not detect epithelial-to-mesenchymal transition of cholangiocytes in liver fibrosis in mice 2010 22.Chen SW;Wu BY;Xu SP Suppression ofCB1 cannabinoid receptor by lentivirus mediated small interfering RNA ameliorates hepatic fibrosis in rats 2012 23.Szabo G;Bala S MicroRNAs in liver disease.Nat Rev Gastroenterol 2013 24.Roderburg C;Urban GW;Bettermann K Micro-RNA profiling reveals a role for miR-29 in human and murine liver fibrosis 2011