SDS
SDS-PAGE实验
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE），简称SDS电泳。SDS电泳技术首先在1967年由Shapiro等[55]建立，1969年由Weber和Osborn[56]进一步完善。他们发现在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS是一种阴离子去污剂，作为变形剂和助溶性试剂，能使分子内和分子间的氢键断裂，使分子失去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂如β-巯基乙醇(β-mercapto ethanal)则能够使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，在通电的条件下分子被解聚为组成它们的多肽链。解聚后的氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，这些胶束成椭圆棒状，其长轴的长度就与亚基分子质量的大小成正比。因此这种胶束在DS-聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质或亚基分子质量的大小。当蛋白质亚基的分子质量在15kDa到200kDa之间时，电泳迁移率与分子质量的对数成线性关系。由此可见，SDS电泳不仅可以分离蛋白质，还可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子质量。
分别选择1.0 mg/ml的BSA溶液和20μg/ml的胶原溶液以及两者的混合溶液，将样品置于其中浸泡，分别在5、15、30、60min、2、4、24h取出样品，放在1%的SDS溶液中振荡过夜，将样品表面的蛋白质脱附下来，而后取出样品，冷冻保存液体准备SDS-PAGE实验。
将样品从浸泡溶液中取出后用1%的戊二醛溶液固定后置于染色剂中振荡染色，随后取出用PBS反复冲洗2-3次，然后立即放到荧光倒置显微镜下进行
观察。
4.3.6 SDS-PAGE分析
图4.11所示为BSA吸附的样品，经过SDS-PAGE凝胶电泳后的凝胶经考马斯亮蓝R-250染色后的凝胶图样，从图中可以清晰的观察到BSA（66.4KDa）的蛋白质条带，说明当材料浸入BSA蛋白溶液后，BSA可以迅速的吸附到样品表面，并且随着时间的延长保持动态吸附行为。而胶原吸附
图4.11 考马斯亮蓝R-250染色BSA吸附不同时间点的样品的PAGE凝胶图样（取样时间点:1#为5min，2#为10min，3#为15min，4#为30min，
5#为60min，6#为2h，7为#1d）
图4.12考马斯亮蓝R-250染色胶原吸附不同时间点的样品的PAGE凝胶图样（取样时间点:1#为5min，2#为10min，3#为15min，4#为30min，
5#为60min，6#为2h，7#为12h，8#为1d）
后的凝胶图样如图4.12所示，图中同样可以看到胶原的蛋白条带，说明胶原在表面存在吸附，但是由于胶原含量较少，所以条带的颜色较浅，并且可以发现在吸附15min和30min时没有蛋白条带的显示，可认为这时出现了胶原
图4.13考马斯亮蓝R-250染色BSA-胶原吸附不同时间点的样品的PAGE凝胶图样（取样时间点:1#为5min，2#为10min，3#为15min，4#为30min，
5#为60min，6#为2h，7为#1d）
的解吸附，导致了样品表面蛋白质含量极少，不足以达到检测的最低含量。
对于两种蛋白质同时存在的情况，其SDS-PAGE电泳后染色的凝胶图样如图4.13，图中分别显示了BSA和胶原的蛋白条带。说明两种蛋白同时存在时，每种蛋白质都会在表面发生吸附，但在样品刚进入溶液初期，首先是BSA的吸附，胶原尚未发生吸附。这说明共存吸附初期两种蛋白质之间存在竞争吸附，即此时BSA可能对于胶原的吸附有一定抑制作用。而随着时间的推移，胶原才开始吸附，随后约30min时胶原条带再次消失，这就证明了胶原吸附过程中解吸附的现象。图中看出BSA在整个吸附过程中吸附较平稳，且吸附量较多，而胶原较单独存在时解吸附的时间有所缩短，认为可能两种蛋白质共存时，除初期有竞争吸附外，彼此之间还存在促进吸附的作用。
SDS-PAGE检测表达蛋白实验原理和操作步骤
2010-04-06 16:49:50 来源：易生物实验浏览次数：396 网友评论0 条
蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗。
关键词：蛋白SDS-PAGE表达蛋白蛋白质SDS十二烷基磺酸钠考马斯亮蓝超声波破碎仪
1．目的
学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白。
2．原理
蛋白质在加热变性以后与SDS结合，带上负电荷，在电场的作用下，向正极移动，结果按分子量大小排列在胶板上，含量多的蛋白带纹粗。
3．器材
旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，超声波破碎仪，电磁炉，电泳仪，垂直电泳槽及配套的玻璃和密封条、梳子等。
易生物仪器库：https://www.wendangku.net/doc/5610320830.html,/yp/product-list-42.html
易生物试剂库：https://www.wendangku.net/doc/5610320830.html,/yp/product-list-43.html
4．试剂
SDS（十二烷基磺酸钠），Acr（丙烯酰胺），Bis（N,N’-亚甲基双丙烯酰胺），Tris（三羟甲基氨基甲烷），甘氨酸，盐酸，Aps（过硫酸氨），TEMED（四甲基乙二胺），蛋白分子量标准（97.4，66.4，44.3，29.0，20.1，14.3 kDa），溴酚蓝，甘油，冰醋酸，乙醇，b-2-巯基乙醇，考马斯亮蓝R250，甲醇，乙醇。
5．实验准备
1.0mol/L Tris HCl，pH8.8（4°C保存）；0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8（4°C保存）；10%SDS（室温保存）；30%Acr/Bis（30g Acr+0. 8g Bis dd water 定容至100ml，4°C保存）；10%Aps （-20°C保存）；2′上样缓冲液（0.5mol/L Tris HCl，pH6.8 2ml，甘油2ml，20%SDS 2ml，0.1%溴酚蓝0.5ml，b-2-巯基乙醇1.0ml，ddH2O
2.5ml，室温存放）；5′电泳缓冲液（Tris 7.5g ，甘氨酸36g，SD S 2.5g，加ddH2O至500ml，使用时稀释五倍）；考马斯亮蓝染色液（考马斯亮蓝R250 0.25g + 45ml甲醇+10ml冰醋酸，用ddH2O 定容至100ml）；脱色液（95%乙醇：冰醋酸：水= 4.5：0.5：5，体积比）；
6．操作步骤
（1）将表达后的菌体与2′上样缓冲液按1：1混匀于微量离心管中。
（2）用超声波破碎仪脉冲10次，每次10秒。中间间隔时放入冰中降温。注意一定要将超声波探头插入溶液底部，在溶液表面或上部时容易起泡！
（3）将上述微量离心管插入水漂中，放在电磁炉锅里的沸水中煮3~5min。然后立即插入冰中。（可在-20°C冰柜中保存）。
（4）按照教师的演示组装电泳玻璃并用细橡胶管密封底部和侧面然后用夹子夹住（不能夹玻璃的上端以免夹断玻璃的突出段！）。插入梳子后在玻璃上距离梳子齿底部1cm的地方做一个标记。
（5）配制10%分离胶。按顺序和量（注意体积单位！）取下列溶液混在一个50ml的小烧杯中（注意Tris为pH8.8）：
Acrylamide-bis 3.96 ml
1M Tris PH8.8 4.38 ml
ddH2O 3.432 ml
10% SDS 118.8 μl