新型表达骨形态发生蛋白2腺病毒真核细胞载体的构建和鉴定

新型表达骨形态发生蛋白2腺病毒真核细胞载体的构建和鉴定

（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）

作者：张正，刘丹平，陈峻江，郭韬，张男

【摘要】目的构建同时表达具有抗原表位FLAG标记的骨形态发生蛋白2(BMP2)目的蛋白和报告分子绿色荧光蛋白(GFP)的新型腺病毒真核细胞表达载体。方法将去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别位点XhoⅠ的BMP2基因定向连入腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1。携带BMP2+基因的重组腺病毒穿梭质粒经酶切鉴定、PmeⅠ酶切线性化后转化BJ5183-AD-1大肠杆菌，利用细菌内同源重组机制将BMP2+和GFP基因连同其顺势表达元件重组入腺病毒基因组质粒。用PacⅠ酶切去除其质粒成分，暴露腺病毒基因组的反向末端重复序列，转染293细胞，进行腺病毒的包装，完成新型腺病毒载体Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1的构建。作为阳性对照，同时制备多年来广为应用的 BMP2腺病毒表达载体Ad CMV-BMP2。以两种载体感染骨髓基质细胞，通过RT-PCR和荧光显微镜分别检测骨形态发生蛋白2和绿色荧光蛋白表达情况;通过碱性磷酸酶活性检测判断BMP2诱导成骨分化作用。结果突变后骨形态发生蛋白2基因序列、重组腺

病毒穿梭质粒和重组腺病毒质粒酶切图谱符合预定设计。感染骨髓基质细胞后，新型腺病毒载体可同时表达报告分子GFP和具有诱导成骨分化活性的BMP2。结论成功构建表达BMP2的新型腺病毒载体。

【关键词】骨形态发生蛋白2基因;绿色荧光蛋白;腺病毒载体;同源重组;成骨诱导

Abstract: Objective To construct a novel recombinant adenovirus vector expressing the BMP2 fused to FLAG epitope and green fluorescent protein(GFP) as a reporter on the same transcript. Methods The basic pairs of BMP2 behind the translation stopping codon TAG were removed and a XhoⅠrestriction site was added following the end of the mutant. Then, the mutant of BMP2 gene (BMP2+ gene)was ligated into the multiple cloning sites of the adenovirus shuttle plasmid pShuttle CMV-IRES-hrGFP-1 by means of the directional cloning technology. Once tested by restriction digestion, the shuttle plasmid was linearized with Pme I and transformed into BJ5183-AD-1 cells to recombine the genes of BMP2+ and GFP together with their cis-acting elements into adenoviral plasmid through a new simplified bacterial homologous recombinant method. To expose its inversted terminal repeats, the recombinant adenoviral plasmids were digested with Pac Ⅰ, and were then used to 293 transfected cells to generate the

desired recombinant adenoviruses, Ad CMV-BMP2+-IRES-GFP-1. After the resultant viruses infected the bone marrow stromal cells (MSCs), the expression of BMP-2 gene was verified by RT-PCR, the osteoinduction activity of the expressed BMP2 was confirmed by alkaline phosphatase activity assay, and the expression of GFP gene was tested through fluorescence microscope. As a positive contrast, another recombinant adenovirus, AdCMV-BMP2, which has been used extensively since many years ago, was also constructed.Results Either the sequence of BMP2 gene mutant or the restriction maps of the recombinant adenoviral shuttle plasmids and the recombinant adenoviral plasmids accorded with experimental project beforehand. The new recombinant adenovirus vectors could express both the gene of BMP2 and GFP at the same time. The expressed BMP2 had osteoinduction activity. Conclusions A novel recombinant adenovirus vector expressing the BMP2 fused to FLAG epitope and green fluorescent protein as a reporter on the same transcript were successfully constructed.

Key words: bone morphogenetic protein 2 (BMP2) gene; green fluorescent protein (GFP); adenovirus vector; homologous recombination; osteoinduction

重组腺病毒在基因治疗中被作为一种高效基因转移和表达载体，

广泛用于将外源基因导入哺乳动物细胞[1]。骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2 ,BMP-2)是一种重要的成骨诱导分化细胞因子，可诱导具有成骨分化潜能的间充质细胞向成骨细胞分化，在骨的发生、发育、修复和再生过程中发挥十分关键的作用。BMP-2转基因诱导成骨可实现一定时间内的BMP-2持续表达，近十年来受到广泛关注。迄今为止，病毒型和非病毒型BMP-2表达载体都已被用于BMP-2基因转移诱导成骨研究，其中BMP-2腺病毒表达载体(BMP2-expressing recombinant adenoviral vector,Adv-BMP2)介导的BMP-2转基因方法被认为是其中最有效的手段[2]。为了方便基因的表达检测，我们利用了一种新型的腺病毒载体构建系统，使BMP2基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因同时表达，并且通过对BMP2基因的突变，将FLAG抗原标记附加于BMP2，构建了一种新型的BMP2腺病毒表达载体。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

限制性内切酶:NotⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ;高保真DNA聚合酶(TaKaRa PyrobestTMDNA Polymerase);大肠杆菌来源的碱性磷酸酶(Bacterial Alkaline phosphatases ,BAP);dNTP;T4DNA连接酶(T4DNA Ligase);DNA凝胶回收试剂盒;RT-PCR试剂盒和DNA Marker：DL1500、DL2000、λHandⅢdigest等购于宝生物工程(大连)有限公司。限制性内切酶PmeⅠ、Pac I购于纽英伦(北京)生物技术有限公司。PCR提纯试剂盒(PCR Purification Kit)，磷酸钙转染试剂盒

(MBS Mammalian Transfection Kit)为美国Stratagene公司产品。超纯质粒提纯试剂盒(MobiusTM 1000 Plasmid Kit )为德国Novagene 公司产品。ALP检测试剂盒(Alkaline/Acid Phosphatase Assay Kit)购于美国upstate公司。

1.2 质粒和菌株

pcDNA3-BMP2由第四军医大学生化教研室蒲勤教授提供，BMP2基因cDNA位于多克隆位点NotⅠ、XhoⅠ位点之间，后者在基因连入过程中已经被破坏。

pcDNA3-BMP2+(BMP2+代表携带去除翻译终止密码子并添加新的酶切识别位点XhoⅠ的BMP2基因)、腺病毒穿梭质粒pShuttle CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1及pShuttle CMV- BMP2均由我们自己构建和保存[3]。

BJ5183-AD-1大肠杆菌为Stratagene公司产品。

1.3 细胞及细胞系

人胚肾293细胞系为American Type Culture Collection( ATCC)产品。

骨髓基质细胞由本院外科实验室培养、保存。

1.4 细菌内同源重组构建腺病毒质粒

将含有pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1质粒和pShuttle CMV-BMP2质粒的菌株分别化线接种于LB-Kanamycin Agar,37 ℃倒置培养过夜;次日挑选单克隆,分别接种于10 mL LB-Kanamycin Broth，37 ℃、剧烈振荡、过夜培养;第二日上午用碱裂解法抽提质粒抽提质

粒， Pme Ⅰ酶切，1%琼脂糖凝胶电泳验证，确保穿梭质粒已经被Pme Ⅰ酶切线性化。乙醇精制以上酶切反应体系，重新溶解于ddH2O中，使终浓度为50～100 ng /μL，备用。电穿孔仪设置在200 Ω, 2.5 KV, 25 μF条件下。冰上预冷0.2 cm gap电击杯、电击池和2只微量离心管。冰上解冻BJ5183-AD-1电感受态细胞。于2只微量离心管中各加入40 μL电感受态细胞胞，分别加入1 μL Pme Ⅰ酶切线性化的pShuttle CMV-BMP2+-IRES-hrGFP-1和pShuttle CMV-BMP2,混合均匀后加入2支0.2 cm gap电击杯。将电击杯置于电击池内，送入电穿孔仪分别电击。电击后迅速向每只电击杯中加入500 μL的LB-Broth，吸打混均，接种于LB-Kanamycin Agar,37 ℃倒置培养过夜。次日挑选10个单克隆，分别接种于10 mL LB-Kanamycin Broth，37 ℃、剧烈振荡、过夜培养。取5 mL过夜培养物抽提质粒， Pac Ⅰ酶切，在0.8%琼脂糖凝胶上电泳鉴定，筛选重组成功的阳性克隆。剩余的4mL置于4 ℃冰箱保存。将保存的4 mL阳性细菌克隆液体培养物接种于250 mL LB-Kanamycin Broth，大量扩增、用超纯质粒提纯试剂盒抽提pAd CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1和 pAd CMV-BMP2。

1.5 腺病毒载体包装

PacⅠ酶切pAd CMV- BMP2+-IRES-hrGFP-1和 pAd CMV-BMP20.8%琼脂糖凝胶电泳验证，确保酶切完全后，以PCR反应提纯试剂盒精致酶切反应液，以去除酶和缓冲液，并将DNA(腺病毒基因组)重溶于灭菌ddH2O ，使终浓度为5 μg/225 μL ，-20℃保存备用。

常规复苏和传代培养293细胞，转染前24 h在2支直径6 cm培

养皿内分别植入(7～8) × 105细胞，加 4 mL含10胎牛血清的DMEM 培养基，在37 ℃，5% CO2 条件下过夜培养至70%汇合。

以 5 μg DNA/只培养皿比例，将上述制备的两种腺病毒基因组DNA及转染试剂按照商家说明分别加入细胞培养皿中，37 ℃，5% CO2温育10 h，用磷酸钙法将腺病毒基因组DNA转染于293细胞。继续培养7～10日，必要时换液，待出现明显细胞病变现象后收集细胞，反复冻-融三次裂解细胞，离心收集病毒并测定病毒滴度，完成腺病毒载体的包装。

1.6 BMP2和GFP表达检测

将MSC细胞以5×105/孔的密度接种于6孔板，常规培养24 h 细胞贴壁后，吸弃上清。随机选取 2 孔感染腺病毒Ad-CMV - BMP2+-IRES-hrGFP-1 ，另取2 孔感染Ad CMV-BMP2作为阳性对照，感染复数(MOI)均为50，留下2孔作为阴性对照。37 ℃孵育1 h，换成DMEM+10%胎牛血清培养基，在体积分数为5%CO2、37 ℃饱和湿度条件下继续培养72 h,荧光显微镜下检测GFP,然后按商家产品说明,用RNA提纯试剂盒抽提细胞总mRNA。置于-80 ℃冰箱保存待用。

取3 种RNA 各约80 ng加入3 支反应管内，以8.5 μL去RNA 酶ddH2O稀释，75 ℃变性5 min，冰上冷却。按商家说明建立反应体系，反转录BMP2基因cDNA第一链。反应结束后冰上冷却5 min备用。

设计合成BMP2基因cDNA特异引物：5′-CGTGACTCTGTCTTCTAG-′3 ;5/-GCACACTCGAGGCGACAC-′3。PCR扩增

BMP2 cDNA，取10 μL在以1%琼脂糖凝胶电泳检测。BMP2基因在三组细胞内的mRNA 表达情况。

1.7 碱性磷酸酶活性检测

将第二代MSC细胞以1×103/孔的密度接种于96 孔板，在完全培养基内， 5%CO2、37 ℃、饱和湿度条件下培养24 h。随机选取32孔作为实验组(感染腺病毒Ad-CMV - BMP2+-IRES-hrGFP-1， MOI=50);另选32孔作为阳性对照组(感染Ad CMV-BMP2， MOI=50);其余32孔作为阴性对照组(不予感染腺病毒载体)。37 ℃孵育1 h，小心吸除个孔内的液体，用PBS清洗实验组和阳性对照组各孔两次，然后用完全培养基继续在5%CO2、37℃、饱和湿度条件下培养各组细胞。分别于感染载体后第6、8、10、12日收集各组细胞，每次各组均收集8孔，调整各孔细胞浓度为1×105cells/mL,各取1 mL用于ALP活性检测。绘制ALP活性曲线;对三组细胞6、8、10、12日4个时间点的ALP活性采用发样本均数两两比较q检验，进行统计学分析，以P0.05的差异具有显著性。

1.8 采用重复测量的方差分析。

2 结果

2.1 腺病毒质粒的构建见图1、2。

2.2 ALP活性检测结果见表1。表1 不同时间3 组细胞间ALP 活性比较注：三组比较F值=4.32，P0.05;q1.3=4.67，P0.01;q2.3=4.64，P0.01;q1.2=0.47，P0.05

3 讨论

3.1 新型BMP2腺病毒载体的构建

细菌内同源重组法是一种高效构建腺病毒载体的方法[4]，这种方法首先需要构建带有目的基因的腺病毒穿梭质粒，然后将其与腺病毒骨架质粒共转BJ5183大肠杆菌，通过细菌内同源重组机制将目的基因及其在真核细胞中表达所必需的顺势表达元件插入腺病毒基因组。pShuttle CMV -IRES-hrGFP-1是美国Stratagene公司开发的一种新型腺病毒穿梭质粒，具有CMV启动子、多克隆位点和PolyA信号区等真核基因表达所必需的顺势调控元件和同源重组序列。并且在多克隆位点后依次设计安排了FLAG抗原表位(FLAG epitope, FLAG为人工合成抗原表位，其氨基酸残基序列为DYKDDDDK)基因、内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site ,IRES)和GFP基因。由于IRES的存在，使插入多克隆位点的目的基因能与GFP基因以双顺反子的形式同时表达。双基因表达载体是载体构建新的发展方向，以双顺反子形式表达GFP报告基因和BMP2目的基因，同时能够对BMP2进行抗原表位标记的腺病毒表达载体可极大的方便BMP2蛋白表达检测，目前尚未见报道，是一种新的尝试。

实验通过PCR技术突变去除pcDNA3-BMP2所携带的BMP2基因序列中翻译终止密码子后的碱基序列，在其后添加XhoⅠ位点。添加Xho Ⅰ位点后使基因能够定向连接于pShuttle CMV -IRES-hrGFP-1多克隆位点中的NotⅠ和XhoⅠ之间。去除翻译终止密码子之后碱基的BMP2基因序列从翻译起始密码子到FLAG抗原表位基因的碱基序列长度为1194bp，不会导致FLAG抗原表位基因的框移突变，而且由于去

除了BMP2基因的终止密码子，导致两个基因的通读，使两种蛋白融合表达。重组腺病毒穿梭载体制备成功后，利用BJ5183细菌内的同源重组机制，构建了腺病毒质粒Ad CMV-BMP2+-IRES-rhGFP-1和Ad CMV-BMP2。PacⅠ酶切图谱表明在不同BJ5183重组阳性克隆内，由于穿梭质粒和腺病毒质粒均存在DNA原核复制起点Ori序列，重组成功的腺病毒质粒经PacⅠ酶切后应该产生一个大于23kb的DNA 片段和约3.0kb或4.5kb的小片段两种均可以接受的情况。在已经鉴定的Ad CMV-BMP2+-IRES-rhGFP-1阳性克隆中，这两种情况均已出现。而已鉴定的Ad CMV-BMP2阳性克隆， PacⅠ酶切仅产生23kb和3.0kb 两种长度的DNA酶切片段(图1、图2)。

实验中采用了先进的细菌内同源重组法来构建腺病毒载体，从而大大节省了时间与费用。与目前普遍采用的哺乳动物细胞内同源重组法相比，这种方法具有简便、快捷、经济和高效等优势。前者在293等包装细胞内进行同源重组，细胞的状态对重组效率影响很大，通常要求传代次数不得超过45代，因此有时不得不重复引进代数较低的293细胞;另外，293细胞既是同源重组的场所，又是病毒的包装的场所，包装后的病毒需要经过反复的筛选、鉴定和纯化[5]。后者是对细菌操作，其培养、转化和重组克隆的筛选远较细胞方便、快捷和经济，技术也较成熟，从质粒转化到重组克隆的出现仅需12～20 h，加上筛选的时间也不过36 h;最重要的是，重组DNA(腺病毒质粒)经鉴定后在293细胞内包装，不需要再对病毒进行筛选和鉴定，病毒滴度和纯度都较高。

3.2 新型BMP2腺病毒载体的表达分析

为了检测所构建的新型载体表达GFP和BMP2情况，进一步将其和阳性对照载体分别转染骨髓基质细胞(MSCs)，同时用未转染载体的MSCs作阴性对照。转染3天后，首先在荧光显微镜下对活细胞进行观测，结果显示感染新型载体的细胞表达GFP(图3)。然后分别收集裂解三种细胞，提取其RNA，设计合成BMP2基因特异的正、反向引物，进行RT-PCR检测。PCR产物电泳结果显示，从转染两种重组腺病毒载体的MSCs中，均扩增出长度一致的DNA片段，这一长度符合预期设计(两引物间跨度为1190bp)，而阴性对照没有扩增出任何DNA 片段，从而在mRNA水平上证实了载体表达BMP2基因的可行性(图4)。为了进一步验证载体表达产物(BMP2)的成骨诱导效应和初步了解其时间动力学规律，实验中对MSCs感染载体前后的ALP活性进行了检验，并选用感染后6、8、10、12日几个时间点对其进行了连续观测。ALP是成熟成骨细胞具有代表性的标志酶，具有水解有机磷酸物质，提高局部磷酸根浓度和水解破坏钙化抑制剂等重要功能，在体内外钙化过程中发挥关键作用，ALP升高是MSCs向成骨细胞转化的灵敏指标[6]。感染后第6日检测结果经统计学分析显示，新型载体和阳性对照载体均可以显著提高MSCs的ALP活性水平(P 0.01)，两种载体效应差异无显著统计学意义(P0.05)，因而在表达产物的生物学行为层次上也证明了新型载体表达BMP2基因的可行性(表1)。以连续观测结果绘制的曲线图(图5)显示，细胞感染载体后8日内ALP活性升高幅度较大，说明载体表达BMP2量或其生物活性是十分高的，短期

内即可发挥明显的生物学效应;10天后上升速度明显减慢，曲线趋于平缓，ALP活性维持在一个较高水平，这可能与此时细胞生长、分化或BMP2作用已经接近饱和有关，实验中我们观察到，此时细胞生长已经铺满培养板各孔底部。从曲线图中还可以看到，MSCs本身有一定的基础表达，但水平较低，曲线基本上呈一条平滑的基线，这是因为实验所应用的MSCs是基于骨髓基质干细胞的帖壁特点获得的，并非单一的细胞类型，其中包含有少量具有分泌ALP能力的细胞类型，如成骨细胞和确定性成骨祖细胞(DOPC)等。

实验所构建的BMP2腺病毒表达载体与以往的BMP2腺病毒载体不同，它可以同时表达具有抗原表位标记的目的蛋白BMP2和报告分子GFP，这使新载体比原有载体具有很大的优势。首先，引入报告分子GFP使检测活细胞BMP2表达成为可能。因此，一方面可以即时监测表达情况;另一方面，细胞经检测后仍然可以用于后续实验[7]。其次，引入FLAG抗原标记增加了对目的基因的检测手段，这在缺乏目的基因特异性单克隆抗体的情况下尤为重要[8]。

【参考文献】

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protein gene therapy[J]. Spine,2002 ,27(16 Suppl 1): 87-93.

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[6] Prickett KS,Amberg DC,Hopp TP. A calciumdependent antibody for identification and purification of recombinant proteins[J]. Bio Techniques, 1989,7:580-589.

[7] Yanne M，Michel, Andrew M, et al. Eukaryotic Initiation Factor 4G-Poly(A) Binding Protein Interaction Is Required for Poly(A) Tail-Mediated Stimulation of Picornavirus

Internal Ribosome Entry Segment-Driven Translation but Not for X-Mediated Stimulation of Hepatitis C Virus Translation[J]. Mol Cell Biol, 2001,21(13): 4097–4109.

[8] Prickett KS,Amberg DC,Hopp TP. A calciumdependent antibody for identification and purification of recombinant proteins[J]. Bio Techniques, 1989,7:580-589.

重组人骨形态发生蛋白4说明书

重组人骨形态发生蛋白4说明书 产品名称 通用名称：重组人骨形态发生蛋白4 骨形态发生蛋白是TGF-β超家族的成员之一，最初因其能诱导骨和软骨的形成而得名，对骨骼的胚胎发育 和再生修复其重要作用。随着研究的深入，发现BMPs参与调节多种细胞的增殖、分化和凋亡的生物学国 产，在胚胎发育、出生后个组织器官内环境稳定及多种肿瘤的发生中都有重要作用，BMP4与人类肿瘤密切 相关。近期研究显示，BMP4在乳腺、前列腺及肝脏等多种肿瘤组织中的表达均高于正常组织，并与肿瘤的 侵袭和转移以及患者的生产期呈正相关。 使用说明 如需分装，可用注射用水、生理盐水、培养基或PBS稀释，稀释后浓度保持在100ug/mL以上。 稀释后置于-20℃保存期6个月，-80℃保存期12个月。 参考文献 1、van den Wijngaard A, Weghuis DO, Boersma CJ, van Zoelen EJ, Geurts van Kessel A, Olijve W (Nov 1995). "Fine mapping of the human bone morphogenetic protein-4 gene (BMP4) to chromosome 14q22- q23 by in situ hybridization". Genomics 27 (3): 559–60. doi:10.1006/geno.1995.1096. PMID 7558046. 2、 Oida S, Iimura T, Maruoka Y, Takeda K, Sasaki S (Nov 1995). "Cloning and sequence of bone morphogenetic protein 4 (BMP-4) from a human placental cDNA library". DNA Seq 5 (5): 273–5. doi:10.3109/10425179509030980. PMID 7579580. 3、Kn?chel S, Dillinger K, K?ster M, Kn?chel W (November 2001). "Structure and expression of Xenopus tropicalis BMP-2 and BMP-4 genes". Mech. Dev. 109 (1): 79–82.

细胞形态观察

实验二细胞形态观察 一、实验目的： 1. 认识人体及植物细胞的基本形态； 2. 认识红细胞和白细胞的构造特点； 3. 掌握临时装片和血涂片的制备方法； 4. 掌握光学显微镜的使用方法以及光镜下所见细胞的绘图记录方法。 二、实验原理： 细胞是生物体结构和功能的基本单位，构成高等生物体的细胞种类繁多、形态各异。由于大多数细胞体积微小，必须借助光学显微镜才能被观察到，并且大多数细胞是透明的，须经染色处理，才能看清细胞结构。在普通光学显微镜下，一般可见的基本细胞结构为细胞膜、细胞质和细胞核3个部分。 三、实验器具、材料与试剂： 1．器具：光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、牙签、吸水纸、染缸、一次性医学取血针、 2．材料：洋葱、西红柿、 3．试剂： （1）1%碘液：1g碘片、2g碘化钾溶于100mL 80%的乙醇或蒸馏水中即可。 （2）75%酒精 （3）Giemsa-Wright联合染液 四、实验内容与方法： 1．植物细胞形态观察： （1）洋葱鳞茎表皮细胞（平面）的标本制备与观察： 制片：取干净载玻片，中央滴一滴2%碘液；取洋葱肉质磷叶，用镊子 在其内表面轻轻撕取一小块方形膜质表皮（边长3-4mm），置于载玻片 的碘液滴中，铺平，用镊子夹取干净的盖玻片，将其一侧先接触标本旁

的碘液，再缓缓的盖上盖玻片，尽量避免产生气泡，用滤纸吸去盖玻片周围的液体。 观察：先用低倍镜观察，再用高倍镜；绘制并描述观察到的细胞形态。（2）番茄果肉细胞（立体）的标本制备与观察： 制片：掰开番茄的果实，用牙签挑一些熟透的果肉放在载玻片上，加1滴稀释的紫药水（2-3滴水加1滴紫药水），盖上盖玻片，在玻片上轻轻地压一下。 观察：置显微镜下观察，可见立体细胞，轻轻推动一下盖玻片，就能看到分离的果肉细胞在滚动，这样细胞的几个面就看的很清楚。注：水太多，推片时就看不到细胞滚动，可以用吸水纸在盖玻片的边上吸去。2．人体细胞形态观察： （1）人口腔黏膜上皮细胞标本的制备与观察： 制片：吸取1滴碘液在载玻片中央，用牙签伸入自己的口腔内壁轻轻刮取黏膜上皮细胞，然后将其放入载玻片上的染液中，来回搅动使细胞散开； 染色1min左右，小心加盖盖玻片，尽量避免产生气泡，用滤纸吸去盖玻片周围的液体。 观察：先用低倍镜寻找口腔上皮细胞，该细胞体积小、着色淡，寻找时应稍降低视野中的亮度。选择轮廓清晰地细胞移至视野中央，用高倍镜观察。 描述观察到细胞。 （2）血涂片的制备与血细胞观察： 采血与涂片：75%酒精棉，对左手无名指进行表面消毒，待酒精挥发后，用一次性采血针刺破指尖，用右手压挤这个伤口两旁，挤出血来，用载玻片与血滴接触取血。另取一片载玻片与前玻片上的血滴接触，使两玻片成40°～45°角，血滴就沿玻片边缘散开在两玻片的接触面上。迅速向前推动载玻片，使血在载玻片上形成血膜。血要涂得快、涂得薄，否则，血细胞重叠，不易观察。 染色：待血干燥后，在血涂片上滴上适量的Giemsa-Wright染液，要求盖上血膜。1-2min以后用等量的蒸馏水滴在染液上，轻摇玻片，使之充分混合。再静止3-5min后，用清水漂洗直到血涂片呈淡红色为止，干燥后

真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo 基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin 抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug 说明: pBluescript II kS、pUC18 &Puc19载体适合于DNA片段的克隆、DNA测序和对外源基因进行表达等。这些载体由于在lacZ基因中含有多克隆位点，当外源DNA片段扦入，转化lacZ基因缺乏细胞，并在含有IPTG和X-gal的培养基上培养时，含有外源DNA载体的细胞将

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体 标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要: 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris应用最多。

真核生物基因表达的调控

真核生物基因表达的调控 一、生物基因表达的调控的共性 首先，我们来看看在生物基因表达调控这一过程中体现的共性和一些基本模式。 1、作用范围。生物体内的基因分为管家基因和奢侈基因。管家基因始终表达，奢侈基因只在需要的时候表达，但二者的表达都受到调控。可见，调控是普遍存在的现象。 2、调控方式。基因表达有两种调控方式，即正调控与负调控，原核生物和真核生物都离不开这两种模式。 3、调控水平。一种基因表达的调控可以在多种层面上展开，包括DNA水平、转录水平、转录后加工水平、翻译后加工水平等。然为节省能量起见，转录的起始阶段往往作为最佳调控位点。 二、真核生物基因表达调控的特点 真核生物与原核细胞在结构上就有着诸多不同，这决定了二者在运行方面的迥异途径。真核生物比原核生物复杂，转录与翻译不同时也不同地，基因组与染色体结构复杂，因而有着更为复杂的调控机制。 1、 2、 3、 4、多层次。真核生物的基因表达可发生在染色质水平、转录起始水平、无操纵子和衰减子。 大多数原核生物以负调控为主，而真核生物启动子以正调控为主。 个体发育复杂，而受环境影响较小。真核生物多为多细胞生物，在转录后水平、翻译水平以及翻译后水平。

生长发育过程中，不仅要随细胞内外环境的变化调节基因表达，还要随发育的不同阶段表达不同基因。前者为短期调控，后者属长期调控。 从整体上看，不可逆的长期调控影响更深远。 三、真核生物基因表达调控的机制 介于真核生物表达以多层次性为最主要特点，我们可以分别从它的几个水平着眼，剖析它的调控机制。 1、染色质水平。真核生物基因组DNA以致密的染色质形式存在，发生在染色质水平的调控也称作转录前水平的调控，产生永久性DNA序列和染色质结构的变化，往往伴随细胞分化。染色质水平的调控包括染色质丢失、基因扩增、基因重排、染色体DNA的修饰，等等。a.基因丢失：丢失一段DNA或整条染色体的现象。在细胞分化过程中，可以通过丢失掉某些基因而去除这些基因的活性。某些原生动物、线虫、昆虫和甲壳类动物在个体发育中，许多体细胞常常丢失掉整条或部分的染色体，只有将来分化产生生殖细胞的那些细胞一直保留着整套的染色体。如马蛔虫2n＝2，但染色体上有多个着丝粒。第一次卵裂是横裂，产生上下2个子细胞。第二次卵裂时，一个子细胞仍进行横裂，保持完整的基因组，而另一个子细胞却进行纵向分裂，丢失部分染色体。目前，在高等真核生物（包括动物、植物）中尚未发现类似的基因丢失现象。 b.基因扩增：基因扩增是指某些基因的拷贝数专一性增大的现象，它使得细胞在短期内产生大量的基因产物以满足生长发育的需要，是基因活性调控的一种方式。如非洲爪蟾卵母细胞中rDNA的基因扩增是因发育需要而出现的基因扩增现象；基因组拷贝数增加，即多倍性，在植物中是非常普遍的现象。基因组拷贝数增加使可供遗传重组的物质增多，这可能构成了加速基因进化、基因组重组和最终物种形成的一种方式。 c.基因重排：将一个基因从远离启动子的地方移到距它很近的位点从而启动转录，这种方式被称为基因重排。通过基因重排调节基因活性的典型例子是免疫球蛋白结构基因的表达。在人类基因组中，所有抗体的重链和轻链都不是由固定的完整基因编码的，而是由不同基因片段经重排后形成的完整基因编码的。

真核细胞基因表达的调控Word版

MCB课程 真核细胞的基因表达和调控 一，生物体内遗传物质的基本结构和功能单位是基因 上个世纪70年代在细胞生物学，细胞遗传学和生物化学的基础上，经过一系列重大发现而奠定基础，逐步发展形成了分子生物学(molecular biology)这一现代生命学科。分子 生物学认为生物体内存在着决定生物体性状的遗传物质，其基本的结构和功能单位是基因(gene)。基因的本质是一段携带着能合成功能蛋白质所需的全部信息的DNA，其中包括着蛋白质的编码序列，也包括非编码的调控序列。基因主要具有两大功能。一是指导合成蛋白质，通过蛋白质发挥的功能将遗传信息转换成具体的细胞性状和功能；二是通过细胞有丝分裂过程中的DNA复制(replication)，将遗传信息传递给子代细胞，从而保持子代细胞与母代细胞性状的一致性。基因在双螺旋结构的DNA长链组成的染色体 上呈线性排列。在哺乳动物的真核细胞中线性排列的基因以核小体 (nucleosome) 的形式被紧密包绕存在于细胞核中，组成核染质(chromatin)。核小体的核心是由H2a,H2b,H3和 H4四组组蛋白形成的八聚体，核心外包绕着1又3/4圈的DNA长链。因此在电镜下核 染质呈“串珠样“结构。由于基因的本质是呈双螺旋结构的方向相反的两条脱氧核糖核酸（DNA）分子，因此基因的排列具有方向性，其DNA分子的5’端为基因的上游，3’端为基因的下游。构成基因DNA分子序列的有腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）胞嘧啶（C）和鸟嘌呤（G）4种碱基。在双链DNA分子中一条DNA分子上的A总是以两条氢键与另一条DNA分子上的T相结合，而C总是以三条氢键与G相结合。A与T，C与G 之间称为互补关系(complementary)。双链DNA分子中A,T,C,G的不同组合排列形成了三联密码，每一个三联密码都代表着一种相应的氨基酸。然而，基因中的编码序列往往并不连续，其中间隔着非编码的序列。这些编码的序列称为基因结构中的外显子，而非编码序列称为内含子。在基因的上游端具有启动基因表达作用的特殊序列称为启动子，它们的序列中富含A,T,C, 在基因的上游，下游较远处，乃至基因内部还有某些序列对基因的表达有明显的促进作用，称为增强子。基因的下游端往往还有基因表达的终止信号。上述基因本身的主要结构统称为基因的顺式元件，而参与基因表达过程的基因外的蛋白质因子称为基因的反式元件（见下节）。上述排列着基因的DNA成为基因组DNA，真 核细胞中除了基因组DNA携带遗传信息外，线粒体中能独立复制的DNA也携带着遗传 信息。

原核&真核表达载体构建

原核、真核表达载体构建 真核表达载体和原核表达载体的区别：主要是因为原核和真核表达系统所需的表达元件不同。 比如说启动子，终止子在两种表达系统中是不一样的。 带有真核表达元件的是真核载体，能在真核生物内表达； 带有原核表达元件的是原核载体，能在原核生物内表达。两者都具有的为穿梭载体。 ㈠原核表达载体指：能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行复制的载体。 原核表达载体调控原件 1.启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并起始RNA合成的序列，它是基因表达不可缺少的重要调控序列。没有启动子，基因就不能转录。由于细菌RNA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所用的启动子必须是原核启动子。原核启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重要。在转录起始点上游5～10 bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称为Pribnow 盒，又名TATA 盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow 盒的碱基顺序稍有变化。在距转录起始位点上游35 bp 处，有一段由10 bp组成的区域，称为-35区。转录时大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶s亚基结合，-10区与RNA聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA 链。原核表达系统中通常使用的可调控的启动子有Lac(乳糖启动子)、Trp(色氨酸启动子)、Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) 、lPL (l噬菌体的左向启动子)、T7噬菌体启动子等。 2. SD序列 1974年Shine和Dalgarno首先发现，在mRNA上有核糖体的结合位点，它们是起始密码子AUG和一段位于AUG上游3～10 bp处的由3～9 bp组成的序列。这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16S rRNA 3￠末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别与结合位点。以后将此序列命名为Shine-Dalgarno序列，简称SD序列。它与起始密码子AUG之间的距离是影响mRNA转录、翻译成蛋白的重要因素之一，某些蛋白质与SD序列结合也会影响mRNA与核糖体的结合，从而影响蛋白质的翻译。另外，真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG 之后，才能产生一个完整的蛋白质。 3．终止子 在一个基因的3￠末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能，这一序列称之为转录终止子，简称终止子(terminator)。转录终止过程包括：RNA聚合酶停在DNA模板上不再前进，RNA的延伸也停止在终止信号上，完成转录的RNA从RNA聚合酶上释放出来。对RNA聚合酶起

真核表达载体

真核细胞常见表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点: 该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点: pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40 origin使该载体在任何表达SV40 T 抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。 用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。5、CMV4 表达载体 特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位点选择性较多。含有氨苄青霉素抗性基因和生长基因片段以及SV40复制原点和fl单链复制原点。但值得注意的是，该表达载体不含有neo基因，转染細胞后不能用G418筛选稳定的表达细胞株。 其他常用克隆Vector： pBluscript II KS DNA 15 ug pUC18 DNA 25 ug pUC19 DNA 25 ug

真核生物基因表达调控

第十章作业 1. 简述真核生物基因表达调控的7个层次。 ①染色体和染色质水平上的结构变化与基因活化 ②转录水平上的调控，包括基因的开与关，转录效率的高与低 ③RNA加工水平的调控，包括对出事转录产物的特异性剪接、修饰、编辑等。 ④转录后加工产物在从细胞核向细胞质转运过程中所受到的调控 ⑤在翻译水平上的控制，即对哪一种mRNA结合核糖体进行翻译的选择以及蛋白质成量的控制 ⑥对蛋白质合成后选择性地被激活的控制，蛋白质和酶分子水平上的剪接等的控制 ⑦对mRNA选择性降解的调控 2. 真核基因表达调控与原核生物相比有何异同？ 相同点：①与原核基因的调控一样，真核基因表达调控也有转录水平调控和转录后水平的调控，并且也以转录水平调控为最重要； ②在真核结构基因的上游和下游(甚至内部)也存在着许多特异的调控成分，并依靠特异蛋白因子与这些调控成分的结合与否调控基因的转录。 不同点：①原核细胞的染色质是裸露的DNA，而真核细胞染色质则是由DNA与组蛋白紧密结合形成的核小体。 ②在原核基因转录的调控中，既有激活物参与的正调控，也有阻遏物参与的负调控，二者同等重要。 ③原核基因的转录和翻译通常是相互偶联的，即在转录尚未完成之前翻译便已开始。 ④真核生物大都为多细胞生物，在个体发育过程中发生细胞分化后，不同细胞的功能不同，基因表达的情况也就不一样，某些基因仅特异地在某种细胞中表达，称为细胞特异性或组织特异性表达，因而具有调控这种特异性表达的机制。 3. DNA 甲基化对基因表达的调控机制。 甲基化抑制基因转录的机制：DNA甲基化会导致某些区域DNA构象改变，包括甲基化后染色质对于核酸酶或限制性内切酶的敏感度下降，更容易与组蛋白H1相结合，DNaseⅠ超敏感位点丢失，使染色质高度螺旋化, 凝缩成团, 直接影响了转录因子与启动区DNA的结合效率的结合活性，不能启始基因转录。DNA的甲基化不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了转录活性。 4. 转录因子结合DNA的结构基序（结构域）有哪几类？ ①螺旋-转折-螺旋 ②锌指结构 ③碱性-亮氨酸拉链 ④碱性-螺旋-环-螺旋 5. 真核基因转调控中有几种方式能够置换核小体？ ①占先模式：可以解释转录时染色质结构的变化。该模型认为基因能否转录取决于特定位置上组蛋白和转录因子之间的不可逆竞争性结合。 ②动态模式该模型认为转录因子与组蛋白处于动态竞争之中，基因转录前染色质必须经历结构上的改变，即转换核小体中的全部或部分成分并重新组装，这个耗能的基因活化过程称为染色质重构 6. 简述真核生物转录水平调控过程。 真核生物在转录水平的调控主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程：①转录起始复合物的形成：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的

真核细胞表达系统的类型与常用真核细胞表达载体

标签：真核细胞酵母表达系统细胞表达载体真核表达系统昆虫表达系统动物表达系统 摘要 : 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 原核表达系统是常被用来研究基因功能的成熟系统，由于原核表达系统具有包涵体蛋白不易纯化、蛋白修饰不完整等缺陷，人们也开始利用真核细胞表达系统来研究基因。 自上世纪70年代基因工程技术诞生以来，基因表达技术已渗透到生命科学研究的各个领域。并随着人类基因组计划实施的进行，在技术方法上得到了很大发展，时至今日已取得令人瞩目的成就。随着人类基因组计划的完成，越来越多的基因被发现，其中多数基因功能不明。利用表达系统在哺乳动物细胞内表达目的基因是研究基因功能及其相互作用的重要手段。 在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过iptg诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。 为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是： ①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制; ②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及; ③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量。 因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。 1.酵母表达系统 最早应用于基因工程的酵母是酿酒酵母，后来人们又相继开发了裂殖酵母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等，其中，甲醇酵母表达系统是目前应用最广泛的酵母表达系统。目前甲醇酵母主要有H Polymorpha，Candida Bodini，Pichia Pastris3种。以Pichia Pastoris 应用最多。

2021年真核细胞常见表达载体

真核细胞常见表达载体 欧阳光明（2021.03.07） 真核细胞, 表达载体 1、pCMVp-NEO-BAN载体 特点:该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在，转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。 插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。 2、pEGFP, 增强型绦色荧光蛋白表达载体(Enhanced Fluorecent Protein Vector) 特点: pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。

用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点，将外源基因扦入这些位点，将合成外源基因和EGFP的融合基因。借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位。 亦可用于检测克隆的启动子活性(取代CMV启动子,Acet1-Nhe1)。 3、pEGFT-Actin, 增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体 特点:pEGFP-Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV-TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达。用途: pEGFP-Actin载体在真核细胞表达EGFP-Actin融合蛋白，该蛋白能整合到胞内正在生的肌动蛋白，因而在活细胞和固定细胞中观察到细胞内含肌动蛋白的亚细胞结构。 4、pSV2表达载体 特点：该表达质粒是以病责SV40启动子驱动在真核细胞目的基因进行表达的，克隆位点为Hind111。SV40启动子具有组织/细胞的选择特异性。此载体不含neo基因，故不能用来筛选、建立稳定的表达细胞株。 5、CMV4 表达载体特点:该真核细胞表达载体由CMV启动子驱动，多克隆区域酶切位

真核生物基因表达调控

真核生物基因表达的调控远比原核生物复杂，可以发生在DNA水平、转录水平、转录后的修饰、翻译水平和翻译后的修饰等多种不同层次。但是，最经济、最主要的调控环节仍然是在转录水平上。 DNA水平的调控 DNA水平上的调控主要指通过染色体DNA的断裂，删除，扩增，重排，修饰（如甲基化与去甲基化，乙酰化与去乙酰化等）和染色质结构变化等改变基因的数量、结构顺序和活性而控制基因的表达。 转录水平的调控 转录水平的调控包括染色质的活化和基因的活化。通过染色质改型，组蛋白乙酰化，染色质变得疏松化及DNA去甲基化以便被酶和调节蛋白作用，基因的表达受顺式作用元件包括启动子及应答元件，转座元件，增强子，抑制子的调控，同时受反式作用因子包括基本转录因子，上游转录因子和转录调节因子等的调控。 转录后调控 转录后调控包括hnRNA的选择性加工运输和RNA编辑 在真核生物中，蛋白质基因的转录产物统称为hn RNA，必须经过加工才能成为成熟的mRNA分子。加工过程包括三个方面：加帽、加尾和去掉内含子。同一初级转录产物在不同细胞中可以用不同方式剪接加工，形成不同的成熟mRNA分子，使翻译成的蛋白质都可能不同。转录后的RNA在编码区发生碱基插入，缺失或转换的现象。

翻译水平的调控 阻遏蛋白与mRNA结合，可以阻止蛋白质的翻译并使成熟的mRNA变为失活状态贮存起来。一些调控作用的micRNAh和siRNA 还可以与mRNA作用降解mRNA，阻止其翻译 此外，还可以控制mRNA的稳定性和有选择的进行翻译。 翻译后调控 直接来自核糖体的线状多肽链是没有功能的，必须经过加工才具有活性。在蛋白质翻译后的加工过程中，还有一系列的调控机制。 1．蛋白质折叠 线性多肽链必须折叠成一定的空间结构，才具有生物学功能。在细胞中，蛋白质的折叠必须有分子伴侣的作用下才能完成折叠。 2．蛋白酶切割 末端切割 有些膜蛋白、分泌蛋白，在氨基端具有一段疏水性强的氨基酸序列，称为信号肽，用于前体蛋白质在细胞中的定位。信号肽必须切除多肽链才具有功能。 多聚蛋白质的切割 有些新合成的多肽链含有几个蛋白质分子的序列，切割以后产生具有不同功能的蛋白质分子。

真核细胞表达外源基因步骤

真核细胞表达外源基因步骤 点击： 538 作者：来源：时间： 2007-11-10 本站论坛 在真核细胞中表达蛋白的步骤比大肠杆菌复杂得多。首先要考虑选用什么载体。一般人们趋向于使用分泌表达载体，以便于蛋白的纯化。但有的蛋白并不适合于分泌表达，如一些胞质蛋白，非糖基化蛋白等。此外分泌表达的蛋白信号肽存在一个效率问题。有的蛋白即使存在信号肽，也不能分泌。并且有的分泌蛋白较易受到蛋白酶的降解。所有这些因素都需综合考虑。 1 克隆 选用合适的内切酶把外源基因克隆于表达载体的多克隆位点。如果选用的是分泌型表达载体，则外源基因的阅读框架和信号肽的阅读框架应该保持一致。 2 重组栽体线性化 重组载体只有被酶切线性化整合效率才能大大提高，环状质粒整合效率是很低的。选用不同的内切酶线性化可得到不同的转化子。如对载体 pPC19选用BgiⅡ线性化，转化后可得到Muts表型转化子；选用SaI或StuI线性化，转化后可得到Mut表型转化子。 3 转化 目前对真核细胞的转化方法有多种，例如对于P.Pastoris的转化目前有4种方法：①锂盐法；②PEG法；③原生质球法；④电穿孔法。锂盐法和PEG法方法简便，但效率很低，每微克DNA只有几十个转化子或更低，一般不多用。原生质球法和电穿孔法转化率都较高，而且一般可得到高拷贝重组，其转化率都可达到105/μg。但原生质球法操作繁琐费时；电穿孔法简便、快速、高效，是理想的转化方法。选用上述四种方法中的一种转化。一般选用原生质球或电击法。 4 筛选 转化子可先在不含组氨酸的培养基上初筛。复筛可用PCR进行。即提取转化子DNA，用外源基因两侧特异引物扩增筛选。然而，这只限于少量转化子转化子太多，则工作量太大。对于大量转化子的筛选．可用原位点杂交进行。即把相同量的不同转化子点在NC膜上，在原位对酵母细胞壁进行裂解，使之释放DNA。DNA经变性、中和后，可和由外源基因制备的探针杂交。用这种方法，在一张Nc膜上，可完成对几百个转化子的筛选。用原位点杂交不仅可以筛选大量转化子，而且可以鉴定多拷贝。这是因为当点到NC膜上的菌量相同时，转化子中外源基因拷贝数越多，则杂交后信号越强。 5 鉴定表型 筛选出的转化子需鉴定表型，以酵母为例，即确定是Mut+还是Muts。这两种不同表型在诱导表达的条件上有差异。可以把转化子同时点在MD和MM两块板上。在MD和MM板上生长差别不大的转化子为Mut+；相反，在MD上生长快，MM上生长很慢的转化子为Mutd。 6 诱导表达 外源蛋白在真核细胞中的表达分两步，即菌体生长和蛋白诱导表达。先在以培养基上培养菌体，达到一定OD值后，离心弃上清，菌体悬浮于以液体培养基中诱导表达。表达的条件有待优化，如通气状况，pH值，培养基的组成等等。一旦最佳条件确定，则可以按比例放大。从摇瓶培养转至大规模发酵。

真核表达基础知识

真核基因表达调控 一、真核基因组的复杂性 与原核生物比较，真核生物的基因组更为复杂，可列举如下。 ▲真核基因组比原核基因组大得多，大肠杆菌基因组约4×106bp，哺乳类基因组在109bp数量级，比细菌大千倍；大肠杆菌约有4000个基因，人则约有10万个基因。 ▲真核生物主要的遗传物质与组蛋白等构成染色质，被包裹在核膜内，核外还有遗传成分(如线粒体DNA等)，这就增加了基因表达调控的层次和复杂性。 ▲原核生物的基因组基本上是单倍体，而真核基因组是二倍体。 ▲如前所述，细菌多数基因按功能相关成串排列，组成操纵元的基因表达调控的单元，共同开启或关闭，转录出多顺反子(polycistron)的mRNA；真核生物则是一个结构基因转录生成一条mRNA，即mRNA是单顺反子(monocistron)，基本上没有操纵元的结构，而真核细胞的许多活性蛋白是由相同和不同的多肽形成的亚基构成的，这就涉及到多个基因协调表达的问题，真核生物基因协调表达要比原核生物复杂得多。 ▲原核基因组的大部分序列都为基因编码，而核酸杂交等实验表明：哺乳类基因组中仅约10%的序列为蛋白质、rRNA、tRNA等编码，其余约90%的序列功能至今还不清楚。 ▲原核生物的基因为蛋白质编码的序列绝大多数是连续的，而真核生物为蛋白质编码的基因绝大多数是不连续的，即有外显子(exon)和内含子(intron)，转录后需经剪接(splicing)去除内含子，才能翻译获得完整的蛋白质，这就增加了基因表达调控的环节。 ▲原核基因组中除rRNA、tRNA基因有多个拷贝外，重复序列不多。哺乳动物基因组中则存在大量重复序列(repetitive sequences)。用复性动力学等实验表明有三类重复序列：①高度重复序列(highly repetitive sequences)，这类序列一般较短，长10－300bp，在哺乳类基因组中重复106次左右，占基因组DNA 序列总量的10－60%，人的基因组中这类序列约占20%，功能还不明了。②中度重复序列(moderately repetitive sequences)，这类序列多数长100－500bp，重复101－105次，占基因组10-40%。例如哺乳类中含量最多的一种称为Alu的序列，长约300bp，在哺乳类不同种属间相似，在基因组中重复3-×105次，在人的基因组中约占7%，功能也还不很清楚。在人的基因组中18S/28SrRNA基因重复280次，5SrRNA基因重复2000次，tRNA基因重复1300次，5种组蛋白的基因串连成簇重复30-40次，这些基因都可归入中度重复序列范围。③单拷贝序列(single copy sequences)。这类序列基本上不重复，占哺乳类基因组的50-80%，

STAT3蛋白真核表达载体的构建及其泛素化功能研究

STAT3蛋白真核表达载体的构建及其泛素化功能 研究 化[5]。信号转导与转录激活因子家族（STAT）已发现7个成员，STAT3是该家族的研究热点，且敲除该基因可以使胚胎死亡，说明该基因是不可或缺的。磷酸化修饰是调控STAT3活性的主要方式，Tyr705、Ser727是磷酸化的关键氨基酸位点[6]。此外，STAT3的Lys685可以在组蛋白乙酰转移酶的修饰下发生可逆乙酰化[7-8]。 在真核细胞中，蛋白质的泛素化和磷酸化是最常见的翻译后修饰。细胞外信号严格调控着蛋白的泛素化，在很多情况下，这种调控依赖于蛋白质的磷酸化[9]。磷酸化通过修饰泛素化的底物，或者修饰泛素化机器的某个组分来影响泛素化。此外，泛素化对于磷酸化和信号分子的传递也有一定的作用。本研究通过研究STAT3蛋白是否会发生泛素化，发生哪种类型的泛素化，并以此解释泛素化与STAT3活性之间的关系。 1材料与方法 1.1试验材料 Taq DNA polymerase，购自北京鼎国生物技术有限公司；T4 DNA连接酶、pMD-19-T simple Vector、DNA酶Ⅰ、Oligo （dT）18、Random promers、PrimeScript RT reagent Kit

和SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）Kit，购自TaKaRa公司；dNTPs，购自北京盛旭百川生物科技有限公司；DNA分子量标准品，购自中科瑞泰（北京）生物科技有限公司；蛋白质非预染分子量标准marker及预染分子量标准marker，购自Fermentas公司；Tween-20，购自Amresco公司；质粒小量提取试剂盒、EASYspin plus RNA提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；质粒大量提取试剂盒、Enhanced chemiluminescence（ECL）kit，购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA凝胶回收纯化试剂盒，购自Zymo 公司；无内毒素大量质粒提取试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；Anti-c-HA单克隆抗体、protein A/G plus-agarose（SC-2003），购自Santa Cruz生物公司；Anti-FLAG M2（F1804）单克隆抗体、PI染料，购自Sigma 公司；HRP-标记山羊抗小鼠和山羊抗兔抗?w，购自北京鼎国生物技术有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂，购自Invitrogen公司；蛋白酶抑制剂，购自亚太恒信生物科技（北京）有限公司；Sal Ⅰ和Hind Ⅲ酶，购自NEB公司；HA-ub、HA-KO、HA-K48、HA-K63等载体质粒均由唐军教授馈赠；所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.2Human STAT3基因的克隆 根据NCBI STAT3（ID：47080104）基因序列设计引物，上游引物为5′-ATGGCCCAATGGAATCAGC-3′，下游引物为