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分子生物学考试重点总结第八章:基因工程与体外表达

分子生物学考试重点总结第八章:基因工程与体外表达
分子生物学考试重点总结第八章:基因工程与体外表达

第八章:基因工程与体外表达

基因工程:是指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案,进行剪切和重新连接,然后把它导入宿主细胞,从而能够扩增有关DNA片段,表达有关基因产物,进行DNA序列分析,基因治疗,研究基因表达的调节元件(如启动子、增强子等),以及研究基因的功能等。

第一节:基因克隆的工具酶

一、限制性核酸内切酶(restriction enzyme)

1.定义:它是一种核酸内切酶,能从双链DNA内部特异位点识别并且裂解磷酸二酯键。

2.限制性内切酶的命名:EcoRⅠ:E代表Escherichia属;co 代表coli种;R代表RY13株

3.限制性内切酶的识别和切割位点:

通常是4~6个碱基对、具有回文序列(palindrome)的DNA 片段,大多数酶是错位切割双链DNA,产生5ˊ或3ˊ黏性末端(sticky end)。

如EcoRⅠ切割后产生5ˊ黏性末端:

二、其他常用的工具酶

1. DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymerase I):有聚合酶活性;有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性;有5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性

2. DNA聚合酶Ⅰ大片段(large fragment of DNA polymerase I):为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)裂解后产生的大片段,这个片段也称为Klenow片段(Klenow fragment)。

有5ˊ→3ˊ聚合酶活性;有3ˊ→5ˊ核酸外切酶活性;无5ˊ→3ˊ核酸外切酶活性。

Klenow片段的主要用途:(1) 补齐双链DNA的3ˊ末端。(2) 通过补齐3ˊ端,使3ˊ末端标记。(3) 在cDNA克隆中,第二股链的合成。(4) DNA序列分析。

3. 逆转录酶(reverse transcriptase):是一种RNA依赖的DNA 聚合酶,即以RNA为模板合成DNA,合成方向为5ˊ→3ˊ延伸,无3ˊ→5ˊ外切酶活性。

用于以mRNA为模板合成cDNA,构建cDNA文库。

4. T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase):T4 DNA连接酶催化双链DNA一端3ˊ-OH与另一双链DNA的5ˊ端磷酸根形成3ˊ→5ˊ磷酸二酯键,使具有相同黏性末端或平端的DNA两端连接起来。

5. 碱性磷酸酶(alkaline phosphatase):能去除DNA或RNA 5ˊ端的磷酸根。制备载体时,用碱性磷酸酶处理后,可防止载体自身连接,提高重组效率。

6. 末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase, TdT),简称末端转移酶。

作用:是将脱氧核苷酸加到DNA的3ˊ-OH上,主要用于探针标记;或者在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾,以便于进行连接。

第二节:基因克隆的载体

载体是携带目的基因,使其在宿主细胞内复制或表达的DNA 分子。

一、常用的克隆载体

(一)质粒(plasmid)

性质:是存在于多数细菌和某些真核生物染色体外的双链环状的DNA分子。

质粒一般只能容纳小于10kb的外源DNA片段。

作为克隆载体的质粒应具备下列特点:

(1)分子量相对较小,能在细菌内稳定存在,有较高的拷贝数。

(2)具有一个以上的遗传标志,便于对宿主细胞进行选择,如抗生素的抗性基因,β-半乳糖苷酶基因(Lac Z)等。(3)具有多个限制性内切酶的单一切点,便于外源基因的插入。如果在这些位点有外源基因的插入,会导致某种标志基因的失活,而便于筛选。

(二)λ噬菌体:野生型λ噬菌体经过改造,已衍生出100多种克隆载体。λ噬菌体载体分为插入型和替换型(置换型)两类。目前应用较广的是EMBL系列、λgt系列和Charon系列等。

(三) M13噬菌体(M13 phage):一种大肠杆菌雄性特异丝状噬菌体。感染细菌后,经过复制转变为双链的复制型(RF)。复制型M13可用作克隆载体。

(四)黏性质粒(cosmid):是由λ噬菌体的黏性末端(cos区)与质粒重新构建的载体,为双链、环状DNA。其克隆容量可达40~50 kb。

(五) 病毒载体:逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、EB病毒等作为基因转移的载体。多数病毒载体均已质粒化,病毒载体质粒主要由病毒启动子、包装元件、选择性遗传标记,以及pBR322的复制子组成。

二、表达载体

(一) 原核表达载体:表达载体中含有复制起始位点、抗性基因、克隆位点、启动子、核糖体结合位点和转录终止信号(二) 真核表达载体:载体中含有原核复制起始位点、抗生素抗性基因. 还含有真核表达元件,包括启动子、增强子、克隆位点、转录终止信号和poly (A) 加尾信号.

第三节:基因克隆的基本过程

基因克隆主要分为以下几个步骤:

①制备目的基因和相关载体;

②将目的基因和有关载体进行连接;

③将重组的DNA导入受体细胞;

④DNA重组体的筛选和鉴定;

⑤DNA重组体的扩增、表达和其他研究。

一、目的基因的获得

①从基因组文库中获得一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后,将酶切片段克隆在载体DNA分子中,所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体,将包含了这个生物体的整个基因组,也就是构成了这个生物体的基因文库。

②从cDNA文库中获得:cDNA文库是指某种特定细胞及特定状态下的全部cDNA克隆。

③用聚合酶链反应(PCR)技术体外扩增有关DNA片段。

④人工合成。

二、载体的选择与准备

几种常用克隆载体的比较

比较内容质粒λ噬菌体黏性质粒M13噬菌体

克隆容量<10 kb <22 kb 40~50 kb <1 kb

基因组DNA文库- + + - cDNA文库+ + - -

亚克隆+ - - +

序列分析+ + - +

E.coli表达+ + - -

三、DNA分子的体外连接

①黏性末端;②人工接头的使用;③加入同聚体尾;④平端连接

四、外源DNA导入宿主细胞

重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞,常用的方法有以下几种。

(一)转化(transformation)

转化是指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞,并使其获得新的表型的过程。转化常用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌悬浮在CaCl2溶液中,并置于低温(0~5℃)环境下一段时间,钙离子使细胞膜的结构发生变化,通透性增加,从而具有摄取外源DNA的能力,这种细胞称为感受态细胞(competent cell)。

(二)感染(infection)

λ噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子,在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒,才能感染适当的细胞,并在细胞内繁殖。由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称为转导(transduction)。

(三)转染(transfection)

转染是指真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。

常用的方法有电穿孔法(electroporation)、CaPO4沉淀法、脂质体融合法等。进入细胞的DNA可以被整合至宿主细胞的基因组中,也可以在染色体外存在和表达。

五、目的基因的筛选和鉴定

将外源基因导入宿主细胞以后,首要任务是筛选含有目的基因的阳性克隆并加以扩增。所用的方法主要有遗传学方法、免疫学方法、核酸杂交法、PCR等。

(一)遗传学方法

1.插入灭活法

2.蓝-白筛选(α互补):许多载体(如M13系列、pUC系列、pGEM系列)都含有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和氨基端145个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点。这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶羧基端部

分序列的宿主细胞。宿主和载体编码的片段各自均无酶活性,但它们可以互补形成具有活性的β-半乳糖苷酶,使人工底物X-gal转化成蓝色的代谢产物,出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段,将使lac Z基因灭活,不能生成有活性的β-半乳糖苷酶,结果菌落呈现白色。

(二)免疫学方法:如果克隆基因的产物是已知的,并且在菌落或噬菌斑中表达,因而可用相应的抗血清或单克隆抗体,通过放射免疫、化学发光或显色反应进行筛选。

(三)核酸杂交法:对菌斑或菌落进行原位分子杂交是从基因组文库、cDNA文库或重组质粒中筛选目的基因的最有效的方法之一,而且这种筛选不取决于目的基因是否表达。(四)PCR技术:PCR技术具有高度的灵敏度和特异性,能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍,通过琼脂糖凝胶电泳,可直接观察到产物的存在。

(五)酶切鉴定:用抗生素筛选、蓝白筛选等方法筛选出的菌落需进一步进行酶切分析,鉴定插入片段的大小和插入方向。

1.插入片段大小的鉴定;

2.插入片段方向性的鉴定

第四节:真核细胞转染

一. 真核细胞转染的方法与基本原理

(一)磷酸钙沉淀法(calcium phosphate co-precipitation):使外源DNA或重组质粒DNA与磷酸钙混合,形成微小颗粒,并加入到宿主细胞中,使这些颗粒沉积在细胞表面,以利于宿主细胞摄取这些颗粒。

(二)电穿孔法(electroporation):将外源DNA与宿主细胞混合于电穿孔杯中,在高频电流的作用下,细胞膜出现许多小孔,使外源DNA能进入宿主细胞。

(三)DEAE-葡聚糖法:外源DNA或重组质粒DNA与DEAE 葡聚糖混合,DEAE葡聚糖带有大量正电荷的化学基团,可与DNA中带负电荷磷酸基团结合,并粘附于细胞表面,借助细胞内吞过程促进外源DNA进入细胞。此法简单、快速、有效,常用于外源基因的短暂表达研究。

(四)脂质体介导的基因导入

(五)显微注射法(microinjection)

二. 转染细胞的筛选

(1)TK-细胞突变株筛选转染细胞

细胞内TTP合成途径:①从头合成:可被氨基喋呤阻断②补救合成:胸苷激酶(TK)是关键酶

TK+: 细胞生长;TK- 细胞+含TK基因的载体:细胞生长。(2)药物筛选转染细胞:哺乳动物细胞中最常用的选择性标记物中包括细菌新霉素抗性基因(neor)。此基因具有对氨基糖苷抗生素G-418(新霉素衍生物)的抗性。G-418是用于阻断细胞内的蛋白质合成,从而达到杀伤真核细胞的目的。如果将带有neor基因的质粒导入细胞,并在含有G-418的培养基中培养,未转染的细胞被杀死,而存活的细胞便是转染细胞。

第五节:基因的改造

①寡核苷酸介导的定点诱变法的建立;②含U模板法;③PCR 定点诱变法

第六节:克隆基因的表达

基因工程的主要目的之一,就是要制备大量有用的蛋白质和多肽,尤其是人体蛋白。得到了克隆的基因或cDNA后,按照正确的方向插入表达载体,连在启动子的后面,导入相应的宿主细胞,即可进行表达。在不同的表达系统中,其表达方式不尽相同。

Kozak序列:Kozak发现脊椎动物起始密码子ATG周边的序列为ANNATGG,-3位的A对翻译效率非常重要. 该序列被称为Kozak序列.

基因表达:DNA-RNA-蛋白质

功能蛋白质的形成:蛋白质折叠;磷酸化修饰;糖基化修饰;酰基化。

一、克隆基因在大肠杆菌中的表达

大肠杆菌表达外源基因的优势:全基因组测序,共有4405个开放型阅读框架;繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定。

大肠杆菌表达外源基因的劣势:

1.缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统,如糖基化或磷酸化等修饰作用。

2. 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白,造成表达产物不稳定。

(一)基因表达的基本要素

1.目的基因:目的基因如果来自真核细胞必须是cDNA 。cDNA的始密码子(ATG)上游部分(5ˊ端非编码区)必须除去。

2.载体的选择:所用表达载体必须是大肠杆菌表达载体,含有大肠杆菌RNA聚合酶所能识别的启动子(如PL、tac、T7等)和SD序列。

3.目的基因与载体的连接:

(1)起始密码子

(2)融合蛋白:融合蛋白是指表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起。

表达融合蛋白的优点:

(1)融合蛋白较稳定,不易被细菌蛋白酶水解;

(2)如果大肠杆菌的结构基因是一段信号肽,可产生分泌型产物.

(3)可利用针对原核部分的单抗进行亲和层析,便于纯化.

(4)原核蛋白部分可用蛋白酶切掉,释放出天然的真核蛋白质。

(5)目的蛋白溶解性好,融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象,且大多具有水溶性.

4.受体菌株和诱导条件

(1)根据载体所携带的启动子选择特定的菌株;(2)确定诱导表达条件

(二)提高外源基因表达水平的措施

1.提高翻译水平:①调整SD序列与ATG之间的距离;②用点突变的方法改变某些碱基;③增加mRNA的稳定性

2.使细菌的生长与外源基因的表达分开:将宿主菌的生长和外源基因的表达分成两个阶段,是减轻宿主细胞代谢负荷最为常用的一个方法。一般采用温度诱导或药物诱导。

3.提高表达蛋白的稳定性:①表达融合蛋白;②采用某种突变菌株;③表达分泌蛋白

二、哺乳动物细胞表达系统

克隆基因要在哺乳动物细胞中进行表达,必须先将基因重组到适当的真核表达载体中。重组的表达载体在大肠杆菌中进行扩增,并从大肠杆菌中提取和纯化重组表达载体,然后将其导入哺乳动物细胞进行表达。在哺乳动物细胞中表达的基因,可是基因组DNA,也可以是cDNA。

编码真核蛋白的外源基因在真核细胞中表达时,表达产物对细胞本身的影响不大,蛋白质本身也很少被降解。因此真核表达载体的启动子大多是可以持续表达的,无需诱导。在筛选出转染细胞后,持续培养,便可得到表达产物。

三. 其他表达系统

(一)昆虫表达系统:昆虫是高等真核生物,能进行翻译后加工和修饰. 昆虫细胞常用于真核蛋白质的生产.其生长速度快,不需要CO2培养箱,易于悬浮培养,可用于大规模表达蛋白质.

杆状病毒表达系统利用一种不依赖于辅助病毒的病毒,该病毒可在适于悬浮培养的昆虫细胞中增殖至高滴度,能获得大量的重组蛋白,大部分超量表达的蛋白质为可溶性蛋白.杆状病毒对脊椎动物无感染性.

(二)酵母表达系统:酵母菌是一种单细胞真核生物,能进行翻译后加工和修饰.酵母菌在特定的培养基中生长迅速,与哺乳动物细胞相比,易于操作和价格便宜.酵母表达系统是大规模表达重组真核蛋白的理想工具.

第七节:电子克隆(in silico cloning)

EST(expressed sequence tags): 表达序列标签,对特异的组织或器官cDNA文库中的cDNA克隆随机进行测序从而得到的序列.

扬州大学基因工程期末试题复习要点整理

基因工程期末试题复习要点整理 基因工程是70年代出现的一门科学,是生物学最具生命力和最引人注目的前沿科学之一,是现代生物技术的代表,是生命科学类专业中的一门重要的专业课。本课程主要介绍基因工程概述、重组DNA基本技术及原理、基因克隆、基因的分离及鉴定、基因工程的表达系统、基因工程的应用等。通过本课程的学习,使学生掌握基因工程技术的基本原理和了解该技术在动物、植物和微生物等方面的应用,为今后从事生物学教学、生物技术研究和产品开发,或进一步的研究生学习科研打下坚实的理论及专业基础。扬州大学试题纸 一、名词解释:共10题,每题2分,共20分。 1. 基因: 是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列,是遗传物质的最小功能单位。 2. 定位克隆: 获取基因在染色体上的位置信息,然后采用各种方法对该基因进行定位和克隆 3. 融合基因: 是指应用DNA体外重组技术构建的一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。 4. 转化子: 导入外源DNA后获得了新遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞,又称重组体。 5. 人工接头:是人工合成的具有一个或数个特定限制性内切酶识别和切割序列的双股平端DNA短序列。 6. RT-PCR: 是指以mRNA在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的PCR。 7. ORF : 起始于AUG、止于UAA、UGA、UAG的连续的密码子区域,是潜在的编码区。 8. MCS: 指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的DNA片段。 9. gene targeting : 基因工程中利用活细胞染色体DNA可与外源DNA的同源性DNA序列发生重组的性质,来进行定点修饰改造染色体上某一目的基因的技术 10. 5’RACE: 是一种通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术,是以mRNA为模板反转录成cDNA第一链后用PCR技术扩增出某个特异位点到5’端之间未知序列的方法。 四、简答题:共4题,共20分。 1.简述获得目的基因常用的几种方法。(5分)

基因工程知识点总结归纳(更新版)

基因工程 绪论 1、克隆(clone):作名词:含有目的基因的重组DNA分子或含有重组分子的无性繁殖。作动词:基因的分离和重组的过程。 2、基因工程(gene engineering):体外将目的基因插入病毒、质粒、或其他载体分子中,构成遗传物质的新组合,并使之掺入到原先没有这些基因的宿主细胞内,且能稳定的遗传。供体、受体和载体是基因工程的三大要素。 3、基因工程诞生的基础 三大理论基础:40年代发现了生物的遗传物质是DNA;50年代弄清楚DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理;60年代确定遗传信息的遗传方式。以密码方式每三个核苷酸组成一个密码子代表一个氨基酸。 三大技术基础:限制性内切酶的发现;DNA连接酶的发现;载体的发现 3、基因工程的技术路线:切:DNA片段的获得;接:DNA片段与载体的连接;转:外源DNA片段进出受体细胞;选:选择基因;表达:目的基因的表达;基因工程的工具酶 1、限制性内切酶(restriction enzymes):主要是从原核生物中分离纯化出来的,是一类能识别双链DNA分子中某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链的核酸内切酶。 2、限制酶的命名:属名(斜体)+种名+株系+序数 3、II型限制性内切酶识别特定序列并在特定位点切割 4、同裂酶:来源不同,其识别位点与切割位点均相同的限制酶。 5、同尾酶:来源不同,识别的靶序列不同,但产生相同的黏性末端的酶形成的新位点不能被原来的酶识别。 6、限制性内切酶的活性:在适当反应条件下,1小时内完全酶解1ug特定的DNA 底物,所需要的限制性内切酶的量为1个酶活力单位。 7、星号活性:改变反应条件,导致限制酶的专一性和酶活力的改变。 8、DNA连接酶的特点:具有双链特异性,不能连接两条单链DNA分子或闭合单链DNA,连接反应是吸能反应,最适反应温度是4至15度,最常用的是T4连接酶。 9、S1核酸酶:特异性降解单链DNA或RNA。

分子生物学总结(朱玉贤版)(2020年10月整理).pdf

结合着下载的资料复习吧~~~~ 绪论 分子生物学的发展简史 Schleiden和Schwann提出“细胞学说” 孟德尔提出了“遗传因子”的概念、分离定律、独立分配规律 Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离出DNA Morgan基因存在于染色体上、连锁遗传规律 Avery证明基因就是DNA分子,提出DNA是遗传信息的载体 McClintock首次提出转座子或跳跃基因概念 Watson和Crick提出DNA双螺旋模型 Crick提出了“中心法则” Meselson与Stah用N重同位素证明了DNA复制是一种半保留复制 Jacob和Monod提出了著名的乳糖操纵子模型 Arber首次发现DNA限制性内切酶的存在 Temin和Baltimore发现在病毒中存在以RNA为模板,逆转录成DNA的逆转录酶 哪几种经典实验证明了DNA是遗传物质? (Avery等进行的肺炎双球菌转化实验、Hershey 利用放射性同位素35S和32P分别标记T2噬菌体的蛋白质外壳和DNA) 第二章染色体与DNA 第一节染色体 一、真核细胞染色体的组成 DNA:组蛋白:非组蛋白:RNA = 1:1:(1-1.5):0.05 (一)蛋白质(组蛋白、非组蛋白) (1)组蛋白:H1、H2A、H2B、H3、H4 功能:①核小体组蛋白(H2A、H2B、H3、H4)作用是将DNA分子盘绕成核小体

②不参加核小体组建的组蛋白H1,在构成核小体时起连接作用 (2)非组蛋白:包括以DNA为底物的酶、作用于组蛋白的酶、RNA聚合酶等。常见的有(HMG蛋白、DNA结合蛋白) 二、染色质 染色体:分裂期由染色质聚缩形成。 染色质:线性复合结构,间期遗传物质存在形式。 常染色质(着色浅) 具间期染色质形态特征和着色特征染色质 异染色质(着色深) 结构性异染色质兼性异染色质 (在整个细胞周期内都处于凝集状态)(特定时期处于凝集状态)三、核小体 由H2A、H2B、H3、H4各2 分子组成的八聚体和绕在八聚体外的DNA、一分 子H1组成。八聚体在中央,DNA分子盘绕在外,由此形成核心颗粒。,H1结合在核心颗粒外侧DNA双链的进出口端,如搭扣将绕在八聚体外DNA链固定,核心颗粒之间的连接部分为连接DNA。 核小体的定位对转录有促进作用

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第二章Enzymes 第四节DNA连接酶Ligase 一、DNA连接酶的发现 二. 连接条件 必须是两条双链DNA。 DNA3’端有游离的-OH,5’端有一个磷酸基团(P)。需要能量。 三、连接反应的机理 1、A TP(NAD+)提供激活的AMP。 2、A TP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物,并释放出焦磷酸PPi。 3、AMP 与连接酶的赖氨酸-氨基相连。 4、AMP 随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA 一条链的5’端P上,形成“DNA-腺苷酸”复合物。 5、3’-OH对磷原子作亲核攻击,形成磷酸二脂键,释放出AMP。 Ligase:只连“Nick切口”,不连“Gap缺口” 四. 两种DNA连接酶 1. E. Coli DNA ligase 来源:E.coli 适用:粘性末端(PEG与高浓度一价阳离子存在可连平末端) 2. T4 ligase 来源:T4 phage 适用:粘性末端及平末端 T4 vs. E.coli T4 DNA ligase制备容易,价格便宜,能进行各种类型连接反应,应用更广泛! 五.Ligase的反应温度 最佳温度: 界于酶作用速率和末端结合速率之间,一般认为是4-15℃比较合适。 六. DNA分子连接的四种形式 1. 粘性末端; 2. 平末端; 3. 平末端加尾; 4. 平末端加衔接物(linker)或接头(adaptor) (1)Digestion and Ligation 1.粘性末端连接 Problem: (自我环化作用) 解决方法:a、双酶切(两种内切酶)b、去磷酸 2.平末端连接 粘性末端连接效率高于平末端约100倍! 解决方法:化平末端为粘性末端 3. 平末端连接---同聚物加尾法(1)末端脱氧核苷酸转移酶 功能:5’至3’单链聚合 作用特点:单链;无模版 作用机理: a: 用5’-特异的核酸外切酶处理DNA分子,以便移去少数几个末端核苷酸, 获得3’-OH的单链延伸末端。 b: 加入dA TP/dTTP和末端脱氧核苷酸转移酶组成的反应混合物中,DNA分子的3-OH末端将会出现单纯由poly(dA)和poly(dT)组成的DNA单链延伸。 c: 获得poly(dA)和poly(dT)尾巴,就会彼此连接起来。缺点: 当poly(dA),Poly(dT)不严格等长时,重组DNA分子会有缺口。 需要用DNA聚合酶I填补,然后用DNA连接酶连接最后的缺口。 4. 平末端连接 ---衔接物连接法与接头连接法 (1) 平末端的衔接物连接法 衔接物的5’末端和待克隆的DNA片段的5’-末端,用多核苷酸激酶处理使之磷酸化。通过T4 DNA连接酶的作用使两者连接起来。用适当的限制酶消化具衔接物的DNA分子和克隆载体分子。 (2) 平末端的接头连接法 将具有某种限制性酶(BamHI)粘性末端的典型DNA 接头分子与平末端的DNA片段连接后,后者变成具有粘性末端的DNA分子。 七.热稳定的DNA连接酶——来自嗜热高温放线菌 热稳定的DNA连接酶的应用: 寡核苷酸连接测定法(oligonucleotide ligation assay, OLA) 连接酶链式反应(ligation chain reaction, LCR) 寡核苷酸连接测定法的作用 检测突变 寡核苷酸连接测定法的作用:检测突变。 1. 寡核苷酸连接测定法 (1)原理: 两条寡聚核苷酸探针分子,同一种与之互补变性的靶DNA之间的杂交作用,这两条寡聚核苷酸探针分子在靶DNA分子上的位置是彼此相邻的。 当他们同靶DNA链是完全碱基配对时,便可以被连接酶连接起来。 结合点或靠近结合点处存在和靶DNA错配的碱基两个探针之间不能形成磷酸二脂键。 精品文档

基因工程考试试题.doc

基因工程 一名词解释 DNA,1、限制与修饰系统:限制酶的生物学功能一般被认为是用来保护宿主细胞不受外源DNA的感染,可讲解外 来 从而阻止其复制和整合到细胞中。一般来说,与限制酶相伴而生的修饰酶是甲基转移酶,或者说是甲基化酶,能保护 自身的 DNA不被讲解。限制酶和甲基转移酶组成限制与修饰系统。 2、各种限制与修饰系统的比较 Ⅱ型Ⅰ型Ⅲ型 识别位点4~6bp,大多为回文序列二分非对称5~7bp 非对称 切割位点在识别位点中或靠近识别位点无特异性,至少在识别位点外100bp 识别位点下游 24~26bp 简答 1. 何谓 Star activity?简述Star activity的影响因素及克服方法? 答:在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特征称为星星活性。 pH 引起星星活性的的因素:①高甘油浓度(>5%);②酶过量( >100U/μl );③低离子强度( <25mmol/L);④高(> ;⑤有机溶剂如DMSO (二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等;⑥用其它二价阳离子 星星活性的抑制措施:①减少酶的用量,避免过量酶切,减少甘油浓度;②保证反应体系中无有机溶剂或乙醇;③提高离子强度到100 ~ 150mM(在不抑制酶活性的前提下);④降低反应pH至;⑤使用Mg2+作为二价阳离子。 2. 试回答影响限制性内切核酸酶切割效率的因素?(影响酶活性的因素?) 答:外因:反应条件、底物纯度(是否有杂质、是否有盐离子和苯酚的污染)、何时加酶、操作是否恰当,反应体系的选择、反应时间的长短 内因:星星活性、底物甲基化、底物的构象 3、 DNA末端长度对酶切割的影响 答:限制酶切割 DNA 时,对识别序列两端的非识别序列有长度要求,也就是说在识别序列两端必须要有一定数量的 核苷酸,否则限制酶将难以发挥切割活性。在设计PCR引物时,如果要在末端引入一个酶切位点,为保证能够顺利切 割扩增的 PCR产物,应在设计的引物末端加上能够满足要求的碱基数目。一般需加 3 ~4 个碱基对。 4、何为载体?一个理想的载体应具备那些特点? 答:将外源 DNA 或目的基因携带入宿主细胞的工具称为载体。载体应具备:①在宿主细胞内必须能够自主复制(具 备复制原点);②必须具备合适的酶切位点,供外源DNA 片段插入,同时不影响其复制;③有一定的选择标记,用于 筛选;④其它:有一定的拷贝数,便于制备。 5 抗性基因( Resistant gene)是目前使用的最广泛的选择标记,常用的抗生素抗性有哪几种?并举两例说明其原理? 答:氨苄青霉素抗性基因( ampr)、四环素抗性基因(tetr )、氯霉素抗性基因( Cmr)、卡那霉素和新霉素抗性基因( kanr , neor )以及琥珀突变抑制基因supF 。 ⑴青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成,与有关的酶结合,抑制转肽反应并抑制其活性。氨苄青霉素抗性Ampr 编码一个酶,可分泌进入细胞的周质区,并催化β - 内酰胺环水解,从而解除氨苄青霉素的毒性。 ⑵四环素与核糖体 30S 亚基的一种蛋白质结合,从而抑制核糖体的转位。 Tetr 编码一个由 399 个氨基酸组成的膜 结合蛋白,可阻止四环素进入细胞。 6. 何为α - 互补?如何利用α - 互补来筛选插入了外源DNA 的重组质粒? 答:α - 互补指 lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β - 半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。α - 互补是基于在两个不同的缺陷β-半乳糖苷酶之间可实现功能互补而建立的。实现α- 互补主要有两部分组成:LacZ △ M15 ,放在 F 质粒或染色体上,随宿主传代;LacZ' ,放在载体上,作为筛选标记,当在 LacZ' 中插入一个片断后,将不可避免地导致产生无α- 互补能力的β-半乳糖苷酶片断。在诱导物IPTG 和底物 X-gal (同时可作为生色剂)的作用下,含重组质粒的菌落不能产生有活性的β-半乳糖苷酶,不能分解 X-gal ,呈现白色,而含非重组质粒的菌落则呈现兰色。以此达到筛选的目的。 7、试简述λ噬菌体的裂解生长状态Lytic growth 和溶原状态 Lysogenic state 两种循环的分化及其调节过程? 答:裂解生长状态是λ噬菌体在宿主中大量复制并组装成子代λ噬菌体颗粒,导致宿主细胞裂 解。溶原状态为λ噬菌体基因组 DNA 通过位点专一性重组整合到宿主染色体DNA 中随宿主的繁殖传到子代细胞。调节过程:由感染复数

专题一、基因工程知识点归纳

专题一基因工程 一【高考目标定位】 1、专题重点:DNA重组技术所需的三种基本工具;基因工程的基本操作 程序四个步骤;基因工程在农业和医疗等面的应用;蛋白质工程的原理。 2、专题难点:基因工程载体需要具备的条件;从基因文库中获取目的基 因;利用PCR技术扩增目的基因;基因治疗;蛋白质工程的原理。 二【课时安排】2课时 三【考纲知识梳理】 第1节DNA重组技术的基本工具 教材梳理: 知识点一基因工程的概念:基因工程是指按照人们的愿望,进行格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术。 注意:对本概念应从以下几个面理解: 知识点二基因工程的基本工具 1.限制性核酸切酶——“分子手术刀” (1)限制性切酶的来源:主要是从原核生物中分离纯化来的。 (2)限制性切酶的作用:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。(3)限制性切酶的切割式及结果:①在中心轴线两侧将DNA切开,切口是黏性末端。②沿着中心轴线切开DNA,切口是平末端。 2.DNA连接酶——“分子缝合针” (1)来源:大肠杆菌、T4噬菌体 (2)DNA连接酶的种类:E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶。 (3)作用及作用部位:E.coliDNA连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸

二酯键,T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。注意:比较有关的DNA酶 (1)DNA水解酶:能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸,彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基 (2)DNA解旋酶:能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链,作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意:使DNA解成两条长链的法除用解旋酶以外,在适当的高温(如94℃)、重金属盐的作用下,也可使DNA 解旋。 (3)DNA聚合酶:能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。(4)DNA连接酶:是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。注意比较DNA聚合酶和DNA连接酶的异同点。 3.基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” (1)分子运载车的种类:①质粒:常存在于原核细胞和酵母菌中,是一种分子质量较小的环状的裸露的DNA分子,独立于拟核之外。②病毒:常用的病毒有噬菌体、动植物病毒等。 (2)运载体作用:①是用它做运载工具,将目的基因转运到宿主细胞中去。②是利用它在受体细胞对目的基因进行大量复制。 (3)作为运载体必须具备的条件:①在宿主细胞中保存下来并大量复制②有多个限制性切酶切点③有一定的标记基因,便于筛选。 思维探究:知识点3、4、5主要是介绍DNA重组技术的三种基本工具及其作用。限制酶──“分子手术刀”,主要是介绍限制酶的作用,切割后产生的结果。在这部分容学习时,应关心的问题之一是:限制酶从哪里寻找?我们可以联想从前学过的容──噬菌体侵染细菌的实验,进而认识细菌等单细胞生物容易受到自然界外源DNA的入侵。那么这类原核生物之所以长期进化而不绝灭,有保护机制?进而联想到可能是有什么酶来切割外源DNA,而使之失效,达到保护自身的目的”。这样就对“限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来”的认识提高了一个层次。 基因进入受体细胞的载体──“分子运 输车”的学习容,不能仅仅着眼于记住这几个 条件,而应该深入思考每一个条件的涵,通过 深思熟虑,才能真正明确为什么要有这些条件 才能充当载体。 教材拓展: 拓展点一限制酶所识别序列的特点 限制酶所识别的序列的特点是:呈现碱基互补对称,无论是奇数个碱

分子生物学问题汇总

Section A 细胞与大分子 简述复杂大分子的生物学功能及与人类健康的关系。 Section C 核酸的性质 1.DNA的超螺旋结构的特点有哪些? A 发生在闭环双链DNA分子上 B DNA双链轴线高卷曲,与简单的环状相比,连接数发生变化 C 当DNA扭曲方向与双螺旋方向相同时,DNA变得紧绷,为正超螺旋,反之变得松弛为负超螺旋。自然界几乎所有DNA分子超螺旋都为负的,因为能量最低。 2.简述核酸的性质。 A 核酸的稳定性:由于核酸中碱基对的疏水效应以及电荷偶极作用而趋于稳定 B 酸效应:在强酸和高温条件下,核酸完全水解,而在稀酸条件下,DNA的核苷键被选择性地断裂生成脱嘌呤核酸 C 碱效应:当PH超出生理范围时(7-8),碱基的互变异构态发生变化 D 化学变性:一些化学物质如尿素,甲酰胺能破坏DNA和RNA二级结构中的 而使核酸变性。 E 粘性:DNA的粘性是由其形态决定的,DNA分子细长,称为高轴比,可被机械力和超声波剪切而粘性下降。 F 浮力密度:1.7g/cm^3,因此可利用高浓度分子质量的盐溶液进行纯化和分析 G 紫外线吸收:核酸中的芳香族碱基在269nm 处有最大光吸收 H 减色性,热变性,复性。 思考题:提取细菌的质粒依据是核酸的哪些性质? 质粒是抗性基因,,在基因组或者质粒DNA中用碱提取法。 Sectio C 课前提问 1.在1.5mL的离心管中有500μL,取出10 μL稀释至1000 μL后进行检测,测得A260=0.15。 问(1):试管中的DNA浓度是多少? 问(2):如果测得A280=0.078, .A260/A280=?说明什么问题? (1)稀释前的浓度:0.15/20=0.0075 稀释后的浓度:0.0075/100=0.75ug/ml (2)0.15/0.078=1.92〉1.8,说明DNA中混有RNA样品。 2.解释以下两幅图

生物选修3专题1 基因工程知识点复习学案

专题1 基因工程 基因工程的概念 基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过________________________,赋予生物以 _____________________,创造出______________________________________。基因工程是在____________上进行设计和施工的,又叫做__________________。 1. (1 (2 (3 2. (1)两种DNA ②区别:E· (2)与DNA 酸二酯键。 3. (1 (2 _____________________的双链___________DNA (3)其它载体: _________________________________ (二)基因工程的基本操作程序 第一步:__________________________ 1.目的基因是指: ______________________________________________________ 。 2.目的基因可采取_______________-获得,也可以用_____________________。人工合成目的基因的常用方 法有________________和_________________。 3.PCR技术扩增目的基因 (1)原理:_____________________ 将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是________________,其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞:最常用的方法是 _______________。此方法的受体细胞多是 ____________。将目的基因导入微生物细胞:★原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少, 最常用的原核细胞是 ____________,其转化方法是:先用 ________处理细

基因工程和细胞工程测试题(附答案,可用于考试)

5 高二生物《基因工程和细胞工程》测试题姓名班级 (时间:90分钟分数:100分) 一.选择题(本大题包括25题,每题2分,共50分。每题只有一个选项符合题意。) 1.以下说法正确的是() A.所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B.质粒是基因工程中惟一的运载体 C.运载体必须具备的条件之一是:具有多个限制酶切点,以便与外源基因连接D.质粒是广泛存在于细菌细胞中的一种颗粒状细胞器 2.植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不.相符的是() A.纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理——酶的专一性 B.植物组织培养和动物细胞培养——细胞的全能性 C.植物体细胞杂交和动物细胞融合——生物膜的流动性 D.紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养——细胞分裂 3.有关基因工程的叙述正确的是() A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用 B.重组质粒的形成在细胞内完成 C.质粒都可作运载体 D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料 4.能克服远缘杂交障碍培育农作物新品种的技术是() A.基因工程 B.组织培养 C.诱变育种 D.杂交育种 5.下列关于动物细胞培养的叙述,正确的是( ) A.培养人的效应T细胞能产生单克隆抗体 B.培养人的B细胞能够无限地增殖 C.人的成熟红细胞经过培养能形成细胞株 D.用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞 6.PCR技术扩增DNA,需要的条件是( ) ①目的基因②引物③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等⑤mRNA⑥核糖体 A、①②③④ B、②③④⑤ C、①③④⑤ D、①②③⑥ 7.以下对DNA的描述,错误的是() A.人的正常T淋巴细胞中含有人体全部遗传信息 B.同种生物个体间DNA完全相同 C.DNA的基本功能是遗传信息的复制与表达 D.一个DNA分子可以控制多个性状 8. 蛋白质工程中直接需要进行操作的对象是() A.氨基酸结构 B.蛋白质空间结构 C.肽链结构 D.基因结构 9.细胞工程的发展所依赖的理论基础是() A.DNA双螺旋结构模型的建立 B.遗传密码的确立及其通用性的发现 C.生物体细胞全能性的证明 D.遗传信息传递的“中心法则”的发现 10.下列不是基因工程中的目的基因的检测手段的是:() A.分子杂交技术 B.抗原—抗体杂交 C.抗虫或抗病的接种 D.基因枪法 11.在以下4种细胞工程技术中,培育出的新个体中,体内遗传物质均来自一个亲本的是() A.植物组织培养 B. 单克隆抗体 C. 植物体细胞杂交 D.细胞核移植 12.动物细胞融合与植物细胞融合相比特有的是() A.基本原理相同 B.诱导融合的方法类 C.原生质体融合 D.可用灭活的病毒作诱导剂 13.下列哪一项属于克隆() A.将鸡的某个DNA片段整合到小鼠的DNA分子中 B.将抗药菌的某基因引入草履虫的细胞内 C.将鼠骨髓细胞与经过免疫的脾细胞融合成杂交瘤细胞

现代分子生物学总结(朱玉贤、最新版)

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一、绪论 两个经典实验 1、肺炎球菌在老鼠体内的毒性实验:先将光滑型致病菌(S型)烧煮杀活性以后、以及活的粗糙型细菌(R型)分别侵染小鼠发现这些细菌自然丧失了治病能力;当他们将经烧煮杀死的S型细菌和活的R型细菌混合再感染小鼠时,实验小鼠每次都死亡。解剖死鼠,发现有大量活的S型细菌。实验表明,死细菌DNA 进行了可遗传的转化,从而导致小鼠死亡。 2、T2噬菌体感染大肠杆菌:当细菌培养基中分别带有35S或32P标记的氨基酸或核苷酸,子代噬菌体就相应含有35S标记的蛋白质或32P标记的核酸。分别用这些噬菌体感染没有放射性标记的细菌,经过1~2个噬菌体DNA 复制周期后进行检测,子代噬菌体中几乎不含带35S标记的蛋白质,但含30%以上的32P 标记。说明在噬菌体传代过程中发挥作用的可能是DNA而不是蛋白质。 基因的概念:基因是产生一条多肽链或功能RNA分子所必需的全部核苷酸序列。

二、染色体与DNA 嘌呤嘧啶 腺嘌呤鸟嘌呤胞嘧啶尿嘧啶胸腺嘧啶 染色体 性质:1、分子结构相对稳定;2、能够自我复制,使亲、子代之间保持连续性;3、能指导蛋白质的合成,从而控制生命过程;4、能产生可遗传的变异。 组蛋白一般特性:1、进化上极端保守,特别是H3、H4;2、无组织特异性;3、肽链上氨基酸分布的不对称性;4、存在较普遍的修饰作用;5、富含赖氨酸的组蛋白H5 非组蛋白:HMG蛋白;DNA结合蛋白;A24非组蛋白

真核生物基因组DNA 真核细胞基因组最大特点是它含有大量的重复序列,而且功能DNA序列大多被不编码蛋白质的非功能蛋白质所隔开。人们把一种生物单倍体基因组DNA的总量称为C值,在真核生物中C 值一般是随着生物进化而增加的,高等生物的C 值一般大于低等动物,但某些两栖类的C值甚至比哺乳动物还大,这就是著名的C值反常现象。真核细胞DNA序列可被分为3类:不重复序列、中度重复序列、高度重复序列。 真核生物基因组的特点:1、真核生物基因组庞大,一般都远大于原核生物的基因组;2、真核基因组存在大量的的重复序列;3、真核基因组的大部分为非编码序列,占整个基因组序列的90%以上,这是真核生物与细菌和病毒之间的最主要的区别;4、真核基因组的转录产物为单顺反之;5、真核基因组是断裂基因,有内含子结构;6、真核基因组存在大量的顺式元件,包括启动子、增强子、沉默子等;7、真核基因组中存在大量的DNA多态性;8、真核基因组具有端粒结构。

基因工程技术 笔记整理

基因工程技术:按照人们的愿望,进行严密的设计,通过体外DNA重组和转移等技术,有目的地改造生物种性,使现有物种在较短的时间内趋于完善,创造出新的生物类型。 质粒是一种染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、共价闭合环状DNA分子cccDNA,并以超螺旋状态存在于宿主细胞中,它具有自主的复制和转录系统。质粒在细胞内的复制一般有二种:紧密控制型(stringent control)和松弛控制型(relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子;后者在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝。 质粒的不相容性:利用共同复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共存。 从细胞中分离质粒DNA 的方法都包括3个基本步骤:培养细菌使质粒扩增;收集和裂解细胞;分离和纯化质粒DNA。 溶菌酶:破坏菌体细胞壁;SDS和Triton X-100:使细胞膜裂解。 染色体DNA通常用于构建基因组文库和Southern杂交等。 基因组DNA的提取 植物基因组DNA提取:提取缓冲液(Tris.Cl—保持pH,EDTA,NaCl,SDS),氯仿/戊醇/乙醇溶液—沉淀和抽提DNA,异丙醇—沉淀DNA(提染色体),TE(Tris.Cl,EDTA)--溶解DNA,RNase—保存液,降解RNA,NaAC—加盐,70%乙醇—漂洗。 细菌基因组DNA提取:SDS,蛋白酶K,氯仿:异戊醇(24:1)-- 沉淀DNA,苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)-- 抽提,70%乙醇—漂洗,TE,NaCl—调节离子强度,RNase A,CTAB/NaCl 溶液—CTAB--一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性,异丙醇/无水乙醇—沉淀上清液。 总RNA制备 mRNA的分子结构容易受到RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA 酶极为稳定而且广泛存在,因此,在提取过程中应严格防止RNA 酶的污染并设法抑制其活性,这是实验成败的关键。仪器—玻璃器皿:200℃烘2h,塑料器皿:DEPC水液处理—所有器皿最后硅烷化处理。 RNA酶抑制剂:DEPC--强烈但不彻底,与氨水溶液混合会产生致癌物;异硫氰酸胍--最有效,使RNA酶失活;其他--RNA酶蛋白抑制剂(RNasin)SDS, 尿素等。 细胞内总RNA制备方法:异硫氰酸胍热苯酚法、酚/SDS法、Trizol法。(均先将组织在液氮中研磨成粉末) 异硫氰酸胍热苯酚法:异硫氰酸胍(GIT)与β-巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性,GIT与十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl)作用使蛋白质变性。 酚/SDS法:用酚和SDS破碎细胞和去除蛋白质,用LiCl选择沉淀RNA以去除DNA 和其它不纯物。 Trizol法:Trizol试剂(含酚、异硫氰酸胍和溶解剂等)。 mRNA提取 制备mRNA原理:分离的总RNA 可利用mRNA3’端含有poly(A)的特点,用oligo(dT)纤维素柱分离,当RNA流经oligo(dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA被洗下。然后经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。(上样buffer和洗脱buffer)。溶液中无盐时要沉淀RNA,必须加盐NaAC。 琼脂糖凝胶电泳 DNA凝胶电泳:琼脂糖-- 分离DNA片段大小范围广;聚丙烯酰胺-- 小片段,分辨力高。

基因工程期末考试重点知识整理教学文案

基因工程期末考试重点知识整理

基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程(Gene Engineering),是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段:1972,第一个重组DNA分子的构建,构建人:Paul Berg 及其同事PPT 基因工程诞生:1973,Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件: 一系列新的基因工程操作技术的出现; 各种表达克隆载体的成功构建; 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容(P9) 4、基因克隆的通用策略(P12)(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选)

第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念:一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶,主要存在于细菌体内 特点(参加PPT) 命名:依次取宿主属名第一字母,种名头两个字母,菌株号,然后加上序号。如:从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ,Hin指来源于流感嗜血杆菌,d表示来菌株Rd,Ⅲ表示序号。 分类:依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为:Ⅰ型酶、Ⅱ型(Ⅱs型)酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶:α,β,γ,线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ

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分子生物学 第一章绪论 分子生物学研究内容有哪些方面? 1、结构分子生物学; 2、基因表达的调节与控制; 3、DNA重组技术及其应用; 4、结构基因组学、功能基因组学、生物信息学、系统生物学 第二章DNA and Chromosome 1、DNA的变性:在某些理化因素作用下,DNA双链解开成两条单链的过程。 2、DNA复性:变性DNA在适当条件下,分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象。 3、Tm(熔链温度):DNA加热变性时,紫外吸收达到最大值的一半时的温度,即DNA分子内50%的双链结构被解开成单链分子时的温度) 4、退火:热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性,称为退火 5、假基因:基因组中存在的一段与正常基因非常相似但不能表达的DNA序列。以Ψ来表示。 6、C值矛盾或C值悖论:C值的大小与生物的复杂度和进化的地位并不一致,称为C值矛盾或C值悖论(C-Value Paradox)。 7、转座:可移动因子介导的遗传物质的重排现象。 8、转座子:染色体、质粒或噬菌体上可以转移位置的遗传成分 9、DNA二级结构的特点:1)DNA分子是由两条相互平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成;2)DNA分子中的脱氧核苷酸和磷酸交替连接,排在外侧,构成基本骨架,碱基排列在外侧;3)DNA分子表面有大沟和小沟;4)两条链间存在碱基互补,通过氢键连系,且A=T、G ≡ C(碱基互补原则);5)螺旋的螺距为3.4nm,直径为2nm,相邻两个碱基对之间的垂直距离为0.34nm,每圈螺旋包含10个碱基对;6)碱基平面与螺旋纵轴接近垂直,糖环平面接近平行 10、真核生物基因组结构:编码蛋白质或RNA的编码序列和非编码序列,包括编码区两侧的调控序列和编码序列间的间隔序列。 特点:1)真核基因组结构庞大哺乳类生物大于2X109bp;2)单顺反子(单顺反子:一个基因单独转录,一个基因一条mRNA,翻译成一条多肽链;)3)基因不连续性断裂基因(interrupted gene)、内含子(intron)、外显子(exon);4)非编码区较多,多于编码序列(9:1) 5)含有大量重复序列 11、Histon(组蛋白)特点:极端保守性、无组织特异性、氨基酸分布的不对称性、可修饰作用、富含Lys的H5 12、核小体组成:由组蛋白和200bp DNA组成 13、转座的机制:转座时发生的插入作用有一个普遍的特征,那就是受体分子中有一段很短的被称为靶序列的DNA会被复制,使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间。 复制型转座:整个转座子被复制,所移动和转位的仅为原转座子的拷贝。 非复制型转座:原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位。 第三章DNA Replication and repair 1、半保留复制:DNA生物合成时,母链DNA解开为两股单链,各自作为模板(template)按碱

基因工程复习笔记

第一章 一、电泳 电泳(eletrophorosis) :带电荷的分子在电场中以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动.移动速度称为电泳迁移率。 影响因素:1 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 2. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 3当电场强度一定,电泳介质相同,电荷相同的分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状(构型)。 4分子形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大,移动越慢。 指示剂:溴酚蓝(Bb):常用指示剂。分子量670,分子筛效应小,近似于自由电泳,呈蓝紫色。二甲苯青(Xc):分子量554.6,呈蓝色,迁移速度比Bb慢。 染料:溴化乙锭(EB) 1、聚丙烯酰胺凝胶电泳优点:比琼脂糖凝胶的分辨率高的多;回收DNA样品纯度高,无色透明,韧性好,银染的凝胶干燥后可长期保存;能装载的DNA量大,达每孔10μgDNA。 2 、SDS-PAGE 原理:SDS是蛋白质的变性剂,使煮沸变性的蛋白质维持线性状态,并与蛋白质结合,使蛋白质带上相同密度负电荷。SDS与蛋白质结合使蛋白质构象改变,成为形状近似雪茄状的长椭圆棒,SDS-蛋白质复合物短轴相同,而长轴与蛋白质的分子量成正比。

蛋白质-SDS复合物电泳的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响,只与椭圆棒的长度,即蛋白质分子量有关。 二、PCR技术 定义:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)技术,以DNA为模板,在引物、dNTPs、Taq酶的作用下,经变性-退货-延伸反复循环,使某个基因在体外特异性地扩增。 PCR法的原理也是利用人工合成带突变位点的诱变引物,通过PCR 扩增而获得定点突变的基因或DNA片段。 影响因素:(1)Taq DNA聚合酶(具有5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切酶活性,但没有3’→5’外切酶活性因此不能修复错误的碱基配对)。 (2)引物(primer)一般引物设计为长15—30bp;位置与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补(5‘端相同)的短DNA;引物的碱基组成:尽可能提高G+C含量,避免连续相同碱基排列或内部回文序列,避免形成引物二聚体。 (3)引物的Tm值:实际复性温度选择低于Tm值5 oC。 (4)dNTPs 含量适中 (5)Mg 2+ 的浓度 (6)对照实验 三、PCR技术的扩展:反向PCR:不对称PCR:差异显示PCR。反向PCR 原理:扩增两个引物外侧的未知序列,使引物的外侧序列“转变” 成内侧序列。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA,

基因工程期末考试重点知识整理

基因工程 第一章基因工程概述 1、基因工程的概念(基因工程基本技术路线PPT) 基因工程(Gene Engineering),是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术. 2、基因工程的历史 基因工程准备阶段:1972,第一个重组DNA分子的构建,构建人:Paul Berg及其同事PPT 基因工程诞生:1973,Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化 基因工程发展阶段的几个重要事件: 一系列新的基因工程操作技术的出现; 各种表达克隆载体的成功构建; 一系列转基因菌株、转基因植物、转基因动物等的出现 3、基因工程的内容(P9) 4、基因克隆的通用策略(P12)(基因组文库(鸟枪法)+分子杂交筛选) 第二章分子克隆工具酶 5、限制性核酸内切酶的概念、特点、命名、分类(问答) 概念:一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列,并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶,主要存在于细菌体内 特点(参加PPT) 命名:依次取宿主属名第一字母,种名头两个字母,菌株号,然后加上序号。

如:从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind Ⅲ,Hin指来源于流感嗜血杆菌,d表示来菌株Rd,Ⅲ表示序号。 分类:依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为:Ⅰ型酶、Ⅱ型(Ⅱs型)酶和Ⅲ型酶。 真核细胞中有4中DNA聚合酶:α,β,γ,线粒体DNA聚合酶 原核生物中3中DNA聚合酶:Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ 6、几个基本概念 粘性末端:两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的,对称地分布在识别序列中心位置两侧,这样形成的DNA片段末端称为~。 平末端:两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心,这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的,称之为~。 同裂酶:一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列。如:BamHI和BstI均可识别GGATCC。 同尾酶:有些限制性内切酶虽然识别序列不同,但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如:TaqI:TCGA;ClaI:A TCGA T;AccI:GTCGAC 星星活性:某些限制性核酸内切酶在特定条件下,可以在不是原来的识别序列处切割DNA,这种现象称为Star活性。 DNA物理图谱:(多为质粒图谱)

专题1基因工程知识点梳理(含教材答案)

专题1 基因工程 ※基因工程的概念: 基因工程是指按照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做DNA重组技术。 ﹡原理:基因重组 ﹡目的:创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。 ﹡意义:能够打破生物种属的界限(即打破生殖隔离,克服远源杂交不亲和的障碍),在分子水平上定向改变生物的遗传特性。 ﹡操作水平:DNA分子水平 【思考】: (1)基因工程的物质基础是:所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。 (2)基因工程的结构基础是:所有生物的DNA均为双螺旋结构。 (3)一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达,是因为它们共用一套遗传密码子。 一、基因工程的基本工具 1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶) (1)来源:主要是从原核生物中分离纯化出来的。 (2)功能:能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性。 (3)结果:经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式:黏性末端和平末端(回文结构特点)。 ①在中心轴线两侧将DNA切开,切口是黏性末端。 ②沿着中心轴线切开DNA,切口是平末端。 2.“分子缝合针”——DNA连接酶

(1)分类:根据酶的来源不同,可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类 (2)功能:恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。 ★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较: ①相同点:都缝合磷酸二酯键 ②区别:E.coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌,只能使黏性末端之间连接; T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末端之间的效率较低。 (3)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端,形成磷酸二酯键。 (4)与DNA分子相关的酶

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