木瓜蛋白酶的研究进展

木瓜蛋白酶的研究进展2010-2011学年第2学期《食品添加剂》课程论文

得分

摘要

木瓜蛋白酶是一种重要的生化产品，具有较高的热稳定性。在食品工业中主要用于啤酒和其他酒类的澄清，肉类嫰化，饼干、糕点松化及蛋白质水解生产等，在医药工业中也有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域。由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。

关键字:木瓜蛋白酶固定化食品工业

1.木瓜蛋白酶的概述

木瓜蛋白酶（papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素，别名番木瓜酶,木瓜朊酶,番瓜酵素。木瓜酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。

纯木瓜蛋白酶系由212个氨基酸组成的单链蛋白质，相对分子质量为23.406。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶。

2.木瓜蛋白酶的特点

木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。

3.木瓜蛋白酶的作用机制

作用方式：木瓜蛋白酶是一种内切酶，能随机水解淀粉、可溶性糊精以及低聚糖中的a-1,4糖苷键。酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速下降，水解生成糊精及少量葡萄糖和麦芽糖。

木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格。

木瓜蛋白酶（Papain）是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。

木瓜蛋白酶的剪切肽键的机制包括：在His-159作用下Cys-25去质子化，而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放，使得去质子化可以发生；然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳，并与之共价连接形成酰基－酶中间体；接着酶与一个水分子作用，发生去酰基化，并释放肽链的羰基末端。

4.木瓜蛋白酶在各个行业的应用

（1）医药工业应用：

含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。

（2）食品工业应用：

可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，广泛适用于如：鸡、猪、牛、海产品、血制品、大豆、花生等动植物蛋白酶解、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品营养价值，降低成本。有

利于人体的消化和吸收。

（3）饼干行业：

降低面团湿筋度、改良面团可塑性及理化性质，同时使蛋白质大分子水解成短肽和氨基酸，从而有利于糖类和氨基类物质进行复杂的美拉德反应，使产品上色快，色泽悦目有油润光鲜感，疏松酥脆容比力大，断面网状结构明显，层次好；裂饼、碎饼率降低，饼形端正饱满不缩身，花纹清晰，饼面光滑；并且可以相应减少10％-25％的焦亚硫酸钠，从而减少SO2等有害物质的残留量，还可以矫正化学添加剂对饼干风味的影响，有效提高饼干产品的质量。

（4）美容化妆品工业应用：

将木瓜蛋白酶加入到含有蛋白质和油脂的化妆品中，具有独特的美白嫩肤、美颜保健、祛斑除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高产品档次。可制成减肥茶、美容护肤品等。

（5）日化品工业应用：

可加入洗涤剂的配方中，血液和蛋白质用具去污，辅助除去蛋白质为主的污点，加牙膏、漱口水、牙粉等配方中可清洁口腔，除去牙垢和牙结石，与其它溶剂配合可制成隐形眼镜的清洁消毒剂以及感光胶片银的回收等

用于香皂、肥皂、洗涤剂、洗衣粉、洗手液等，去污力强，除菌消毒、安全放心。

（6）饲料工业应用：

用于饲料添加剂，开发蛋白源，利于吸收，提高饲料的利用率，节约成本，有助于牲畜消化，加速生长。如在猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、鱼、虾等饲料中添加。还可以作为蔬菜水果高级复合肥料的添加剂。

（7）皮革工业应用：

利用木瓜蛋白酶制成脱毛剂，鞣制皮革，具有毛孔细腻，皮纹光亮效果。

纺织工业应用：可用于处理羊毛、蚕蛹脱胶、蚕丝精炼，能达到手感柔软、舒适、抗收缩、抗张强度等效果。

（8）细胞培养：

木瓜蛋白酶在准备细胞培养液（cell culture）的第一步中被用于分离细胞。用酶处理小组织块10分钟后，就可以将连接细胞的细胞外基质打断；然后再用蛋白酶抑制剂来停止反应，防止木瓜蛋白酶进一步裂解细胞本身；最后用Pasteur pipette将组织块打散为单细胞悬浮液。

（9）免疫学：

在免疫学中，木瓜蛋白酶可被用于将免疫球蛋白（即抗体）的Fc片段（可结晶）和Fab片段（抗原结合）切割开。

5.木瓜蛋白酶的应用

由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。酶的固定化方法主要有：包埋法（:将酶或含酶菌体包埋在多孔载体中,使酶固定化的方法）、吸附法（利用固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面而使酶固定化的方法）、共价键结合法（利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法）、交联法等。

（1）木瓜蛋白酶的固定化在啤酒澄清中的应用

啤酒在贮存过程中，由于蛋白质好、多酚、碳水化合物及金属催化剂的相互作用，导致

蛋白质与多酚聚合，从而产生沉淀，影响啤酒的质量。生产厂家往往在啤酒中加入50610-?左

右的木瓜蛋白酶。尽管这种做法有其优点，但也有不足之处，如木瓜蛋白酶价格昂贵，只能一次性使用，导致产品价格增加；且木瓜蛋白酶存在于啤酒中会影响啤酒风味和泡沫的稳定性。因而在啤酒生产中需采用固定化木瓜蛋白酶处理技术来提高啤酒的质量，延长其贮存期，进而提高产品的竞争力。

（2）嫩度是肉的主要使用品质之一，也是消费者评判肉质优劣的最常用的指标：影响牛肉嫩度的因素很多，其中牛肉本身影响嫩度因素主要有肌肉组织、结缔组织的含量极其性质、肌原纤维蛋白的化学结构状态、持水力的大小、脂肪组织的分布情况等因素。木瓜蛋白酶是一种含巯基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，对动植物蛋白、多态、酯、酰胺等有非常强的水解能力。优化的木瓜蛋白酶嫰化牛肉的最佳工艺条件为：木瓜蛋白酶溶液浓度0.03%、pH5.9、嫰化时间13h ，嫰化牛肉的剪切力为1.64kg 。

6、趋势与发展

制备固定化木瓜蛋白酶的方法很多,从这些大量的研究可以看出,酶经固定化以后,由于受到载体等因素的影响,其特征会发生某些改变。为此,在固定化酶的应用过程中,必须了解固定化酶与游离酶性质之差别,掌握这些性质对固定化酶的应用有重要意义,以适当调整工艺,使其在最适条件下催化反应。由于研究者的实验设计等不同,所以很难评价各种固定化方法的优劣。不同方法制备的固定化木瓜蛋白酶适用范围不同,应根据实际需要确定,以便让技术能更好地服务生产。

木瓜蛋白酶经各种方法固定后,稳定性增强、最适温度升高、pH 耐受范围增宽、酶活力提高、半衰期延长等,这表明采用的固定化方法正确,应循序渐进,寻找更佳的结果。在现有已取得的研究成果的基础上,如何进一步地提高固定化酶的活性和对底物的亲和力是今后研究的重点。

总结近年来对固定化木瓜蛋白酶的研究进展,可以看到随着技术不断进步,固定化木瓜蛋白酶的催化活性、稳定性等令人满意。固定化酶技术能实现酶的反复利用和原料、产物及酶三者间的有效分离, 从而简化分离工艺及设备, 缩短生产周期, 降低生产成本,固定化酶将成为酶在工业上的重要应用形式。酶固定化技术的日益成熟将使木瓜蛋白酶在食品、饮料、医药、化学试剂、饲料、纺织及化妆品等方面发挥出更加巨大的作用。

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木瓜蛋白酶活力测定方法

木瓜蛋白酶活力测定方法 分别精密量取酪蛋白溶液5ml，置3支具塞试管中，置40℃水浴中保温10分钟，各精密加入供试品溶液2ml，摇匀，置40℃水浴中，开始记时，准确反应1小时，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，置40℃水浴中放置30~40分钟，使沉淀的蛋白质完全凝固，滤过，滤液作为供试品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具试管，于40℃水浴中保温1小时，精密加入三氯醋酸溶液5ml，强力振摇混匀，精密加入供试品溶液2ml，置40℃水浴中放置30~40分钟，滤过，滤液作为空白溶液。照分光光度法（中国药典2000年版二部附录IV A），以0.1mol/L 盐酸溶液为空白，在275nm的波长处测定空白溶液、供试品溶液和对照品溶液的吸收度，按下式计算： 效价（单位/mg）=A/As＊Cs＊12/2＊稀释倍数/W 式中A为供试品溶液的吸收度减去空白溶液的吸收度： As为酪氨酸对照品溶液的吸收度： Cs为酪氨酸对照品溶液的浓度， ug/ml W为供试品重量，mg; 在上述条件下，释放1ug的酪氨酸的酶量为一个活力单位。 试剂酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氢二钠溶液50ml,置沸水浴中煮30分钟，时时搅拌，冷至室温，加0.05mol/L枸椽酸溶液调节PH至6.0±0.1，并迅速搅拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀释至100ml（临用新配）。酶稀释液：取无水磷酸氢二钠3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二钠1.1g和盐酸半胱氨酸2.74g，振摇溶解，用1mol/L盐酸或1mol/L氢氧化钠溶液调节PH6.5±0.1，用水稀释至500ml,混匀（临用新配）三氯醋酸溶液:取三氯醋酸17.99g，加醋酸钠29.94g和冰醋酸18.9ml，加适量水溶解后，加水使成1000ml，摇匀。 酶活力测定对照品溶液的制备:精密称取已105℃干燥至恒重的酪氨酸对照品适量，用0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml中约含40ug的溶液。供试品溶液的制备:取本品适量（约相当于木瓜酶活力120万单位），精密称定，加酶稀释液振摇，制成每1ml中含200~300单位的溶液，摇匀。 淀粉酶活力测定 实验技术 2008-05-27 18:01:29 阅读213 评论0字号：大中小 一、目的 淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6 糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的重要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、 纺织工业的基本原料。 淀粉酶是加水分解淀粉的酶的总称，淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的依 据，也是生物体利用淀粉进行代谢的初级反应。小麦成熟期如遇阴雨天气，有的品种会发生

木瓜蛋白酶在美白护肤中的应用

南宁东恒华道生物科技有限责任公司——专业酶制剂生产厂家 销售热线4000-0771-80 木瓜蛋白酶在美白护肤中的应用美白产品在行业中的现状 人体到了25岁以后，身体的新陈代谢功能减慢，黑色素无法正常排解，而在角质层沉积形成斑点，形成黄褐斑、黑斑和色斑等。统计资料显示，13亿人口的中国，祛斑美容产品每年的市场份额已超过100亿元,年利润在千万元以上。国内美白、祛斑类产品已成为护肤品中的主流产品之一，而美白护肤产品绝大多数属于化学试剂或植物提取物，效果有限而且副作用明显，严重影响了用户的持续使用和行业的发展。 美白产品在行业中存在的问题 美白是全世界的难题，有一些不良商家为了使护肤品达到良好的美白效果，在护肤品中添加一些金属元素如汞、铅等。添加汞后，汞化合物会破坏表皮层的酵素活动，使黑色素无法形成。铅的氧化物具有一定遮盖作用，也可用于美白。如果化妆品中添加了砷、汞、铅，长期使用对人体造成的损害最大。在SK—II 之后，又有4大著名化妆品品牌(迪奥、雅诗兰黛、兰蔻、倩碧)的6款粉饼产品被香港媒体披露含有重金属铬和钕。消费者不仅感到恐惧，也对化妆品的安全性产生怀疑。 木瓜蛋白酶在行业中的应用 木瓜酶是从番木瓜水果中提取而得含有多种生物酶的美白去斑生物产品，主要作用为嫩肤及美白去斑。其生物机理学： 第一，木瓜酶作用于人体皮肤老化角质层，促使其分解退化、去除，达到嫩肤效果及促进细胞生长的效果，且木瓜酶水解物在皮肤表层形成一层氨基酸衍生物薄膜，使肌肤保持润湿与光滑； 第二，木瓜酶易于与形成色斑的黑色素中的铜离子形成络合物，减少黑色素的形成和去除色斑的黑色素，且木瓜酶水解的三钛物质可直接抑制形成黑色素的络氨酸活性，消除自由基作用，从而达到美白去斑的效果。 归结起来，木瓜酶通过去除老化皮肤角质层及与色斑中铜离子快速反应，抑制形成黑色素的络氨酸活性和去除氧化自由基，达到嫩肤美白去斑的功效。 1

木瓜蛋白酶提取实验记录

木瓜蛋白酶实验记录 2016.11.3 实验前准备： 所需试剂的配制： 饱和硫酸铵：取150ml蒸馏水，放入冰桶中，不断加入硫酸铵固体，直至沉淀不能溶解，过滤取滤液，保存在4℃冰箱中。 酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH 至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。 预实验：确定实验的可行性 酶液提取： ①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。 ②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。 ③收集5ml乳汁加入95ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。 ④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。 ⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液。 ⑥分装木瓜蛋白酶原液，加入2ml酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.002mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。

对静置的酶液继续处理

2016．11.4 试剂配制 考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。 重提木瓜蛋白酶 实验设置对照 一组开始即加入酶保护剂编号酶B*、一组加硫酸铵之前才加酶保编号酶*。 ①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。 ②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。 ③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。 ④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。 ⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取

木瓜蛋白酶的提取

木瓜蛋白酶的提取、分离纯化及其生物学研究综述及实验方法 13生物技术第二大组第二小组 组员：王玓玥（组长）、王子贺、王思瑶、王宇涛、王守鑫、谭国栋一、研究背景： 在经济飞速发展的今天，人们的生活水平已远远不只在于吃饱穿暖，食品的安全和营养问题受到人们越来越多的关注，绿色健康的生活也成为大家共同的追求，木瓜蛋白酶以它自身耐热及特殊结构等特点被广泛的用于食品行业，如何分离纯化得到高纯度低成本的木瓜蛋白酶则是人们现在研究的重点，本小组便也以此为研究主题展开实验。 二、木瓜蛋白酶基本介绍：木瓜蛋白酶，又称木瓜酶，是一 种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，这种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，当Cys25被氧化剂氧化或与金属离子结合时，酶的活力被抑制，而还原剂半胱氨酸（或亚硫酸盐）或EDTA能恢复酶的活力木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观

为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶 的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。。另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白质的45%；（3）

木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶 一、名称和属性 广义的木瓜酶指的是木瓜蛋白酶（Papain）、木瓜凝乳蛋白酶（Chymopapain）、淀粉酶（Amylase）等等组成的复合酶，这里主要讨论木瓜蛋白酶。木瓜蛋白酶（Papain），或简称木瓜酶、木瓜酵素，又称嫩精或木瓜粉，是存在于木瓜果实中的一种半胱氨酸酶，属于蛋白水解酶。 二、作用机制 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。 木瓜蛋白酶的剪切肽键的机制包括：在His-159作用下Cys-25去质子化，而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放，使得去质子化可以发生；然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳，并与之共价连接形成酰基－酶中间体；接着酶与一个水分子作用，发生去酰基化，并释放肽链的羰基末端。 三、应用情况 木瓜酶具有纯天然、无毒无害、使用安全等功能特性，而被广泛用于食品、美容化妆品、医药保健品、日化品、饲料、皮革、纺织品等行业，并远销日本、韩国、美国、俄罗斯、马来西亚等国外市场。 国际上FAO／WHO把木瓜蛋白酶列为A级食品添加剂，其使用量可不受限制；中国食品添加剂标准化技术委员会也已批准将木瓜蛋白酶列入使用品种。 3.1食品行业 木瓜蛋白酶主要被用于将硬的肉纤维（蛋白质组成）切断，并且该用途已经被南美洲的土著居民使用了数千年。该酶是嫩肉粉（在大多数的超级市场都可以买到）的成分之一。 3.2生化行业 木瓜蛋白酶在准备细胞培养液（cell culture）的第一步中被用于分离细胞。用酶处理小组织块10分钟后，就可以将连接细胞的细胞外基质打断；然后再用蛋白酶抑制剂来停止反应，防止木瓜蛋白酶进一步裂解细胞本身；最后用Pasteur pipette将组织块打散为单细胞悬浮液。 3.3医药行业

木瓜蛋白酶酶活力检测方法

木瓜蛋白酶酶活力检测方法 南宁庞博生物工程有限公司企业标准 Q/NPB 01-2019 食品添加剂木瓜蛋白酶制剂 1、范围 本标准规定了食品添加剂木瓜蛋白酶制剂的原辅料要求、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存。 本标准适用于以木瓜果乳汁为原料，添加葡萄糖，经浸泡提取、过滤、浓缩、干燥、调配粉碎、包装等工艺制成的食品添加剂木瓜蛋白酶制剂。 2、规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 191-2019 包装储运图示标志 GB/T 601-2002 化学试剂标准滴定溶液的制备 GB/T 602-2002 化学试剂杂质测定用标准溶液的制备 GB/T 603-2002 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB 2760 食品添加剂使用卫生标准 GB/T 4789.2-2019 食品卫生微生物检验菌落总数的测定 GB/T 4789.3-2019 食品卫生微生物检验大肠菌群计数 GB/T 4789.4-2019 食品卫生微生物检验沙门氏菌检测 GB/T 4789.6-2019 食品卫生微生物检验致泻大肠埃希氏菌检测 GB/T 4789.10-2019 食品卫生微生物检验金黄色葡萄球菌检验 GB/T 5009.3-2019 食品中水分的测定 GB/T 5009.74-2019 食品添加剂中重金属限量试验 GB/T 5009.75-2019 食品添加剂中铅的测定 GB/T 5009.76-2019 食品添加剂中砷的测定 GB 5749-2019 生活饮用水卫生标准 GB/T 6682-2019 分析实验室用水规格和试验方法 GB 7718 预包装食品标签通则 GB/T 8170-2019 数值修约规则与极限数值的表示和判定 GB/T 20880-2019 食用葡萄糖 JJF 1070 定量包装商品净含量检验规则 NY/T 691-2019 番木瓜

木瓜蛋白酶

发酵工程与设备课程论文 题目木瓜蛋白酶 班别学号 姓名 成绩

木瓜蛋白酶 摘要：木瓜蛋白酶是一种能分解蛋白质的蛋白酶。先了解木瓜蛋白酶的制备及保存，接着分析它的化学修饰和酶活力的影响。最后，木瓜蛋白酶的固定化及方法以及它在各个行业的应用。Abstract: Papain is a protease that breaks down proteins.To understand the preparation and preservation of papain and then analyzed its chemical modification and enzyme activities.Finally, the immobilized papain and the method and its application in various industries 关键字：木瓜蛋白酶化学修饰酶活力固定化行业的应用Keywords:papain Chemical modification enzyme immobilization industry applications 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。它是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。 作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。 一、木瓜蛋白酶的制备及保存 木瓜蛋白酶的制备是将未成熟番木瓜果实割取乳液去杂，在室温下，入半胱氨酸溶液在研钵中充分磨匀，静置后取上清液即

碱性蛋白酶

碱性蛋白酶 产品概述 奥迪尔碱性蛋白酶是经原生质体诱变方法选育的枯草杆菌通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶。广泛应用于制革、丝绸、食品、医疗、酿造等行业。 产品原理 碱性蛋白酶活性成分属于一种丝氨酸内切碱性蛋白酶，它能水解蛋白质分子肽链生成多肽或氨基酸，在有机溶剂中它还可催化多肽的合成。 产品特性 1.温度范围：有效温度范围20-60℃，最适温度范围在35-45℃。 2.PH值范围：有效pH范围6-11，最适pH值范围9.5-10.5 产品性状 1.产品规格：固体100000u/g，200000u/g粉末（颗粒状）；液体 100000u/ml 液体酶pH（25℃）：7.0-9.0，容重：≤1.25g/ml；固体酶细度（0.4mm标准筛通过率）：≥80%。 2.酶活力定义：1g固体酶粉（或1ml液体酶），在40℃±0.2℃、 pH10.5条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。

3.产品标准：执行中华人民共和国国家标准GB/T23527-2009 应用方法 1.碱性蛋白酶用于皮革加工具有简化工序、缩短周期、提高成品质 量、增加的率、降低生产成本等优点。用于浸水工序的加酶量为 0.02-0.1%（按原料质量计，酶活力以10万u/ml计，下同），20- 25℃作用12-20小时；用于皮革软化的加酶量为0.05-0.2%,35-38℃作用3-6小时；用于脱毛的加酶量为0.1-0.3%，20-35℃作用12-20小时。以上使用pH均为9-11. 2.碱性蛋白酶用于丝绸脱胶有丝素不受损伤、不起毛丝和蓬松的效 果。原料经过前处理，按0.8-2.4%加酶，pH9-11,40-50℃的条件下作用30-60min。 3.碱性蛋白酶用于软骨素生产，可有效提高收率和纯度。原料在碱 提取后，按照0.2-0.6%的添加量，pH8-10，温度40-50℃的酶解条件作用4-8小时。 4.碱性蛋白酶用于肝素钠的生产，可提高分子均一性和产品纯度。 原料盐解后按照2-4g碱性蛋白酶每根小肠的加量，在45-60℃、pH9-11的条件下保温4-6小时。 5.碱性蛋白酶用于活性肽等蛋白质原料加工中，可提高营养价值， 易于吸收。推荐用法为：料液比1:3-9，pH值8-10，温度50-

木瓜蛋白酶中英文对照

Papain Papain [9001-73-4] Papain is a purified proteolytic substance derived from Carica papaya Linné(Fam.caricaceae).papain,when assayed directed herein, contains not less than 6000 units per mg. Papain of a higher digestive power may be reduced to the official standard by admixture with papain of lower activity ,lactose,or other suitable diluents. One USP Unit of papain is the activity that releases the of 1μg of tyrosine from a specified casein substance under the conditions of the Assay， using the enzyme concentration that liberates 40μg of tyrosine per mL of test solution. Packaging and storage－Preserve in tight,light-resistant containers in a cool place. USP reference standards (11)—USP papain RS. pH<791>:between 4.8 and 6.2 in a solution (1 in 50). Loss on drying <731>—Dry it in a vacuum oven at 60℃ for 4 hours : it losses not more than 7.0% of its weight. Assay (casein digestive power)— Dibasic sodium phosphate.,0.05M—dissolve 7.1g of anhydrous dibasic sodium phosphate in water to make 1000mL.add 1 drop of toluene as a preservative. Citric acid,0.05M—dissolve 10.5g of citric acid monohydrate in water to make 1000mL. Add 1 drop on toluene as a preservative. Casein substrate—Disperse 1 g of Hammersten-type casein in 50 mL on 0.05M Dibasic sodium phosphate. Place in a boiling water bath for 30 minutes with occasional stirring.Cool to room temperature ,and add 0.05 M Citric acid to adjust to a pH of 6.0±0.1.stir the solution rapidly and continuously during the addition of the 0.05M Citric acid to prevent precipitation of the casein. Dilute with water to 100 mL .prepare fresh daily. Buffer solution (Phosphate-Cysteine Disodium ethylenediaminetetraacetate Buffer)

木瓜蛋白酶的研究进展

木瓜蛋白酶的研究进展2010-2011学年第2学期《食品添加剂》课程论文 得分

摘要 木瓜蛋白酶是一种重要的生化产品，具有较高的热稳定性。在食品工业中主要用于啤酒和其他酒类的澄清，肉类嫰化，饼干、糕点松化及蛋白质水解生产等，在医药工业中也有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域。由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化木瓜蛋白酶。 关键字:木瓜蛋白酶固定化食品工业

1.木瓜蛋白酶的概述 木瓜蛋白酶（papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素，别名番木瓜酶,木瓜朊酶,番瓜酵素。木瓜酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，应用于啤酒及食品工业。 纯木瓜蛋白酶系由212个氨基酸组成的单链蛋白质，相对分子质量为23.406。制品可含有木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶和溶菌酶等不同的酶。 2.木瓜蛋白酶的特点 木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。 3.木瓜蛋白酶的作用机制 作用方式：木瓜蛋白酶是一种内切酶，能随机水解淀粉、可溶性糊精以及低聚糖中的a-1,4糖苷键。酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速下降，水解生成糊精及少量葡萄糖和麦芽糖。 木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格。 木瓜蛋白酶（Papain）是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。 木瓜蛋白酶的剪切肽键的机制包括：在His-159作用下Cys-25去质子化，而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放，使得去质子化可以发生；然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳，并与之共价连接形成酰基－酶中间体；接着酶与一个水分子作用，发生去酰基化，并释放肽链的羰基末端。 4.木瓜蛋白酶在各个行业的应用 （1）医药工业应用： 含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。 （2）食品工业应用： 可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸，广泛适用于如：鸡、猪、牛、海产品、血制品、大豆、花生等动植物蛋白酶解、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品营养价值，降低成本。有

碱性蛋白酶活力的测定

实验四碱性蛋白酶活力的测定 一、实验原理 以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。 二、试剂和仪器 试剂：0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶液（称取5g酪蛋白置于500mL 0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解）、0.4mol/L碳酸钠溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin试剂，稀释3倍使用 仪器：水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器 三、实验步骤 1、酶液的萃取 称取1g粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。 2、酶活力的测定 样品管：取不同量的酶液（0.1~1.0mL：0.2mL、0.4mL、0.6mL），用0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）（对应为0.8mL、0.6mL、0.4mL）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀，在40℃准确保温10min，加入2mL 5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静置半小时。 空白管：先在每支试管中各加入1.0mL 1%酪蛋白溶液和2.0mL 5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入1.0mL的酶液，酶液浓度分别与对应的样品管相同，在40℃下准确保温10min，以下操作同样品管。 将酶反应混合物过滤后收集滤液，在1mL滤液中加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶

木瓜蛋白酶应用及研究进展

木瓜蛋白酶应用及研究进展 摘要本文主要介绍了木瓜蛋白酶的作用机理，在医药、食品、化工、科研等方面的应用，以及在木瓜蛋白酶的固定等方 面的最新研究进展。 关键字木瓜蛋白酶应用酶的固定化发展 一、简介 木瓜蛋白酶，是一种蛋白水解酶，可将抗体分子水解为3个片段。是番木瓜中含有的一种低特异性蛋白水解酶，活性中心含半胱氨酸，属巯基蛋白酶，主要应用于啤酒及食品工业。 二、作用机理 木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜木瓜蛋白酶氨酸残基羧基参与形成的肽键。这种酶属于内肽酶，能切开蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。是一种存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。木瓜蛋白酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。这种酶是利用未成熟的番木瓜果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。

木瓜蛋白酶最适PH值和温度

木瓜蛋白酶最适PH值和温度 木瓜蛋白酶﹙Papain﹚是由种植的番木瓜未成熟果实中割取乳液经采用生物技术提取、微滤、超滤、冷冻干燥提练而得的纯天然、健康、安全、高效的生物酶制剂。本品是蛋白酶混合物，含木瓜蛋白酶、木瓜凝乳酶、木瓜肽酶。有很强的蛋白水解催化活性及凝乳、溶菌活性，还具备脂解能力及蛋白合成能力，主要是催化蛋白质水解，切割分解点很多，优先分解精氨酸，苯丙氨酸的肽鍵。木瓜蛋白酶是由212个氨基酸组成，分子量为21000，属于含疏基﹙—SH﹚肽链内切酶，由于木瓜蛋白酶具有酶活高，热稳定性好，可广泛应用于食品、医药、日化、饲料、皮革及纺织等行业。 一、酶解原理 在一定温度，PH值及底物浓度下，木瓜蛋白酶能够分解蛋白质生成蛋白胨，多肽及氨基酸等物质。 二、活力定义 紫外光分光度法：在测定条件（37±0.2℃；PH值7.0）每分钟水解酪蛋白释出的三氯乙酸可溶物在275nm波长有吸光度与1微克酪氨酸的吸光度相当时，所需的酶量即为一个活力单位，用u/g表示。 三．木瓜酶最适PH值 木瓜蛋白酶的最适pH值：每个酶都有最适pH，在此pH下催化反应的速率是它的最高值。木瓜蛋白酶可进行催化反应的pH作用范围是3.5~9，最适pH范围是5~7。 四、木瓜酶最适温度 木瓜蛋白酶的最适温度：木瓜蛋白酶最佳温度是50~60℃，最佳的温度必然受作用时间的影响，较短的作用时间必须有较高的最适温度，较长的作用时间必须有较低的最适作用温度，这是木瓜蛋白酶与其他酶类的共同特点。 木瓜蛋白酶的有效作用温度范围是20~80℃。这个温度范围既适合木瓜乳汁生产粗酶的温度，也适合木瓜蛋白酶在一定条件下的活性反应作用。超过80℃时，木瓜蛋白酶活性会下降，当温度升到90℃时木瓜蛋白酶会钝化。

蛋白酶的生产和应用_下_

文章编号:1006-8481(2007)04-0001-04 蛋白酶的生产和应用(下) 胡学智 (中国科学院上海生物工程研究中心,上海　200000) 摘　要:为充分了解蛋白酶,介绍了我国在中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、低温蛋白酶和耐高温蛋白酶研究概况。 关键词:蛋白酶;研究;概况 中图分类号:TS201.2+5 文献标识码:B The producti on and appli ca ti on of protea se HU Xue -zhi (B i oengineering Research Center,Chinese Acade my of Sciences,Shanghai,200000) Abstract:I n order t o have a better understanding of p r otease,s ome general studies about different p r oteases are intr o 2duced .They are neutral p r otease,alkaline p r otease,acid p r otease,cryo -p r otease and p r otease with high -te mperature t olerance . Key W ords:p r otease;study;general intr oducti on 4　我国对蛋白酶的研制概况 4.1　中性蛋白酶 我国对蛋白酶的研究始于1957年,当年中科院微生物研究所和原轻工业部工业试验所曾收集和保存了一批酱油酿造用曲霉,肖永澜和方心芳等从117株黄绿色曲霉中筛选出了12株蛋白酶活性高的曲霉,其中以栖土曲霉3374的活性最强,将其用于试验蛋白胨。1959年,原上海市轻工业研究所与红光制革厂合作,进行制革原料皮酶脱毛的研究,将脱脂的带毛皮块直接投入众多曲霉培养物中,筛选出适用的菌株,很快就发现了3374效果最好。因此,在原上海酒精厂制曲车间 生产栖土曲霉蛋白酶夫曲作为酶源供制革厂使 用。何秉旺等用紫外线处理栖土曲霉3374得突变株3942,使蛋白酶活力提高28%。李禄先等又筛选出用于丝绸脱胶的芽孢杆菌蛋白酶生产株S 114。1964年,中科院微生物所、江苏省食品发酵 研究所合作,就北微所筛选的枯草杆菌1938蛋白酶的生产条件进行详细研究。1965年完成中试后于新建的无锡酶制剂厂投产。1965年上海市工业微生物研究所对栖土曲霉3942蛋白酶的液体和固体培养工艺条件进行了研究,发现当采用固体培养时,添加3%～5%纯碱,碱性、中性蛋白酶活性可增加30%,采用液体培养时添加洗净剂LS 0.1%,可使通风量下降50%以上,酶活性增加60%。1967年与温州味精厂合作完成中试。 为筛选制革用新菌种,轻工业部食品发酵研究所 收稿日期:2006-07-07 作者简介:胡学智(1929-),男,上海市人,教授级高级工程师。研究方向:生物技术与发酵工程。 ? 1?

木瓜蛋白酶的开发与应用

木瓜蛋白酶的开发与应用 作者：吉财（学院：制药工程专业：制药工程） [摘要]研究了木瓜蛋白酶生产工艺中的几个重要环节G 结果表明: 用丹宁沉淀法既可提高产品产量又可保持产品质量; 硫代硫酸钠和半胱氨酸是木瓜蛋白酶活性的有效保护剂可使酶活性比对照提高2. 39倍; 提取过程中用抗坏血酸~ EDTANa2 和氯化钠可有效地提高产品的活性和质量G 关键词：木瓜蛋白酶；木瓜凝乳酶；固定化酶；嫩肉粉 The development and application of papain The author：jicai（College：Pharmaceutical engineering Pofessional:Pharmaceutical engineering ) [Pick to]Papain were studied in the process of production of several important links G results show that with tannin precipitation can improve products production and can keep the quality of the products; Sodium thiosulfate and cysteine is the activity of papain and effective protective agent Higher than that of contrast can make the enzyme activity 2. 39 times; Extraction process with ~ EDTANa2 ascorbic acid and sodium chloride can effectively improve the product quality of activity and G Key words:Papain;Papaya rennet; Immobilized enzyme; Tender meat powder 木瓜蛋白酶（papain）来源于未成熟番木瓜（Carica papaya）果实的新鲜乳汁，是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M）[1]，其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。 1 木瓜蛋白酶的分离与纯化 1.1木瓜蛋白的组分 \ 工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。由木瓜乳胶提取粗制酶,除含有木瓜蛋白酶外,还含有半耽氨酸蛋白酶、纤维素酶、溶菌酶、谷氨酞胺以及

碱性蛋白酶活性测定试剂盒使用说明

碱性蛋白酶活性测定试剂盒使用说明 分光光度法注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定 货号：BC2300 规格：50T/24样 产品内容： 试剂一：液体×1瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10mL蒸馏水溶解。 试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入10mL试剂一，沸水浴中溶解。 试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加50mL蒸馏水溶解。 试剂五：液体×1瓶，4℃保存。 标准品：液体×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。 产品说明： AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。 在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。需自备的仪器和用品： 可见分光光度计、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、 1.5mL EP管、1mL玻璃比色皿和蒸馏水。 操作步骤： 一、粗酶液提取： 1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组

织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。 2.血清或培养液：直接测定。 3.细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。 二、测定操作： 1.分光光度计预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。 2.试剂二、试剂三和试剂四置于40℃水浴保温30min。 3.对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培养液），200μL试剂二，混匀后置于40℃水浴保温10min；加入200μL试剂三，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A对照管。 4.测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液（血清或培养液），200μL试剂三，混匀后置于40℃水浴保温10min；加入200μL试剂二，混匀后8000g，4℃离心10min；取200μL上清液，加入新的EP管，再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A测定管。（注意与对照管不同，先加试剂三，后加试剂二） 5.空白管：取一支EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂四200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。 6．标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于40℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A标准管。 注意：空白管和标准管只需测定一次。 三、计算公式： 1.按照样本蛋白浓度计算 AKP活性单位定义：40℃每毫克蛋白每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。AKP活性（nmol/min/mg prot）=C标准品×（A测定管－A对照管）÷（A标准管－A空白

木瓜蛋白酶在肥料中的应用

木瓜蛋白酶在肥料中的应用 木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶，番木瓜（Carieapapaya）中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶就是由种植的番木瓜未成熟果实中割取乳液经采用生物技术提取、微滤、超滤、冷冻干燥提练而得的纯天然、健康、安全、高效的生物酶制剂。 1.组成结构 木瓜蛋白酶是由212个氨基酸组成，属于含巯基（—SH）肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的酶解能力，同时还具有合成的能力，可把蛋白质水解物再合成蛋白质类物质，这种能力可用来改善动植物蛋白的营养价值或功能性质。 番木瓜未成熟果实中含有木瓜蛋白酶(Papain)、木瓜凝乳蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、木瓜肽酶等多种蛋白水解酶。且已知四种半胱氨酸蛋白酶的一级结构具有高度的同源性。其中，木瓜蛋白酶属巯基蛋白酶，可水解蛋白质和多肽中精氨酸和赖氨酸的羧基端，并能优先水解那些在肽键的N-端具有二个羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽键。 木瓜蛋白酶是一种蛋白水解酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，含有212个氨基酸残基。至少有三个氨基酸残基存在于酶的活性中心部位，他们分别是Cys25、His159和Asp158，另外六个半胱氨酸残基形成了三对二硫键,且都不在活性部位。纯木瓜蛋白酶制品可含有：（1）木瓜蛋白酶，分子量21000，约占可溶性蛋白质的10%；（2）木瓜凝乳蛋白酶，分子量26000，约占可溶性蛋白

质的45%；（3）溶菌酶，分子量25000，约占可溶性蛋白质的20%；及纤维素酶等不同的酶。 2.化学性质 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性；木瓜蛋白酶溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。木瓜蛋白酶是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，但几乎不能分解蛋白胨。木瓜蛋白酶的最适合PH值6～7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点（pI）为8.75；木瓜蛋白酶的最适合温度55～65℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。 3.催化机制 木瓜蛋白酶的剪切肽键的机制包括：在His-159作用下Cys-25去质子化，而Asn-158能够帮助His-159的咪唑环的摆放，使得去质子化可以发生；然后Cys-25亲核攻击肽主链上的羰基碳，并与之共价连接形成酰基－酶中间体；接着酶与一个水分子作用，发生去酰基化，并释放肽链的羰基末端。 4.功能特性