异烟肼灌胃建立小鼠急性肝损伤模型的研究_禄保平
·论著·异烟肼灌胃建立小鼠急性肝损伤
模型的研究
禄保平，杨晓娜，许家艳
【摘要】
目的探索应用异烟肼灌胃建立小鼠急性肝损伤模型，并初步阐明其机制。
方法昆明种小鼠 50 只，随机分为异烟肼正常剂量造模组（常量组）、2 倍剂量造模组（2 倍量组）、5 倍剂量造模组（5 倍量组）、8 倍剂量造模组（8 倍量组）和空白对照组，每组各 10 只。各造模组分别以 90、180、450、720 mg/kg 剂量的异烟肼灌胃，18 h 后检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平并取肝组织进行光镜观察，探索导致明显急性肝损伤的相对合适剂量。另取昆明种小鼠 90 只，随机分为单纯造模组（40 只）、干预造模组（40 只）和空白对照组（10 只），各造模组以相对合适剂量异烟肼灌胃，其中干预造模组于造模前以甘利欣75 mg/kg 体重连续灌胃 5 d，18、36、54、72 h 后分别检测血清 ALT、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧物酶（GSH-Px）水平，并进行肝组织光镜和电镜观察，探索导致明显急性肝损伤的相对合适时间及可能机制。
结果在探索相对合适剂量实验中，2 倍量组小鼠血清ALT、AST 分别为（101.6 ± 6.3）和（108.1 ± 14.9）U/L，明显高于空白对照组的（30.1 ± 3.6）、（35.3 ± 6.5）U/L 和常量组的（52.8 ± 5.3）、（53.9 ± 8.9）U/L，差异均有统计学意义（均P < 0.05），肝细胞出现广泛的脂肪变性和水肿，肝窦几乎消失；5 倍量组小鼠死亡 7 只，8 倍量组小鼠则全部死亡。在探索相对合适时间及发生机制实验中，应用2 倍剂量异烟肼灌胃后 18 h，单纯造模组小鼠血清 ALT、MDA 水平明显高于空白对照组，SOD、GSH-Px 水平明显低于空白对照组，肝细胞广泛损伤，细胞超微结构显著变化。
结论应用 2 倍剂量（180 mg/kg）异烟肼灌胃可成功建立小鼠急性肝损伤模型。异烟肼所致急性肝损伤可能与自由基脂质过氧化反应密切相关。
【关键词】肝脏疾病；模型，动物；异烟肼；脂质过氧化作用
中国医药生物技术, 2007, 2(4):286-290
https://www.wendangku.net/doc/5a15239995.html,
随着化学合成药物的广泛应用，药物性肝损伤（drug-induced liver injury，DILI）已成为临床常见的导致肝损伤的因素。其发生机制尚不十分明了，临床也缺乏有效的治疗方法。而目前开展 DILI 基础研究所用的动物模型多为化学性或免疫性肝损伤模型，与临床实际很难相符。积极开展 DILI 动物模型的研究，进一步揭示其发生机制，具有较大的学术价值和临床指导意义。异烟肼是一种高效、低毒的一线抗结核药物，临床常用于各种类型结核病的治疗。肝脏毒性是异烟肼的主要不良反应[1]，约有 10% 的结核病患者用药后可发生药物性肝炎，极少数可产生重症肝炎[2]，0.5% ~ 4% 的用药者可发生黄疸，10% ~ 20% 的用药者可出现丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高[3]。为进一步阐明异烟肼致肝损伤的机制，并为药物性肝损伤的基础研究提供一种新的动物模型，我们探索应用异烟肼片灌胃复制小鼠急性肝损伤模型，观察了给药后小鼠血清ALT、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧物酶（GSH-Px）的变化及肝组织细胞超微结构的变化。
1 材料与方法
1.1 实验动物
昆明种小鼠，普通级，体重18 ~ 22 g，雌雄各半，购自河南省实验动物中心（合格证号：410115）。以普通饲料喂养于河南中医学院动物实验中心。饲料购自河南省实验动物中心（许可证号：4104041）。
1.2 药物与试剂
异烟肼片，广东南国药业有限公司生产，批号040701；甘利欣胶囊，江苏正大天晴药业股份有限
基金项目：河南省科技攻关项目（0324410026）；河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目（豫教高[2007]335号）；河南中医学院博士科研基金项目
作者单位：450008 郑州，河南中医学院肝病研究所
通讯作者：禄保平，Email：Lbp1921@https://www.wendangku.net/doc/5a15239995.html,
收稿日期：2007-06-08
公司生产，批号 040801；甲醛溶液，分析醇，郑州化学试剂三厂生产，批号 040618；2.5% 戊二醛溶液，国药集团化学试剂有限公司生产，批号 20040420；冰乙酸，分析醇，开封化学试剂总厂生产，批号 041001；ALT 试剂盒（批号 040707）、AST 试剂盒（批号 040707）、SOD 试剂盒（批号20040114）、MDA 试剂盒（批号 20050106）、GSH-Px 试剂盒（批号 20050120）均由南京建成生物工程研究所提供。 1.3 主要仪器
JY601 电子天平，上海民桥精密科学仪器有限公司生产；LD4-2 型离心机，北京医用离心机厂生产；DZKW 型电子恒温水浴锅，北京市永光明医疗仪器厂生产；WKY 型微量可调移液器，上海求精生化试剂仪器有限公司生产；SABA PM4000 全自动生化分析仪，北京贝斯特公司生产；BX41-32H02 显微镜，日本 OLYMPUS 株式会社生产；H-7500 透射电镜，日本日立公司生产。 1.4 分组与给药方法
先取 50 只小鼠，应用随机数字表分为异烟肼正常剂量（按成人正常用量换算，为 90 mg/kg ） 造模组（常量组）、2 倍剂量造模组（2 倍量组， 180 mg/kg ）、5 倍剂量造模组（5 倍量组， 450 mg/kg ）、8 倍剂量造模组（8 倍量组， 720 mg/kg ）和空白对照组，每组各 10 只。异烟肼按每 10 g 体重给药剂量溶于 0.2 ml 液体的浓度分别配制成混悬液，给小鼠灌胃 1 次；空白对照组以等体积的生理盐水灌胃。用药后 18 h 脱臼处死各组小鼠，进行相关指标检测，以探索导致明显急性肝损伤的相对合适剂量。
另取 90 只小鼠，应用随机数字表分为 3 组：①单纯异烟肼造模组（单纯造模组），40 只；②甘利欣干预造模组（干预造模组）40 只；③空白对
照组，10 只。干预造模组造模前连续 5 d 分别以甘利欣胶囊每日 75 mg/kg 体重灌胃，单纯造模组及空白对照组分别给以等体积生理盐水灌胃。第 5 次灌胃后禁食 12 h ，然后将探索出的相对合适剂量的异烟肼配制成混悬液（每 10 g 体重给药剂量溶于 0.2 ml 液体）灌胃 1 次，空白对照组灌胃等体积的生理盐水。造模组分别于造模后 18、36、54、72 h 各脱臼处死 10 只小鼠（空白对照组于18 h 处死），进行相关指标检测，以探讨导致明显急性肝损伤的相对合适时间及可能的机制。 1.5 标本制备与检测
各组小鼠于处死前摘眼球取血，离心半径 10 cm 、3000 r/min 离心 10 min ，制备血清。采用全自动生化分析仪检测 ALT 和 AST 含量；采用黄嘌呤氧化酶法测定 SOD 含量；采用硫代巴比妥酸法测定 MDA 含量，结果以吸光度（A ）值表示；采用化学比色法测定 GSH-Px 活性。以上均按试剂盒说明书操作步骤进行。
小鼠脱臼处死后，取同一部位肝右叶组织 1 块，放入 4% 甲醛溶液中固定，制备切片，光镜观察；另取 1 块放入 2.5% 戊二醛溶液中固定，制备切片，电镜观察（河北医科大学电镜中心协助）。 1.6 统计学处理
应用 SPSS11.5 统计软件对实验资料进行统计分析，数据以 s x ± 表示，组间差异的比较采用单因素方差分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同剂量异烟肼灌胃对小鼠肝脏功能的影响
不同剂量异烟肼一次性灌胃后各组小鼠血清ALT 和 AST 含量检测结果见表 1。常量组小鼠血清 ALT 和 AST 含量均明显高于空白对照组（P < 0.05）；肝脏组织病理学检查可见明显的肝细
表1 不同剂量异烟肼灌胃后 18 h 各组小鼠血清 ALT 、AST 检测结果（s x ±）
Table 1 Levels of ALT and AST in the mice of each group 18 hours after isoniazid perfusion into the stomach (s x ±)
组别 Groups
鼠数 Mice number
异烟肼剂量（mg/kg ） Dosage of isoniazid (mg/kg)
ALT （U/L ） AST （U/L ） 空白对照组 Control group 10 0 30.1 ± 3.6
35.3 ± 6.5 常量组 Normal dosage group 10 90 52.8 ± 5.3*
53.9 ± 8.9* 2倍量组 2-fold dosage group 8 180 101.6 ± 6.3△
*
108.1 ± 14.9△
*
5倍量组 5-fold dosage group 3 450 — — 8倍量组 8-fold dosage group
720
—
—
注：2 倍量组小鼠死亡 2 只，5 倍量组小鼠死亡 7 只，8 倍量组小鼠全部死亡；*与空白对照组比较，P < 0.05；△
与常量组比较，P < 0.05 Notes: Two mice died in the 2-fold dosage group, seven in the 5-fold dosage group, and all in the 8-fold group; *Compared with the control group, P < 0.05;
Compared with the normal dosage group, P < 0.05.
胞脂肪变性和水肿。2 倍量组小鼠 10 只中死亡 2 只，8 只存活小鼠血清 ALT 、AST 含量升高更为明显（约为空白对照组的3倍），与常量组比较差异也有统计学意义（P < 0.05）；光镜观察显示肝细胞出现广泛的脂肪变性和水肿，肝窦几乎消失。5 倍量组小鼠 10 只中死亡 7 只，而 8 倍量组 10 只小鼠则全部死亡。经综合分析，确定将 2 倍剂量（180 mg/kg ）异烟肼灌胃作为造成小鼠急性肝损伤的相对适合剂量。
2.2 相对合适剂量异烟肼灌胃后不同时间小鼠肝脏功能的观察
于180 mg/kg 异烟肼灌胃后不同时间检测各组小鼠血清 ALT 含量，结果见表 2。灌胃后 18 h ，
表2 180 mg/kg 异烟肼灌胃后各组小鼠 ALT 检测结果 Table 2 Level of ALT in the mice of each group after
isoniazid 180 mg/kg perfusion into the stomach
组 别 Groups 鼠数 Mice number ALT
（s x ±，U/L ）
空白对照组 Control group 10 29.6 ± 5.6 灌胃后18 h 18 h after intragastric administration
A 8 99.8 ± 14.2*
B 9 51.9 ± 9.8*△
灌胃后36 h 36 h after intragastric administration
A 8 140.4 ± 15.2*▼
B 8 72.9 ± 11.9*△
灌胃后54 h 54 h after intragastric administration
A 6 184.2 ± 24.2*▼▲
B 7 93.9 ± 12.1*△
灌胃后72 h 72 h after intragastric administration
A 2 —
B 3 —
注：A ：单纯造模组；B ：干预造模组；*
与空白对照组比较，P < 0.05；
△
与灌胃后相同时点单纯造模组比较，P < 0.05；▼
与灌胃后 18 h 单纯造模组比较，P < 0.05；▲与灌胃后 36 h 单纯造模组比较，P < 0.05
Notes: A: Simple model group; B: Intervention model group;
*Compared with the control group, P < 0.05; Compared with the simple model group of a same time point, P < 0.05; ▼Compared with the simple model group at 18 h, P < 0.05; ▲Compared with the simple model group at 36 h, P < 0.05.
单纯造模组和干预造模组小鼠血清ALT 含量均明显高于空白对照组（P < 0.05），其中单纯造模组 ALT 含量明显高于干预造模组（P < 0.05）；光镜观察显示单纯造模组小鼠肝细胞出现广泛的脂肪变性和水肿，肝窦变窄或消失。灌胃后 36 h ，小鼠血清 ALT 含量均继续升高，单纯造模组与灌胃后 18 h 比较差异有统计学意义（P < 0.05），且明显高于干预造模组（P < 0.05）；光镜观察显示单纯造模组小鼠肝细胞出现严重的脂肪变性和水肿，肝窦消失。灌胃后 54 h ，小鼠肝功能损伤进一步加重，单纯造模组小鼠死亡4只，干预造模组小鼠死亡 3 只，单纯造模组小鼠血清 ALT 含量与灌胃后 18 h 和 36 h 比较差异均有统计学意义（P < 0.05），也远远高于干预造模组（P < 0.05）。灌胃后 72 h ，
单纯造模组和干预造模组小鼠病死率则分别达 8/10 和 7/10。
2.3 相对合适剂量异烟肼灌胃后 18 h 小鼠血清
SOD、MDA、GSH-Px 的变化 180 mg/kg 异烟肼灌胃后 18 h ，单纯造模组小鼠血清 SOD 含量和 GSH-Px 活性明显低于空白
对照组，而 MDA 水平明显高于空白对照组，差异均有统计学意义（表3）。 2.4 相对合适剂量异烟肼灌胃后 18 h 小鼠肝细胞超微结构的变化
180 mg/kg 异烟肼灌胃后 18 h 各组小鼠肝组织电镜观察显示，空白对照组小鼠肝细胞内线粒体丰富，大部分线粒体嵴排列密集，嵴间腔均等，内
质网丰富，高尔基体排列多层，细胞核常染色质居多，异染色质居少，胞质内未出现异常的物质结构；而单纯造模组小鼠肝细胞内含有大量的脂滴，线粒体相对减少，线粒体嵴部分变短或消失，嵴间腔部分扩大，内质网大部分处于水肿状态或囊泡状，细胞核处于水肿状态（图 1）。
表3 180 mg/kg 异烟肼灌胃后 18 h 小鼠血清 SOD 、MDA 、GSH-Px 的检测结果（s x ±）
Table 3 Levels of SOD, MDA, and GSH-Px in the mice 18 hours after isoniazid (180 mg/kg) perfusion into the stomach (s x ±)
组 别 Groups
鼠 数 Mice number
SOD （U/ml ） MDA （A 值 A value ） GSH-Px （nmol/ml ） 空白对照组 Control group 10 115 ± 13 0.152 ± 0.029 1080 ± 115 单纯造模组 Simple model group
8
37 ± 12 0.211 ± 0.027 844 ± 99 F 值 F value
199.73 22.21 24.11
P 值 P value
< 0.05
< 0.05
< 0.05
图1 180 mg/kg 异烟肼灌胃后 18 h 小鼠肝细胞超微结构的透射电镜观察, 细胞内可见大量脂滴（A，× 3000），线粒体嵴部分变短或消失，嵴间腔部分扩大（B，× 20 000），内质网肿胀或呈囊泡状（C，× 30 000），细胞核水肿（D，× 7000）Figure 1 Transmission electron microscopy showing the changes of liver cell ultrastructure 18 h after isoniazid (180 mg/kg) perfusion into the stomach of the mice. A: A large amount of lipid droplets can be observed in the liver cells (original magnification × 3000); B: The mitochondria cristae became short or vanished, and the cavity between the cristae became wide (original magnification × 20 000); C: The endoplasmic reticulum were swelled or appeared vesicle-like (original magnification × 30 000); D: Nuclear edema (original magnification × 7000)
3 讨论
近年来，关于药物性肝损伤的研究日趋深入。肝损伤研究常用的动物模型大致可以分为 3 类，即化学性肝损伤模型（四氯化碳性肝损伤、Ｄ-氨基半乳糖性肝损伤和醋氨酚性肝损伤）、免疫性肝损伤模型（卡介菌加脂多糖诱导法、丙酸杆菌或痤疮丙酸杆菌加脂多糖诱导法、刀豆蛋白Ａ诱导法）和酒精性肝损伤模型（白酒或乙醇灌胃法）[4]。目前已有的关于药物性肝损伤的基础研究多采用四氯化碳等造模，用临床导致肝损伤的常见药物制备肝损伤动物模型的研究几乎没有。化学性肝损伤模型与临床实际是否相吻合，值得深入探讨。如何使药物性肝损伤的基础研究更贴近临床、更好地为临床服务，需要进一步予以关注和加强。基于此，有必要探讨以临床常用肝毒性药物建立肝损伤动物模型。
本研究应用一线抗结核药物异烟肼，模拟临床给药途径，采用灌胃的方法，探索建立新的小鼠急性肝损伤模型。在应用不同剂量异烟肼反复实验的基础上，又对用药后不同时段小鼠分别进行了观察，结果发现，应用 2 倍剂量（180 mg/kg）异烟肼灌胃后 18 h，小鼠 ALT 和 AST 即明显升高（约为空白对照组的 3 倍左右）；肝细胞出现广泛的脂肪变性和水肿，肝窦变窄或消失；肝组织细胞超微结构显著变化。而 2 倍以上各剂量及 18 h 以上各时段小鼠病死率较高，肝功能及肝组织细胞损伤严重。因此，综合分析后，确定将 2 倍剂量灌胃 18 h 作为造模的相对合适剂量与相对合适时间。肝功能检测及光镜、电镜观察结果证实，应用异烟肼灌胃建立小鼠急性肝损伤模型是成功的。
在关于细胞损伤发生机制的研究中，自由基脂质过氧化反应的理论得到普遍重视。由于机体受到有害物质的损伤，导致自由基大量产生和抗氧化物量显著减少，引起组织细胞的脂质发生过氧化连锁反应，从而破坏组织细胞的正常结构，影响其正常的代谢功能，出现组织细胞损伤性变化[5]。研究表明，GSH-Px 含量下降所致严重细胞损害与脂质过氧化反应有关[6]，脂质过氧化损伤的主要降解产物MDA 可严重损伤肝细胞膜结构，导致肝细胞肿胀、坏死。肝损伤程度越重，血清中的 MDA 含量越高。因此，通常将 MDA 含量作为反映脂质过氧化反应的指标[7]。SOD 则对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，机体形成的超氧阴离子首先由其作用形成过氧化氢，后者再经其他抗氧化酶作用最终形成水[8]。本研究发现，异烟肼灌胃后小鼠血清SOD 和 GSH-Px 水平明显降低，MDA 水平明显升高，提示异烟肼所致急性肝损伤与自由基脂质过氧化反应有密切关系。
本研究中还设立了甘利欣干预造模组，结果显示，180 mg/kg 异烟肼灌胃后 18、36、54 h，干预造模组 ALT 含量均明显低于单纯造模组（P < 0.05），但小鼠死亡数没有明显减少；而随着灌胃时间的延长，干预造模组小鼠 ALT 水平也持续升高，死亡数明显增加。这表明异烟肼引起的肝损害是可以预防的，保肝药物可有效减低损肝药物的肝毒性；但保肝药物宜早期介入，否则，损肝药物应用时间越长，肝损伤程度越重，则保肝药物的干预效果越差。
参考文献
[1]Liao Y, Peng SQ, Yan XZ, et al. Metabonomics of isoniazid in rats’
liver tissues. Chin J New Drugs, 2007, 16(4):288-292. (in Chinese)
廖艳, 彭双清, 颜贤忠, 等. 异烟肼肝毒性的代谢组学特征研究.
中国新药杂志, 2007, 16(4):288-292.
[2]Liu KX. Basic and its animal models of liver disease:tool for opening
up anti-liver disease drugs. Beijing:China Med Technol Press, 2003:72.
(in Chinese)
刘克辛. 肝疾患基础及其实验动物模型—抗肝疾患药物开发的工具. 北京: 中国医药科技出版社, 2003:72.
[3]Chen CW. Drug-induced and toxic liver disease. Shanghai: Shanghai
Science and Technology Press, 2002:456. (in Chinese)
陈成伟. 药物与中毒性肝病. 上海: 上海科学技术出版社, 2002:456.
[4]Tang YA, Liu YQ, Wang GQ. Advances in animal model research of
liver injury. J Health Toxicol, 2002, 16(4):236-238. (in Chinese)
唐云安, 刘玉清, 王国钦. 肝损伤动物模型研究进展. 卫生毒理学
杂志, 2002, 16(4):236-238.
[5]Di Y, Su LW. Advances in prevention and treatment research of liver
injury by TCM. Hebei J TCM, 2000, 22(1):75-76. (in Chinese)
狄岩, 苏立稳. 中医药防治肝损伤研究进展. 河北中医, 2000, 22(1):75-76.
[6]Peng HG, Dai CL, Wei P, et al. Experimental study on protecting of
liver injury by using Added-Sini powder. Chin J Info TCM, 2000, 7(11):25-26. (in Chinese)
彭汉光, 戴春林, 魏屏, 等. 加味四逆散保护肝损伤的实验研究.
中国中医药信息杂志, 2000, 7(11):25-26.
[7]Bi S, Gao JY. Inflammation and anti-inflammatory drugs. Beijing:
People’s Medical Publishing House, 1993:182. (in Chinese)
毕涉, 高骥援. 炎症与抗炎药. 北京: 人民卫生出版社, 1993:182. [8]Wheeler MD, Nakagami M, Bradford BU, et al. Overexpression of
manganese superoxide dismutase prevents alcohol-induced liver injury in the rat. J Biol Chem, 2001, 276(39):36664-36672.
Establishment of mouse model of acute liver injury by perfusing stomach with isoniazid
LU Bao-ping, YANG Xiao-na, XU Jia-yan
【Abstract】
Objective To establish a mouse model of acute liver injury by perfusing stomach with isoniazid, and to explore its mechanism. Methods Fifty mice of Kunming-strain were randomly divided into normal, 2-fold, 5-fold, and 8-fold dosage model groups and control group with 10 mice in each. The mice in the model groups were perfused with 90, 180, 450, and 720 mg/kg isoniazid respectively into the stomach. Eighteen hours after the perfusion, the serum levels of ALT and AST were measured, and the liver tissues were obtained from the mice and observed under a light microscope to find a relatively suitable dosage that can induce a significant acute liver injury. Then, 90 mice of Kunming-strain were randomly divided into simple model (40 mice), intervention model (40 mice), and control groups (10 mice). The mice in the simple model group were perfused with the suitable dosage of isoniazid into the stomach, while the mice in the intervention model group were treated with Ganlixin (diammonium glycyrrhizinate) at a dosage of 75 mg/kg for 5 days successively before establishing the model. Afterwards, the serum levels of ALT, SOD, MDA, and GSH-Px were measured at 18, 36, 54, and 72 hours, and the liver tissues were obtained from the mice and observed under light and electron microscopes respectively to find a relatively suitable time for establishing a model of acute liver injury, and to explore its underlying mechanism.
Results In the first experiment, the mean serum levels of ALT and AST in the 2-fold dosage group were 101.6 U/L ± 6.3 U/L and 108.1 U/L ± 14.9 U/L respectively, which were statistically significantly higher than those in the control (30.1 U/L ± 3.6 U/L and 35.3 U/L ± 6.5 U/L) and the normal dosage group (52.8 U/L ± 5.3 U/L and 53.9 U/L ± 8.9 U/L, P < 0.05). Light microscopy showed fatty degeneration and edema of the liver cells, and the hepatic sinus could be hardly detected. In the 5-fold dosage model group, 7 mice died; while in the 8-fold group, all the mice. In the second experiment, 18 hours after the perfusion with 2-fold dosage (180 mg/kg) of isoniazid into the stomach, the serum levels of ALT and MDA in the simple model group were significantly higher than those in the control, while the levels of SOD and GSH-Px were significantly lower. Histological examination showed a large amount of injured liver cells with significantly changed ultrastructure.
Conclusions Mouse model of acute liver injury can be successively established by perfusing stomach with isoniazid of 2-fold dosage (180 mg/kg). Its mechanism may be closely related to lipid peroxidation of free radical.
【Keywords】Liver diseases; Model, animal; Isoniazid; Lipid peroxidation
Author Affiliation: Institute of Liver Diseases, Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008, China Corresponding Author: LU Bao-ping, Email: Lbp1921@https://www.wendangku.net/doc/5a15239995.html,
https://www.wendangku.net/doc/5a15239995.html, Chin Med Biotechnol, 2007, 2(4):286-290
急性肝损伤模型的研究进展
急性肝损伤模型的研究进展 作者：刘彦双朱淑霞王永利作者单位：050200 河北省石家庄市卫生学校（刘彦双）;河北武警总队医院（朱淑霞）;河北医科大学药理教研室（王永利） 【关键词】急性肝损伤 肝损伤实验动物模型的复制是进行防治肝损伤药物研究的前提。目前，肝损伤动物模型的复制主要有生物性、免疫性、化学性等方法，生物学方法要求实验条件高且费用昂贵，限制了应用。免疫方法是造成免疫肝损伤，主要用于通过免疫机制而抗肝损伤的药物研究。化学方法则是通过化学性肝毒物质，如四氯化碳、氨基半乳糖、硫代乙酰胺、黄曲霉素等致肝损伤。在我国卫生部颁布的《中药药理实验指导原则》中明确指定应用四氯化碳和氨基半乳糖肝损伤动物模型进行保肝降酶新药的药理实验，应用四氯化碳和氨基半乳糖复制肝损伤动物模型，条件要求低，技术易于掌握，可靠性强，重复性好，是其他任何肝损伤模型无法比拟的，故目前研究抗肝损伤新药常采用四氯化碳和氨基半乳糖复制动物模型。 1 化学性肝损伤动物模型 1.1 四氯化碳性肝损伤四氯化碳（CCl4 ）溶于精致植物油，配制0.1%浓度，按10ml.kg小鼠腹腔注射，12～24h后处死动物。测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、总胆红质（TB）、总蛋白（TP）、白蛋白（A）、，肝匀浆脂质过氧化物（LPD）或丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）或还原性谷胱甘肽（GSH）等反映肝功能及脂质过氧化的指标，并进行组织病理学检查。 关于CCl 4 肝毒的作用机制，存在多种假设，但都一致公认，自由基的形成及引发的链式过氧化反应是其主要机制。CCl 4在体内可经肝微粒体细胞色素P450 代谢激活，生成两个活性自由基（CCl 3 O 2 和Cl）及一系列氧活性物，可与肝细胞质膜或亚细胞结构的膜脂质发生过氧化反应，膜磷脂大量降解，从而破坏细胞膜结构完整性，引起膜通透性增加，最终导致肝细胞死亡［1］。另外，CCl 4 的代谢产物能迅速与细胞成分如胞内脂质、蛋白、核脂质、核蛋白和DNA等多种大分子发生不可逆的共价结合而导致细胞死亡，特别是当自由基作用于DNA时，损伤核糖和碱基，使核酸直接破坏引起DNA链的断裂或DNA 链与蛋白间交联，影响其信息传递功能以及转录和复制特性。在CCl 4 代谢产物引起的脂质过氧化物和共价结合的双重作用下，导致膜脂质流动性降低、钙泵抑制、谷胱甘肽活性抑制、肝微粒和线粒体功能丧失、肝细胞内钙稳态失调及代谢紊乱，引起肝细胞损伤加剧［2］。 1.2 D-氨基半乳糖性肝损伤用生理盐水配制成100g.L的D-氨基半乳糖 （D-galactosanine，D-GalN）溶液，大鼠或小鼠腹腔注射600～900mg.kg，造成急性肝损伤模型，染毒24-48h后处死动物，检查肝功能、病理及脂质过氧化指标［3，4］。Keppler 首先于1968年应用D-GaLN制备大鼠肝损伤模型。D-GaLN在肝细胞内代谢，首先与尿苷酸（UDP）结合成尿苷二磷酸半乳糖（LIDP-GalN），并在肝细胞内聚集，由于这种结合的速度大大超过尿苷酸的生物合成速度，致使尿苷酸耗竭，进而导致依赖其进行生物合成的核酸、糖蛋白和糖脂等物质减少，限制了细胞器的再生及酶的生成和补充，使细胞器受损，肝细胞的结构和功能均出现异常，甚至死亡。另外D-GaLN还可以引起肝细胞内Ca 2+ 增多，
暴露式与非暴露式气管滴注方法建立小鼠急性肺损伤模型及其效果比较
［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０４１４－ ０５［收稿日期］ ２０１２－０１－ ０４［基金项目］ 国家自然科学基金资助课题（８１１０００３０ ）［作者简介］ 苗雨丹（１９７７－） ，女，吉林省白城市人，讲师，医学硕士，主要从事临床解剖学方面的研究。［通信作者］ 李 波（Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９４６６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｂｏ＠ｊ ｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）；董春玲（Ｔｅｌ：０４３１－８８７９６８２０，Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｏｎｇｃｈｕｎｌｉｎｇ ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ）网络出版时间： ２０１２－０４－１７ ０９：１３网络出版地址： ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／２２．１３４２．ｒ．２０１１１１０１．０９１１．００４．ｈｔｍｌ暴露式与非暴露式气管滴注方法建立小鼠急性 肺损伤模型及其效果比较 苗雨丹１，董春玲２，刘 玲１，夏长丽１，苏 略１，李 波１ （１．吉林大学白求恩医学院人体解剖学系，吉林长春１３００２１； ２．吉林大学第二医院呼吸内科，吉林长春１３００４１ ）［摘 要］ 目的：比较暴露式与非暴露式气管滴注方法建立的小鼠急性肺损伤（ ＡＬＩ）模型的各种指标，确立更有效的气管滴注方法。方法：４５只健康雄性Ｃ５７／ＢＬ６小鼠随机分为对照组、非暴露组和暴露组，每组１５只。以 脂多糖（ＬＰＳ）作为刺激物，非暴露组和暴露组小鼠分别采用非暴露式和暴露式气管滴注方法建立ＡＬＩ模型，造 模后２４ｈ进行支气管肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）生化指标检测、ＢＡＬＦ细胞分类计数、肺湿／干重（Ｗ／Ｄ） 比值测定以及肺组织病理形态学观察。结果：暴露组小鼠造模的成功率（１００％）高于非暴露组（８６．７％） 。与对照组比较，非暴露组和暴露组小鼠ＢＡＬＦ中总蛋白浓度、碱性磷酸酶（ＡＬＰ）和乳酸脱氢酶（ＬＤＨ） 活性、中性粒细胞数量以及肺Ｗ／Ｄ比值显著升高（Ｐ＜０．０５）；暴露组小鼠ＢＡＬＦ总蛋白浓度、ＡＬＰ和ＬＤＨ活性、中性粒细胞数量以及肺Ｗ／Ｄ比值明显高于非暴露组（Ｐ＜０．０５ ）。非暴露组小鼠主要表现为肺间质水肿；暴露组小鼠主要表现为渗出性肺水肿。结论：暴露式气管滴注方法对于建立小鼠ＡＬＩ模型更有效。 ［关键词］ 气管滴注；急性肺损伤；脂多糖；小鼠 ［中图分类号］ Ｒ５６３ ［文献标志码］ Ａ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｗｉｔｈｅｘｐｏｓｅｄ ａｎｄ ｎｏｎ－ｅｘｐ ｏｓｅｄ ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｓａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｃｏｍｐ ａｒｉｓｏｎＭＩＡＯ Ｙｕ－ｄａｎ１，ＤＯＮＧ Ｃｈｕｎ－ｌｉｎｇ２，ＬＩＵ ｌｉｎｇ１，ＸＩＡ Ｃｈａｎｇ －ｌｉ １，ＳＵ Ｌｕｅ１，ＬＩ Ｂｏ１（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｎａｔｏｍｙ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇ ｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇ ｃｈｕｎ １３００４１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅ ｖａｒｉｏｕｓ ｉｎｄｅｘｅｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ（ＡＬＩ）ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙｅｘｐ ｏｓｅｄ ａｎｄ ｎｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｏｎｆｉｒｍ ｗｈｉｃｈ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｍｏｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｆｏｒｔｙ－ｆｉｖｅ ｍａｌｅ ｍｉｃｅ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ，ｎｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｅｘｐｏｓｅｄ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｆｉｆｔｅｅｎ ｍｉｃｅ ｉｎ ｅａｃｈ ｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅ ｍｉｃｅ ｉｎ ｂｏｔｈ ｎｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ ａｎｄ ｅｘｐ ｏｓｅｄ ｇｒｏｕｐｓ ｗｅｒｅ ｉｎｓｔｉｌｌｅｄ ｗｉｔｈｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃａｒｉｄｅ（ＬＰＳ）ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ＡＬＩ ｍｏｄｅｌｓ ｂｙ ｎ ｏｎ－ｅｘｐｏｓｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｏｓｅｄ ｉｎｔｒａｔｒａｃｈｅａｌ ｉｎｓｔｉｌｌａｔｉｏｎｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｅｘｅｓ ｉｎ ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ ｌａｖａｇｅ ｆｌｕｉｄ（ＢＡＬＦ），ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ４１４第３８卷 第３期２０１２年５月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２０１２
肝损伤动物模型的建立和应用
万方数据
万方数据
肝损伤动物模型的建立和应用 作者：王福根， 孙静霞 作者单位：浙江杭州市第六人民医院,杭州市,310014 刊名： 中国药房 英文刊名：CHINA PHARMACY 年，卷(期)：2006,17(9) 被引用次数：12次 参考文献(10条) 1.Xu JQ;Lee G;Wang HM Limited role for CXC chemokines in the pathogenesis of a-naphthylisothiocyanate-induced liver injury[外文期刊] 2004(03) 2.黄正明;杨新波;曹文斌化学性及免疫性肝损伤模型的方法学研究[期刊论文]-解放军药学学报 2005(01) 3.Ayoub SS;Botting RM;Goorha S Acetaminophen-induced hypothermia in mice is mediated by a prostaglandin endoperoxide synthase 1 gene-derived protein[外文期刊] 2004(30) 4.Yasuda M;Okabe T;Itoh J Differentiation of necrotic cell death with or without lysosomal activation:application of acute liver injury models induced by carbon tetrachloride(CCl4) and dimethylnitrosamine(DMN)[外文期刊] 2000(10) 5.Horn TL;Bhattacharjee A;Schook LB Altered hepatis mrna expression of apoptotic genes during dimethylnitrosamine exposure[外文期刊] 2000(02) 6.Wang T;Shankar K;Ronis M Potentiation of thioacetamide liver injury in diabetic rat is due to induced CYP2E1[外文期刊] 2000(02) 7.Kin WH;Hong F;Radaeva S Statl plays an essential role in LPS/ D-galactosanine-induced liver apoptosis and injury 2003(06) 8.Kaneko Y;Harada M;Kawano T Angmentation of Va14NKT cell-mediated cytotexicity by interleukin4 in an autocrine mechanism resulting in the development of concanavalina-indued hepatitis[外文期刊] 2000(01) 9.赵冬梅;刘耕陶双环醇对刀豆蛋白A所致小鼠肝细胞核DNA损伤保护作用[期刊论文]-中华医学杂志 2001(14) 10.邱英锋;缪晓辉;蔡雄卡介苗加脂多糖建立的大鼠急性免疫性肝损伤模型的研究[期刊论文]-西北国防医学杂志2004(05) 本文读者也读过(4条) 1.王志彬药物性肝损害的特点分析-附70例报告[期刊论文]-医学信息（下旬刊）2010,23(9) 2.吴玉强.邓家刚.钟正贤.杨兴.WU Yu-qiang.DENG Jia-gang.ZHONG Zheng-xian.YANG Xing铁包金提取物抗肝损伤作用的研究[期刊论文]-时珍国医国药2009,20(4) 3.禄保平.白娟.江若霞.Lu Baoping.Bai Juan.Jiang Ruoxia以常用中西药物建立药物性肝损伤动物模型的分析与探讨[期刊论文]-河南中医学院学报2008,23(4) 4.马丽娜.华碧春药物性肝损伤动物模型研究进展[期刊论文]-亚太传统医药2011,07(2) 引证文献(12条) 1.徐伟.宋倩倩.苗双.刘宁宁.马健.王振勇青蒿素对CCl4致犬急性肝损伤模型抗氧化指标的时效影响[期刊论文]-兽药与饲料添加剂 2009(4)
大鼠肝纤维化模型的制备
中文摘要 目的本文通过对SD大鼠腹腔注射四氯化碳以诱导大鼠肝纤维化动物模型。 方法取15只SD大鼠，180—220g，分为A组10只，B组5只，A组为模型组：40%CCL4橄榄油混合液按0.12ml/100g腹腔注射，一周两次，共八周。B组为对照组：纯橄榄油按0.12ml/100g腹腔注射，一周两次，共八周，八周后，禁食12小时处死全部大鼠，解剖取肝组织。病理学检测：HE染色，MASSON染色,PAS染色。基因学检测：1.3.4型胶原蛋白 结果八周试验期间B组大鼠全部存活，肝组织标本结构清晰，无异常情况；A组大鼠出现明显的病态，肝组织标本均已达到肝纤维化S3以上，多数标本可见小叶被纤维结构分割包围，假小叶形成，干细胞可见脂肪变性； 结论该方法肝损伤明显，死亡率低，周期短，能够成功作为慢性肝损伤，肝纤维化的模型。 关键词肝纤维化，四氯化碳，动物模型 Abstract Objective: Established animal model of hepatic fibrosis in rats induced by carbon tetrachloride. Methods: Take 15 SD rats,180-220g, divided into 10 group A, group B 5 只, A group of model group: 40% CCL4 0.12ml/100g by abdominal injection of a mixture of olive oil, twice a week, a total of eight weeks. Group B was the control group: pure olive oil press 0.12ml/100g abdominal injection twice a week, a total of eight weeks, eight weeks later, all rats were fasted for 12 hours were sacrificed, dissected liver tissue. Pathology: HE staining, MASSON staining, PAS staining. Genetics testing: 1.3.4 collagen Results: During the eight-week test group B rats survived, liver tissue specimens clear structure, no exceptions; significant morbidity A rat liver tissue fibrosis S3 have reached above, the majority of samples are split fiber structure visible lobular surrounded pseudo lobule formation, stem cell degeneration visible fat. Conclusion: This method obviously liver injury mortality, the period is short, to be successful as chronic liver damage, liver fibrosis model. Key words: Fibrosis, carbon tetrachloride, animal model 前言
小鼠急性酒精性肝损伤动物模型造模方法优化
小鼠急性酒精性肝损伤动物模型造模方法优化 【摘要】目的：探索急性酒精性肝损伤小鼠动物模型的造模方法。方法：通过三个实验比较不同剂量、不同灌酒方法、不同灌酒时间动物醉酒率、死亡率和血清转氨酶的不同情况。结果：一次灌酒0.28ml/10g体重小鼠可达中度醉酒，醉酒率70%，死亡率40%；采用小间隔分次灌服法后小鼠醉酒率60%，死亡率降为20%；连续灌酒时，较高剂量组第三天开始出现死亡现象并逐渐加重；血清转氨酶上升的高峰在第5天，此后逐渐下降。结论：白酒灌胃法造急性酒精性肝损伤模型时，采用中等剂量、分次灌胃法可降低死亡率，实验时间以5~7天比较适宜。 【关键词】急性酒精性肝损伤；小鼠；动物模型 随着人们对酒精性肝脏损害重视的提高以及相应实验研究的广泛开展，相关动物模型尤其是急性酒精性肝损伤动物模型在实际实验应用中的问题日益突出。我们在参考文献介绍的方法[1]制造急性酒精性肝损伤动物模型的实验中，对造模实际操作时的一些具体问题和检测指标的时间选择等有所比较和认识，现报告如下，以供同仁参考，在造模上少走弯路，节省经费。 1 实验材料 1.1 实验动物昆明种小鼠84只，体重24g~27g，合格证号分别为豫医动字第410115号，均由河南省实验动物中心提供。 1.2 实验试剂ALT试剂盒，迈克公司生产，批号100122；AST试剂盒，迈克公司生产，批号100103。 1.3 实验仪器雷勃微量移液器，芬兰雷勃集团中国区总部；DZKW型电子恒温水浴锅，余姚市亚星仪器仪表有限公司；752 N型分光光度计，上海第三分析仪器厂。 2实验方法 2.1 实验1普通级昆明种小鼠50只，21g~24g，雌雄各半。将50只小鼠按随机排列表分为5组，每组10只，雌雄各半。其中4组分四个剂量级 3.2灌酒时间与醉酒率、死亡率 实验1中，随着灌酒天数的增加，各组动物醉酒率变化不很大，但M3、M4两组的死亡情况日益严重，尤其是M4组，动物死亡数目过多。 3.3 灌酒方式与醉酒率、死亡率 实验2采用分次灌服的方式，仍观察醉酒情况，计算醉酒率和死亡率。结果
LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF―α表达
LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF―α表 达 【摘要】目的：研究脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤机制。方法：实验分为正常对照组、模型组及抗体组；正常对照组小鼠腹腔腔内注射等量0.9%NaCl。模型组腹腔内注射LPS（4 mg/kg）。抗体组在造模前8～10 h，应用小鼠Toll样受体4/髓样分化蛋白2（TLR4/MD2）复合物抗体腹腔内注射50 μg。各组均在造模5 h后留取血和肺组织，采用细菌内毒动态浊度法检测血浆LPS的含量，HE染色判定小鼠肺组织病理变化，RT-PCR测定小鼠肺组织TLR4基因表达，Western-blot测定TLR4蛋白表达；ELISA检测小鼠血清中TNF-α的水平。结果：和正常对照组比较，模型组及抗体组小鼠血浆内毒素含量显著升高（P<0.05），模型组小鼠肺组织HE染色呈ALI表现；和模型组比较，抗体组TLR4 mRNA、蛋白及TNF-α的表达明显下调（P<0.05）。结论：急性肺损伤机制可能与LPS和TLR4受体结合介导TNF-α信号途径相关。 【关键词】脂多糖；急性肺损伤； Toll样受体4；肿瘤坏死因子-α Expression of Toll Like Receptor 4 and TNF-α on Acute Lung Injury Induced by Lipopolysaccharide in
Mice/GU Zhi-long，JIANG Hua-mao，HU Zhan-sheng.//Medical Innovation of China，2015，12（24）：016-019 【Abstract】 Objective：To study mechanism of acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice.Method：The mice were randomly divided into normal control group， model group and antibody group.Control group was given 0.9%NaCl. Model group of acute lung injury was induced by LPS at a dose of 4 mg/kg. Aitibody group mice were given anti-TLR4/MD antibody（50 μg）before 8-10 h of building model group. Blood and lung tissue were taken after modeling in 4 hours. A mount of endotoxin in plasma was measured by kinetic turbidimetric assay.Degree of lung damage was grated by HE staining. Expressions of TLR4 at both mRNA and protein levels were measured by RT-PCR and Western Blot.Content of TNF-α in mice serum was detected by ELISA.Result：Compared with the control group，endotoxin in serum，in model group and ayibody group significantly increased（P<0.05），with obvious ALI lung damages in model https://www.wendangku.net/doc/5a15239995.html,pared with the model group，antibody group presented that expression of TLR4 mRNA
四氯化碳致急性肝损伤的原理
四氯化碳致急性肝损伤的原理及模型建立 一些肝毒索已经成功地应用于肝衰竭的诱导。目前常用的肝毒素主要有 D．Gal、醋氨酚、CCl4等。D．Gal肝损伤模型的病理改变与人类病毒性肝炎的 病理改变较为接近，肝外毒性不明显，剂量范围易控制，但有潜在的不可逆 性，同时因为D．Gal价格昂贵，大型动物猪或犬建立模型时所用剂量较大，重 复率并不十分理想，也无临床相关的药物中毒，所以限制了它在大型动物造模 方面的应用。CCl4是一种对肝细胞有严重毒性作用的化学物质。目前认为其导致肝损伤 的主要机制与四氯化碳自身和其自由基代谢产物有关，、CCl4在肝内经细胞色素 P450 2El代谢产生毒性代谢产物。CCl4自身的溶酶作用可导致肝细胞损伤， 但这仅限于高浓度的CCl4。CCl4的自由基导致肝损害的过程被认为是主要的机 制。榍文海等报道用杂种犬，将cache与等量花生油混合溶液，以0．9ml／kg一 次腹腔注射建立犬暴发性肝功能衰竭模型。结果，注射CCl4后犬里进行性肝功 能衰竭表现，第72 h血丙氨酸转氨酶、总胆红素、血氨明显升高，凝血酶原时 间延长，血糖降低，(均P<0．01)；脑电图检查出现异常波型。第7d病理检查显 示：肝细胞大片溶解坏死，网状支架大部分存在，肝细胞轻度增生。暴发性肝 功能衰竭形成率为93．0％。动物48～96h死亡率73．O％，14d内肝损害明显恢复。 动物一般表现，实验室及组织学检查表明，整个动物染毒过程，近似于人类的 急性暴发性肝功能衰竭过程。本模型具有以下特点：①动物受损后，经充分的 时间，可以恢复到用药前水平，模型具有可逆性；②受损动物以72h为死亡高 峰，第5d开始恢复，终点十分明确；③实验动物肝功能衰竭时间与死亡时间有 一定间隔，具有适用性和可控制性；④CCl4经济可行，注意保护，对实验人员 毒性不大，较为安全。 亚急性和慢性毒性：动物吸入400ppm，7小时/天，5天/周，173天，部分动物127天后勤部死亡，肝肾肿大，肝脂肪变性，肝硬化，肾小管上皮退行性病变。 Keywords: ?antioxidants; ?caspases; ?carbon tetrachloride; ?liver damage; ?chondroitin-4-sulphate; ?NF-κB; ?oxidative stress; ?free radicals Background and purpose:
肝纤维化动物模型的研究概况
肝纤维化动物模型的研究概况 摘要：建立一个与人类肝纤维化的发生机制相似的肝纤维化的动物模型对于肝病的预防与治疗有十分重要的意义；总结阐述目前常用的肝纤维化模型的造模方法，并比较各种方法的优缺点，以期对实践产生指导意义。 关键词：肝纤维化；动物模型 肝纤维化是细胞外基质在肝内过度沉积的病理改变，也是许多肝病的中间环节。建立一个与人类肝纤维化的发生机制相似的肝纤维化的动物模型一直是科学研究的难点。选择适当的肝纤维化动物模型是深入研究肝纤维化发病机制的重要基础，也是筛选防治肝纤维化药物的有效手段。近年来，肝纤维化动物模型的研究也取得了可喜的进展。现将目前常用的造模方法及其原理、特点综述如下。 1 中毒性肝损伤模型 1.1 四氯化碳法 四氯化碳（carbon tetochloride，CCL4）是最广泛使用的化学肝毒物。CCL4法造模的途径包括口服、腹腔注射和皮下注射，造模时间由途径和剂量决定，一般为8周至4月不等［1］。如，40％CCL4油溶液，按2mL/kg体重的剂量，予Wistar大鼠腹腔注射，每周2次，共8周，可成功复制肝纤维化模型［2］。 CCL4是氯化烷烃类化合物，可选择性损害肝、肾功能。CCL4进入体内后可直接进入肝细胞，溶解肝细胞膜上的脂质成分；也可以通过影响肝细胞细胞色素P450依赖性混合功能氧化酶的代谢，生成活泼的三氯甲基自由基和氯甲基自由基，启动脂质过氧化作用，致肝细胞损伤，变性，坏死，长期反复刺激可诱导肝纤维化形成。 CCL4致肝纤维化动物模型造模途径多样，简便，费用低廉，病理特征稳定可靠，复制时间短。CCL4诱导的肝纤维化动物模型在形态学、病理生理学的某方面与人肝纤维化相似［3］。该模型的原始启动机制显然是毒性化学物质对肝脏的损伤作用，比较适合药物性肝炎方面的研究。但是能否准确反映病原微生物感染人体后导致肝纤维化的机理，尚待进一步探讨。其缺点在于CCL4肝毒性作用剧烈、动物死亡率高，不适合于周期较长的实验研究。 1.2 二甲基亚硝胺法 1％二甲基亚硝胺（DMN）生理盐水稀释液，按10mL/kg体重的剂量腹腔注射，第1周连续3次，第2、3、4周各1次，6、7周各连续2次，8周可诱导大鼠肝纤维化动物模型［4］。
酒精性肝损伤实验动物模型研究进展
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/5a15239995.html, 酒精性肝损伤实验动物模型研究进展 作者：陶伦 来源：《中国医学创新》2011年第05期 【关键词】酒精性肝损伤；动物模型 酒精性肝损伤即酒精性肝病（Alcoholic Liver Disease，ALD），是一种进行性发展严重危害身体健康的疾病。在世界范围内ALD发病率呈逐年上升趋势，为了深入研究其发病机制，筛选有效的防治药物，寻找理想的实验动物模型是十分必要的。本文就建立ALD动物模型研究进展作一简要综述。 1 急性酒精性肝损伤动物模型 赵静波等［1］按0.7 ml/（100 g?d）56度白酒灌胃大鼠，2次/d，酒精腹腔注射组按2 ml/（100 g?d）注射18%的乙醇溶液2次，持续10 d。结果表明白酒灌胃优于酒精腹腔注射。赵敏等［2］采用12 ml/kg 1次灌胃50%乙醇后禁食4、6、8、10、12、16、20和24 h，结果表明禁食16 h后模型组血中TG含量显著升高，HDL值显著降低，病理肝组织脂肪变性程度明显 加重。 2 慢性酒精性肝损伤动物模型 2.1 Liber-Decarli模型 Lieber-Decarli等［3］提出全营养素的酒精液体食料，研究发现酒精性脂肪肝的严重程度与食料中脂肪含量有关。此模型简便易行，形成率高及稳定性好，但动物须单独饲养，成本较高，不能保证较恒定的酒精摄入量。 2.2 Tsukamato-French模型 Tsukamato等［4］给大鼠手术置入胃管，持续注入含乙醇的液体食料。研究发现液体食料中脂肪量及种类与ALD形成有密切关系。该模型病变符合进行性ALD演变规律，造模效果好，实验重复率高，但酒精不符合正常摄入过程，技术要求高、维 护复杂、成本高，且至今尚未形成酒精性肝硬化模型［5］。朱强等［6］改进Tsukamoto-French的方法，将胃管直接经背部引出。该模型可根据实验对肝脏损伤的不同要求随时调整剂量和造模时间，造模成功率高、模型稳定、成本低。 2.3 直接饮用酒精王晓红等［7］给SD大鼠自由饮用酒精饮料，酒精浓度从5%开始逐渐递增至40%，每个浓度均持续1周，40%持续4周，造模时间共12周。此造模方式与酒精性 脂肪肝患者发病过程相似，简单易行，但不易控制酒精摄入量，难以保持血醇浓度，造模时间较长，成功率不高。
建立急性肝损伤模型
一、四氯化碳急性肝损伤模型 [造模原理] 四氯化碳(CCl4 )是无色透明液体,不溶于水.CCl4的毒性主要与其活性代谢产物有关.在肝内CCl4惊NADPH和肝微粒体细胞色素P450混合功能氧化酶的作用,生成活泼的三氯甲基自由基和氯自由基.这些自由基能与细胞内和细胞膜上大分子发生共价结合,引起富含不饱和脂肪酸的生物膜发生脂质过氧化,导致膜结构和功能完整性的破坏,肝细胞损伤坏死.三氯甲基自由基还能抑制细胞膜和微粒体膜上该泵的活性,食Ca2+内流增加,从而引起细胞中毒死亡;三氯甲基自由基能与蛋白质形成共价键,损害线粒体,使还原型辅酶Ⅰ(NADH)及ATP在肝内生成减少,脂肪酸氧化抑制,影响肝脏能量生成障碍,并使三酰甘油和脂肪酸在肝细胞内蓄积. [实验动物] 体重18-22g的小鼠、体重150-180的大鼠或体重4-45kg的家兔. [操作方法] 用CCl4 在不同动物可以多种方法引起急性肝损伤.一般用花生油将CCl4 稀释为所需浓度. CCl4 致急性肝损伤所需剂量和用法见表8-1 [模型评价与注意事项] 1.( CCl4肝损伤模型是最常用的急性肝损伤模型,造模方法简单,成功率高,重复性 好，价格低廉。 2．CCl4剂量不宜过大，以免造成动物中毒死亡。
3：CCl4是无色澄清的有毒液体，有特殊气味，难溶于水。CCl4 一般用花生油、橄榄油、豆油等植物油混合成所需浓度，有时也可与矿物油(如液体石蜡)混合。以植物油为例，10％CCl4的配制方法是：取5ml植物油和5g阿拉伯胶，置于乳钵中研匀，再加lOml纯CCl4。研匀，然后加蒸馏水lO~15ml调成乳状，最后加蒸馏水至lOOml，用前摇匀。 4．用CCl4复制肝损伤模型的主要缺点是,不同动物个体肝损伤的程度差异较大. 还有研究表明，小鼠接受CCl4后肝脏病理学改变与血清ALT等生化指标改变的相关性不如大鼠好。 5 CCl4 液体和蒸气可以从呼吸道、皮肤吸收,对人体有一定毒性，操作时应注意防护. 二、D-半乳糖胺急性肝损伤模型 [造模原理] D-半乳糖胺(D-galactosamine)引起急性肝损伤的机制尚不完全清楚。D-半乳糖胺本身并无毒性,也不直接损伤肝细胞。它是肝细胞磷酸尿嘧啶核苷的干扰剂,进入体内后与磷酸尿苷结合,形成磷酸尿苷一半乳糖胺复合物，致使磷酸尿苷耗竭。从而使依赖其生物合成的核酸、糖蛋白、脂糖等物质的合成受抑制，限制了细胞器及酶的生成和补充,细胞器、生物膜受损、钙离子内流，从而造成肝细胞损伤。另外，D-半乳糖胺引起细胞膜损伤可能与细胞膜中糖成分的改变有关，即己糖代替了中性糖介人细胞膜，导致膜分子结构发生变化。 [模型评价与注意事项] 1.本方法简便,成功率高,重复性好,其病变仅限于肝脏,在引起肝坏死的剂量下, 不引起其他脏器病变,对实验人员安全.因此D-半乳糖胺肝损伤模型是目前 公认的研究病毒性肝炎发病机制和药物治疗效果的较好模型. 2．造成机性肝损伤所需D-半乳糖胺的剂量.因实验动物的状态和实验要求的不同而有差异.一般使用200、400、500或850mg／kg体重，预实验时应摸索确定。 小鼠对D-半乳糖胺不甚敏感,腹腔和皮一卜注射的常用剂量均为800mg／kg体 重。 3．D-半乳糖胺与CCl4所致肝损伤的组织学改变明显不同。CCl4损伤主要表现在肝小叶中央静脉周围区大量肝细胞坏死和出血，脂肪变性十分明显；而D-半乳 糖胺引起的损伤则呈弥漫性、多发性片状坏死，脂肪变性不如CCl4明显，细 胞内有大量PAS染色阳性的毒性颗粒，嗜酸性小体较多见，与人类病毒性肝炎 的肝伤类似. 三、硫代乙酰胺急性肝损伤模型 [造模原理]
急性肺损伤动物模型的现状研究
０引言 急性肺损伤（Acute Lung Injury，简称ALI）是指由心源性以外的各种肺内、肺外的致病因素导致的急性、进行性呼吸衰竭，极易发展为急性呼吸窘迫综合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，简称ARDS），进而诱发多器官功能衰竭（Multiple Organ Dysfunction Syndrome，简称MODS）。因此，ALI是临床上常见的危重症，其病死率极高，对患者的生命造成了严重威胁，并影响其生存质量。同时，不同动物模型的实验性肺损伤已经用于研究ALI的发病机制。本文将已有的肺损伤动物模型的发生机制及临床应用综述如下。 １急性肺损伤 1.1病因 在临床上引起ALI的病因及高危因素很多，不同因素所致的ALI在病程及预后有所不同。ALI病因一般分为肺内因素（直接因素）和肺外因素（间接因素）两大类。肺内因素包括：（1）化学性因素，如吸入烟尘、胃内容物及氧中毒等；（2）物理性因素，如肺挫伤、放射性损伤等；（3）生物性因素，如重症肺炎。肺外因素包括：严重休克、感染中毒症、严重非胸部创伤、大面积烧伤、大量输血、急性胰腺炎、药物或麻醉品中毒等。当肺直接损伤时，首先累及肺泡上皮细胞，同时促使肺泡巨噬细胞（PMN）严重反应链的激活，释放多种促炎症因子及炎性介质，导致肺内炎症反应；间接肺损伤因素是激活全身系统性炎症反应，肺外炎性介质通过血液循环系统进入肺内，肺作为全身炎症反应的靶器官引起进一步损伤[1]。 1.2病理生理 ALI的病理生理学改变包括严重的低氧血症， 急性肺损伤动物模型的现状研究 ＣｕｒｒｅｎｔＳｉｔｕａｔｉｏｎｏｆＡｃｕｔｅＬｕｎｇＩｎｊｕｒｙＩｎＡｎｉｍａｌＭｏｄｅｌｓ 周榕颜春松 Zhou Rong Yan Chunsong （南昌大学第二附属医院，江西南昌330006） （Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Jingxi Nanchang330006） 摘要：急性肺损伤是全身炎症反应综合征在肺部的主要表现，往往也是多器官功能障碍综合征中最先出现的器官功能障碍，在其整个发病过程中居重要甚至是决定性的地位。合理地建立理想的急性肺损伤的动物模型对研究急性肺损伤的发病机制及早期防治具有重要意义。 关键词：急性肺损伤；动物模型 中图分类号：R-332文献标识码：A文章编号：1671-4792（2012）12-0221-06 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Acute lung injury(ALI)is a systemic inflammatory response syndrome mainly in the lungs,also the first appeared in the Multiple organ dysfunction syndrome(MODS),and occupies an important or even deci-sive position.Reasonable establishment of an animal model of acute lung injury,that is very important to study the pathogenesis and early prevention of acute lung injury. Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ALI；Animal Models 急性肺损伤动物模型的现状研究 ２２１
各类肝损伤模型的发病机制
病毒性肝炎 病毒性肝炎是由一组肝炎病毒引起的以肝细胞变形，坏死为主要病变的传染病，同时伴有不同程度的炎细胞浸润、肝细胞再生和纤维组织增生。 发病过程：病毒侵入机体后，进入肝细胞复制，继而释放入血，并在肝细胞表面留下特异性病毒抗原，此抗原与肝细胞膜结合，使肝细胞表面的抗原性发生改变。 肝细胞变性： 1、细胞水肿 2、嗜酸性变 肝细胞坏死： 1、嗜酸性坏死 2、溶解性坏死 3、炎细胞浸润 4、肝细胞再生 酒精性肝病 发病机制： 1、还原型辅酶I(NADH)/辅酶I（NAD）比值增高乙醇氧化脱氢过程使NAD转变为NADH，导致NADH/NAD比值增高，进而引起脂肪酸的氧化能力降低，引进脂肪在肝内堆积而发生脂肪肝。 2、乙醛和自由基的损害作用乙醛是乙醇的中间代谢产
物，具有强烈的脂质过氧化反应和毒性作用。乙醇在肝细胞内受微粒体氧化系统作用产生自由基损伤肝细胞的膜系统，影响肝细胞功能。 3、刺激储脂细胞产生胶原此为酒精性肝硬化的重要机制 4、乙醇的肝损伤作用乙醇可直接损害肝细胞内微管、线粒体的功能和膜的流动性，从而影响蛋白质输出和脂肪代谢等。 病理变化：慢性酒精中毒主要引起酒精性脂肪肝，酒精性肝炎和酒精性肝硬化。 药物及中毒性肝损伤 1、口服避孕药、甲睾酮等引起肝内淤胆，小胆管及毛细胆管形成，并无肝细胞坏死及炎症反应。 2、氯丙嗪、硫尿嘧啶、红酶毒、酚噻嗪和磺胺等引起胆汁淤积又引起肝细胞坏死。 3、氟烷、对乙酰胺基酚、异烟肼、四环素等引起明显的肝细胞变性坏死并伴有炎症 肝硬化 肝硬化是由于肝细胞弥漫性变性坏死，纤维组织增生和肝细胞结节状再生最终导致肝小叶结构和血液循环途径逐渐被改建，使肝细胞变形、变硬形成肝硬化。 门脉性肝硬化：
LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF—α表达
LPS诱导小鼠急性肺损伤TLR4及TNF—α表达目的：研究脂多糖（LPS）诱导的小鼠急性肺损伤机制。方法：实验分为 正常对照组、模型组及抗体组；正常对照组小鼠腹腔腔内注射等量0.9%NaCl。模型组腹腔内注射LPS（4 mg/kg）。抗体组在造模前8～10 h，应用小鼠Toll样受体4/髓样分化蛋白2（TLR4/MD2）复合物抗体腹腔内注射50 μg。各组均在造模5 h后留取血和肺组织，采用细菌内毒动态浊度法检测血浆LPS的含量，HE 染色判定小鼠肺组织病理变化，RT-PCR测定小鼠肺组织TLR4基因表达，Western-blot测定TLR4蛋白表达；ELISA检测小鼠血清中TNF-α的水平。结果：和正常对照组比较，模型组及抗体组小鼠血浆内毒素含量显著升高（P＜0.05），模型组小鼠肺组织HE染色呈ALI表现；和模型组比较，抗体组TLR4 mRNA、蛋白及TNF-α的表达明显下调（P＜0.05）。结论：急性肺损伤机制可能与LPS 和TLR4受体结合介导TNF-α信号途径相关。 急性肺损伤（Acute Lung Injury，ALI）是在创伤、重症感染、休克等等非心源性疾病过程中，肺泡上皮细胞和肺毛细血管内皮细胞损伤造成的弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致的急性低氧性呼吸功能不全或衰竭[1]；脂多糖（LPS）诱导的ALI在重症感染后早期出现[2]，并且死亡率较高[3]。Toll like receptors（TLRs）家族和先天性免疫系统关系比较密切[4]，其中TLR4目前研究最多，是LPS受体[5]。本实验基于建造小鼠内毒诱导ALI[6-7]，深入探讨ALI、LPS和TLR4及TNF-α之间的关系及损伤机制，并可能为临床ALI的预防和治疗提供实验基础和新方法。 1 材料与方法 1.1 主要材料、仪器及试剂DNA marker（大连宝生物）和引物（大连宝生物），梯度PCR仪器（德国Biometre公司），超净工作台（苏州净化设备厂），DU800核算蛋白分析仪（德国BECKMAN COULTER公司），半干式转膜仪，辣根标记羊抗兔二抗（北京中杉金桥）兔抗小鼠TLR4抗体（SANTA），DNA及蛋白maker（大连宝生物），引物（大连宝生物）。1.2 方法 1.2.1 实验动物及分组SPF级别的BALB/C雄性小鼠，体重30～35 g，随机分成3组，每组10只，A组为正常对照组，不作任何处理；B组为急性肺损伤模型组：腹腔内注射给予LPS（4 mg/kg）腹腔内注射制备ALI模型；C组为抗体组：建造ALI模型前8～10 h给予TLR4/MD腹腔内注射（50 μg）。在建造模型成功后各组小鼠无菌条件下取出肺组织和取小鼠血检测内毒素及TNF-α水平，一部分肺组织置于液氮冷冻后，在-80 ℃冰箱保存，为mRNA及蛋白表达的检测，另外部分放置在4%多聚甲醛内固定24 h后，HE染色镜下观察小鼠肺组织形态改变。 1.2.2 实验指标检测及试验方法 1.2.2.1 小鼠血内毒素含量检测选用试剂盒（动态浊度法-血浆内毒素检测试
肝损伤动物模型研究进展
【关键词】肝疾病；毒物，四氯化碳；醋氨酚；疾病模型，动物 肝损伤是各种肝脏疾病的病变结果，对肝损伤的防治目前仍是一个严峻的课题。通过建立实验性肝损伤动物模型，研究肝病的发生机制，筛选保肝药物，探索保肝作用原理，具有重要的现实意义。现将近年来国内外对实验性肝损伤动物模型分类、作用原理、造模方法及其优缺点等研究进展作综述和探讨。 1 化学性肝损伤动物模型 1.1 四氯化碳（carbon tetrachloride, ccl4） ccl4导致肝损伤的主要机制目前认为与其自身和自由基代谢产物有关。ccl4代谢产生的自由基进入机体后，在肝脏经细胞色素p450激活，生成三氯甲基自由基和三氯甲基过氧自由基，攻击肝脏细胞膜上的磷脂分子，使得细胞膜、内质网膜发生氯烷化和脂质过氧化，损伤细胞膜、细胞器；还能与膜脂质和蛋白质大分子进行共价结合，影响蛋白质代谢，并且破坏膜结构和功能的完整性，钙离子内流增加，影响细胞正常生理功能，最终导致肝细胞胞质中的可溶性酶渗出，细胞死亡[1]。 ccl4所致肝损伤可分为急性和慢性。急性肝损伤：赖力英等应用4 ml/kg ccl4剂量灌胃可诱发sd大鼠急性肝功能衰竭，死亡率达85 %[2]。慢性肝损伤：zhang等采用2 ml/kg ccl4腹膜内注射sd大鼠，每周2次，持续9周可伴有肝细胞坏死和明显炎症的肝硬化[3]。ccl4导致肝损伤是经典模型之一，能准确反应肝细胞功能、代谢及形态学变化，重复性好且经济。但ccl4同时还损伤动物的心、脾、肺、肾、脑等器官，另外，蒸汽和液体可由呼吸道、皮肤吸收，对人体也有一定毒性，操作时应注意。 1.2 α 萘基异硫氰酸酯(α naphthylisot hiocyanate, anit) anit是一种间接肝毒剂，其主要损害是通过膜脂质过氧化反应，致使肝细胞变性、坏死、胞内血清谷丙转氨酶(alt）大量溢入血流，同时还导致胆管上皮细胞肿胀坏死，引起毛细胆管增生及小叶间胆管周围产生炎症，从而造成胆管阻塞，形成明显的胆汁淤积，并伴随以点状坏死为主的肝实质细胞损害，产生梗阻性黄疸，出现高胆红素血症和胆汁分泌减少。 1.3 d 氨基半乳糖(d galactosamine, d galn ) d galn是一种肝细胞磷酸尿嘧啶核苷干扰剂，通过竞争生成二磷酸尿苷半乳糖使磷酸尿苷耗竭,导致肝细胞的rna和浆膜蛋白合成障碍，限制细胞器的再生及酶的生成和补充，使细胞器受损，引起肝细胞变性、坏死；另外d galn还可以与肝实质细胞膜特异性结合，影响其完整性，引起肝细胞内ca2+增多，mg2+减少，抑制线粒体功能，激活磷脂酶，加速氧化自由基的产生，因此mg2+/ca2+的比例失调也是d galn导致肝细胞不可逆损害的因素之一；加上使肝脏谷胱甘肽减少，并激活库普弗释放tnf α引起细胞凋亡[5]。 李梅等筛选d galn造模的最佳剂量，比较d galn造成的大、小鼠急性肝损伤模型的稳定性，发现d galn 500 mg/kg诱导的大鼠急性肝损伤模型肝组织形态变化显著且死亡率低，更适用于保肝新药的筛选与评价[6]。d galn形成的急性肝功能衰竭模型是研究病毒性肝炎的发病机制及有效治疗药物理想的实验动物模型，其优点是该模型的病变仅限于肝脏，不涉及其它器官，症状、生物化学、组织学表现接近人，给药方便，重复性好，终点明确，具有可逆性，不造成环境污染及人体伤害，不需特殊的实验操作保护措施，对肝衰竭、肝性脑病、人工肝支持系统的评价研究有重要价值，但价格昂贵导致应用受限。 1.4 二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,dmn) dmn是常见的致肝癌剂，它通过微粒体代谢，其中间产物与细胞核酸、蛋白质等结合可造成细胞内大分子损伤，诱发大鼠肝窦壁肝星状细胞的活化，导致过多增多和沉积，引起肝纤维化形成；同时促进窦内皮细胞形成肝窦毛细血管化，加重肝损伤，促进肝纤维化的发展 [7]。 1.5 硫代乙酰胺( thioacetamide，taa) taa具有直接肝毒性作用，摄入后可经肝细胞内细胞色素p450混合功能氧化酶代谢为taa硫氧化物，干扰细胞核内rna转移，影响蛋白质合成和酶活力，增加肝细胞核内dna合成及有丝分裂，促进肝硬化发展，同时激活肝细胞磷脂酶