食科系毕业论文

高等教育自学考试

毕业论文

论文题目：牛奶中抗生素残留的危害及检测技术

作者姓名：武霖娜

专业：食品科学与工程

主考学校：甘肃农业大学

准考证号：442312111057

指导教师：牛黎莉

甘肃省高等教育自学考试办公室印制

2013年4月2日

论文题目:牛奶中抗生素残留的危害及检术

论文题目:Harm and detection of antibiotic residues in milk

论文作者（中文）：武霖娜

论文作者（英文）：Wu Linna

目录

独创性声明 (1)

摘要 (1)

关键词 (1)

1．牛奶中抗生素残留的来源及危害 (1)

1．1牛奶中抗生素残留的来源 (1)

2．牛奶中抗生素残留检测方法研究进展 (2)

2．1微生物检测法 (2)

2．2理化检测法 (3)

2．3免疫法 (5)

3．预防牛奶中抗生素残留的措施 (6)

3．1加强对饲料的检验，防止饲料中出现抗生素药物 (6)

3．2控制奶牛乳腺炎的发病率 (7)

3．3严格遵守休药期规定 (7)

3．4加强饲养管理 (7)

3．5加强法规体系建设 (7)

参考文献 (8)

致谢 (9)

独创性声明

本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括获得高等教育自学考试或其他教育机构的证书或学位而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献已在论文中做了明确的说明表示了谢意。

签名：日期：

牛奶中抗生素残留的危害及检测技术

武霖娜

摘要：抗生素越来越多地被应用于畜牧业生产中，其在乳制品的残留问题备受关注。本文对牛奶中抗生素残留的来源及危害性进行了阐述，并对国内外牛奶中抗生素的检测常用的微生物检测法、理化检测法中的气相色谱法、液相色谱法、以及与质谱联用技术，和免疫检测等方法进行详细阐述，最后对如何预防牛奶中抗生素残留，提出了几种措施。

关键词：牛奶抗生素残留检测技术

1．牛奶中抗生素残留的来源及危害

1.1牛奶中抗生素残留的来源

一般认为，对泌乳牛用药不当或不注意安全时间是牛乳中抗生素残留的重要因素，尤其是使用乳房灌注法治疗乳腺炎时，易造成牛乳中抗生素残留。在饲料中添加饲料添加剂已十分普遍，其中含有一定比例的抗生素，主要作用是预防疾病，这是牛奶抗生素残留的主要原因。此外一些不法交奶户在高温季节为防止乳的酸败，往往向牛奶中参加各种抗生素，这也是牛乳中抗生素残留的一个来源。1983年Egan调查表明用经抗生素治疗的乳牛用过的挤乳器给正常乳牛挤乳，可使正常牛的乳中残留抗生素，所以挤乳是乳中抗生素残留的另一个来源。

1.2牛乳中抗生素残留的危害

牛乳是老少皆宜的营养品，牛奶中若含有抗生素，对长期饮用者来说无疑是等于长期服用小剂量的抗生素，对抗生素有过敏体质的人服用残留抗生素的乳后会发生过敏反应。即使是正常饮用者，体内的某些条件性致病菌易产生耐药性，一旦患病再用同种抗生素治疗很难奏效。抗生素是奶场治疗乳房炎的常规药物，由于长期大量使用，是耐药菌株增加，一些乳房炎病例变得难以用常规方法治愈。这种情况又促使临诊兽医再治疗过程中加大抗生素用量。此外，牛奶中抗生素残留会影响奶制品品质，如果用含抗生素的奶做酸奶或乳酪等，则残留在其中的抗

生素会抑制细菌的发酵，使产量和质量降低。因此市场不允许出售抗生素残留过量的牛奶，同时也造成牛奶生产者的经济损失。

2．牛奶中抗生素残留检测方法研究进展

2.1 微生物检测法

微生物检测法是应用较广泛的方法，其测定原理是根据抗生素对微生物的生理机能﹑代谢的抑制作用，来定性或定量确定样品中抗生素药物残留,如纸片法( PD ) ﹑TTC法﹑拭子法(STOP )等.采用传统微生物检测方法,缺点是: (1)时间长; (2 )显色状态判断通过肉眼辨别,易产生误差对微红色者无法做出准确判断;(3)操作复杂。优点是：费用低，一般实验室都能操作。其中，纸片法和TTC 法是牛奶中药物残留检测的两种常用的微生物检测法。

2.1.1 纸片法

纸片法，即PD法（Paper Disc）。常用的纸片法有枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片检测法。这两种方法主要用来检测牛奶中的β—内酰胺类抗生素，其操作过程基本相同，而选用的菌种不同。枯草杆菌纸片法检测的结果一出现假阳性，为了确定阳性物质是否为青霉素或（β—内酰胺类），对加热后的乳样用青霉素酶处理，以灭活乳样中的青霉素。然后再进行检测，检测限可达0.01IU/mL 以下。一般在4h内即可获得结果。此外，在实践中嗜热脂肪杆菌纸片法比枯草杆菌纸片法应用更为广泛。此外，纸片法有了进一步研究和改进，改进后的纸片法不仅能够确定抗生素的种类，而且提高了检出率和准确性，氯霉素最低检出量0.01㎎/㎏,土霉素0.05 mg/kg，链霉素1mg/kg，红霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025 mg/kg。

2.1.2 TTC法

TTC法氯化三苯基四氮唑法，是目前我国食品卫生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法（GB5409—85）。该法简便、快速，无需特殊设备，3~4h可见报告，很适合牧场、乳品厂及食品卫生检测部门采用。检查各种抗生

素所用的TTC法实验的灵敏度，（最低检出量）分别为：0.004U/ ml，链霉素0.5U/mL，庆大霉素0.4 U/ ml，卡那霉素U/ml 。

目前趋向研究更为灵敏、准确、简便、快速的微生物检测法（CAST）。如美国和加拿大，使用拭子法和牛的抗生素和磺胺试验法(CAST)。

2.2 理化检测法

理化检测方法是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量。如高效液相色谱法、气相色谱法、质谱法、联用技术等，能进行定性、定量和药物鉴定，敏感性较高，但有的检测程序较复杂，有的检测费用较高，在牛奶中抗生素残留检测方面，最常见的理化检测方法是高效液相色谱和联用技术。

2.2.1高效液相色谱法

高效液相色谱法是目前广泛应用的一种理化检测方法，它引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵，搞笑固定相和高灵敏度检测器，实现了分离速度快、效率高和操作自动化，几乎所有的化合物包括高级性∕离子型待测物和大分子物质，均可用高效液相色谱法进行测定。高效液相色谱法的分离机制与常规柱色谱法相同，但填料更加精细（Φ5～10μm）。需高压泵推动，柱效高（105塔板∕m）速度快。

最常用的检测方式为浓度型的紫外检测器和荧光检测器，紫外检测器最普及，其次是荧光检测器。由于奶样中药物残留量少，背景干扰往往很严重，因此，一般都通过柱前衍生反应来提高紫外检测器检测残留的灵敏度。岳振峰等报道了用高效液相色谱法检测牛奶中氯霉素的残留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中残留的氯霉素，用紫外检测器在278nm检测样品。平均加收率94.8%。变异系数＜12.0%。此方法样品前处理简单、回收率高、实用性强、检验灵敏度高、重现性好、检测数据准确可靠，可作为牛奶中氯霉素残留检测的确证方法，又能与大部分抗生素在高于230nm的光谱区无吸收，而在低于230nm的紫外区许多样本基质和流动相产生干扰，需衍生化后测定，限制了紫外检测器的应用。但是，大部分抗生素是手性分子，因此旋光检测器有很大发展潜力。旋光以下特点：（1）选择性高，

样本仅需简单提取即可；（2）灵敏度高，利用He — He 激光作光源，灵敏度可达5~10μα水平；（3）可同时得到流出组分的比旋度[α]，用以定性。目前，该方法以用于红霉素、庆大霉素、羧苄青霉素和吩羧青霉素残留的测定。

此外，二级管光阵列检测器（DAD）是近10年来HPLC最重要的突破。DAD 可同时接受整个光谱区的信息，在色谱峰流出同时能进行每个瞬间的动态光谱扫描并快速采集信号，经计算机处理后得到色谱—光谱的三维图谱，信息量大大增加。一次进样可得到每个组分峰的定量、定性的纯度信息，灵敏度亦明显提高。

2.2.2联用技术

各种分析技术联用是现代兽药残留分析乃至整个化学分析方法上的发展特点。计算机的应用加速了这一趋势。联用技术可扬长避短，一般级分离、定量和定性（分子结构信息）于一体，因而特别适用于确证性分析。常见的联用技术，有TLC—MS、GC—MS、LC—MS、CZE— MS、LC—NMR、SFC— MS等。TLC—MS是最简单离线联用技术。GC—MS已相当成熟，应用相对较多。但这些联用仪器价格昂贵，远不如HPLC或GC那样普及。

MS无疑可作为HPLC的通用型检测器。使用微型（15×0.3cmid）和适宜的接口技术，如热喷雾(TSP)微粒束(PB)等解决了LC与MS的连接问题；使用软电离技术，如快原子轰击(FAB)，场解吸(FD)等解决了难气化物质的离子化问题。LC—MS现在已进入实验阶段，其灵敏度较荧光检测器高1个数量级，能方便地对n g级的兽药残留组分进行检测与结构确证。LC—NMR还可提供待测物立体化学方面的信息。

LC∕MS是除GC∕MS之外的一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统。LC∕M S对高沸点、不发挥和热不稳定的化合物分离和鉴定具有独特的优势。色∕质联用法由于实现了高效层析分离和检测联机，可用微电脑控制层析条件、程序和数据处理，其特异性、灵敏度和重复性均好，并可以一次同时完成同一样本中多种药物及其代谢物检测。其分析方式有直接探头分析法、直接液体导入法、GC∕MS 、LC∕MS联用法等。使用电子轰击离子化、化学电离、快速原子轰击、热喷雾电离、等离子体喷雾、粒子束电离、大气压化学，电离(APCI)和电喷雾电离(ESI)技术对不同MS离子源条件下青霉素类药物分子碎片类型的特征已经作

了大量的工作。另外离子型质谱技术（MS∕MS）也已用于鉴别青霉素类药物。如Straub等使用LC∕ES∕MS测定了牛奶中的几种青霉素残留。青霉素，邻氯青霉素与苄青霉素的最低测定限为3~5μg/kg。

2.2.3其它理化检测方法

牛奶中抗生素残留检测方法还有气相色谱(GC) 、高效薄层色谱(HPTLC) 、超临界流体色谱(SFC)和毛细管区域电脉(CZE)等。这些方法尽管在残留检测中不常用，但因其各自特有的性能，能弥补常用方法中不足之处。

2.3免疫法

目前药物残留免疫分析技术主要分为两大类：一为相对独立的分析方法，即免疫测定法；二是将免疫分析技术与常规理化分析技术联用。与常规理化分析技术相比，免疫分析技术最突出的优点是操作简单、速度快、分析成本低。

免疫分析能与其他技术联用。在联用方法中，免疫分析技术即可作为HPLC 或GC等测定技术的样品净化或分离手段，如IAC∕HPLIAC∕GC、HOIAC∕HPLC；也可作为其离线或在线检测方法，如HPLC∕IA、TLC∕IA、CZE∕IA、SFC∕IA、FIA∕IA 等，这些方法结合了免疫分析的选择性、灵敏度与HPLC、GC等技术的高速、高效分离和准确检测能力，使分离过程简化、分析成本下降，拓展了待测物范围。在HPLC∕IA等分析中，IA一般作为离线检测方法。又称免疫图谱法，适用于液相检测器无响应或分离困难残留组分检测。

ELISA试剂盒是目前奶牛场和牛奶公司使用最广泛、快速、灵敏的检测抗生素方法。各类抗生素试剂盒为国外生产，这使得国内的奶及奶制品公司花费较大。因此很有必要研制和开发出国产的试剂盒，以降低成本，提高经济效益。其中TTC法是最常见的检验抗生素的方法。

TTC法：TTC法是我国鲜奶中抗生素残留量检验标准（GB4689.27—94）的检测法，属生物检测法。其测定原理基于抗生素对微生物的抑制作用。如果牛奶中含抗生素，则加入菌种（嗜热链球菌）经培育2.5~3小时后，加入TTC指示剂（三苯基四氮唑）不发生还原反应，所以样品呈无色状态；如牛奶中不含抗生素，则样品呈红色。这样实验后样品颜色不变的为阳性，样品染成红色的为阴性。

TTC法的具体操作步骤；

(1) 菌液制备：将单菌种（嗜热链球菌）以脱脂乳为培养基，在36±1℃培养箱中培养15小时后，再以脱脂乳以至于1∶1稀释待用；

(2) 取待测样液9ml，在80℃水浴加热5分钟后冷却到37℃以下，加活菌液1ml，在36±1℃水浴2小时，加入4％的TTC指示剂0.3ml，36±1℃水浴培养30分钟；

(3) 若样液颜色不变为阳性，呈红色为阴性；若阳性的样液，再置于水浴中培养30分钟，不显色的为阳性，呈红色为阴性。

TTC法测定各种抗生素的灵敏度为：青霉素：4ppb，链霉素：500ppb，庆大霉素：400ppb，卡那霉素：5000ppb。它具有费用低，易开展的优点；缺点是耗时长，要求操作人员需有一定专业知识且实验过程中菌液的制备、水浴过程控制都要求严格遵守操作规程，否则易出现假阳性，以致出现检验结果的不稳定性。

Snap法：该方法是酶联免疫法，由美国IDEXX公司生产其检测分析仪及其试剂盒，均获得AOAC认证，它利用了竞争酶联免疫技术。其基本原理是用特异性抗体将固相载体激活，加入含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原在

45±5℃共同保温，是样品内的抗生素与内置抗生素标志物竞争与固定的抗体结合，然后进行洗涤和显色，内置抗生素标志物与固定的抗体结合形成的复合体，通过酶的作用分解可形成有色物质，通过测定色度并与参照物对照，就可以确定结果是阳性或阴性。

3．预防牛奶中抗生素残留的措施

3.1加强对饲料的检验，防止饲料中出现抗生素药物

随着市场经济的发展，有关兽药的法律法规不断地加以完善，目前一些兽药厂、饲料厂、养殖场等为追求经济利益，饲料中滥加药物，以及非法添加禁用药物的现象必须得到遏制。只有保证饲料的质量安全，才能有效地避免抗生素的残留，同时对饲养奶牛的饲料经常进行定期和不定期的检测，大力提倡并合理的饲喂无公害的饲料和添加剂。

3.2控制奶牛乳腺炎的发病率

乳腺炎不仅影响泌乳功能，而且降低产奶量，影响奶的品质，给奶牛业造成巨大损失，在干奶期进行乳腺炎的防治，可以有效地控制奶牛乳腺炎的发病率。

3.3严格遵守休药期规定

适当的休药期可避免抗生素残留超标，因此不少国家规定用抗生素治疗之后72-96小时之内不能食用。我国食品卫生法规定，在应用抗生素期间和停药后5天内不能食用。

3.4加强饲养管理

将患病奶牛单独隔离饲喂，要及时淘汰部分奶牛。做到科学选药，正确用药，且挤奶器具不得混用，做到安全挤奶，及时做好鲜奶的卫生处理。

3.5 加强法规体系建设

①加强乳品安全体系建设。②加强兽药管理，建立兽药残留监测体系。③建立统一的监督管理体系。④推进无公害产地认证。在畜牧养殖业全面推行HACCP 系统。

结束语

鉴于牛奶中抗生素残留是涉及人类健康的公共卫生问题，应加强生产者的主体意识教育和管理者的执法教育，并努力研究发展一些简单、快速和便携化的筛选多残留分析技术，意图高分析效率、降低成本，保护消费者的健康。

参考文献

[1]邓斌，邓春来，张曦.牛奶中抗生素残留及其检测方法研究[J]饲料工业，2003年04期，79

[2]陈怀宇，黄周英，林育腾.牛乳中抗生素的残留与危害现状[J]，泉州师范学院学报，2004年06期，4

[3]余奇飞，陈翠莲，孙莉娜，林洵，谢建华。牛奶中抗生素残留检验方法的研究进展，[J]农产品加工（学刊），2005年11月，16

[4]黄怡君，姜也文，胡松华.TTC法检测牛奶中抗菌药物[J]，中国奶牛，2006年09期，468

[5]陈基耘，徐建君.浅谈我国液相色谱法检测牛奶中抗生素残留研究现状[J]计量与检测技术，2008年07期，325

[6]刘琴.我国牛奶中抗生素残留现状分析及对策[J]，当代畜牧，2005年06期，97

[7] 岳振峰，邱月明，林秀云，吉彩霓，高效液相色谱串联质谱法测定牛奶中四环素类抗生素及其代谢产物[J] ，分析化学，2006年09期，225

[8]贾薇，孙璐，史向国，陈笑艳，钟大放，液相色谱-质谱联用法测定牛奶中4种四环素类药物残留量[J] ，沈阳药科大学学报，2002年02期，86

致谢

本文是在牛老师精心指导和大力支持下完成的。牛老师以严谨求实的治学态、度高的敬业精神，兢兢业业、孜孜以求的工作作风对我产生重要影响。她渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深地启迪。同时，在此次毕业设计过程中我也学到了许多关于牛奶中抗生素残留的危害及检测技术的知识，理论知识有了很大提高。另外，我还要特别感谢同学对我论文写作的指导，他们为我完成这篇论文提供了很大的帮助。最后，再次对关心、帮助我的老师和同学表示衷心的感谢！

论文评定表

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