南医大医学微生物学实验报告总结优化版

脓汁和粪便标本中病原菌的检测

20xx级xx专业(x)班学号XX 姓名xx

第x室第x组组员:xx 指导老师:xx

[摘要]脓汁和粪便标本中有不同的病原菌。本实验主要探究检测其病原菌的类型并通过一系列的观察与鉴定从而确定其病原菌的名称和性质。在实践中学习培

养基的制备、消毒和灭菌,细菌的分离与培养,细菌群体和个体形态特征的观察,

细菌生化反应鉴定等技巧。从而掌握微生物实验的各种操作方法,培养对微生物

实验的兴趣。

[引言]常见的化脓性病原菌有葡萄球菌、链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、肺炎链球菌、结核杆菌、假单胞菌、流感杆菌等。浓汁标本在做细菌分离培养的同时,

均须直接涂片检查,观察是否有典型形态的菌体,芽孢有无,为临床提供最初的

诊治依据。

粪便标本中常见的病原菌有志贺氏菌属、致病性大肠杆菌属、弧菌属、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、艰难梭菌等。粪便标本中常含有很多杂菌,应根据检验目的菌的不同而选择培养基(如SS、伊红美蓝平板、碱性蛋白胨水),尽可能抑制杂菌,以利于病原菌的检出。

本实验通过常规的病原菌检测方法从脓汁标本中分离出黄白两种细菌,均为

革兰氏阳性球菌,其中黄色是致病菌——金黄色葡萄球菌,白色是白色葡萄球菌;

从粪便标本中分离到紫黑色和粉红色的细菌,均为革兰氏阴性杆菌,其中紫黑色

的是大肠埃希菌,粉红色的是痢疾志贺菌。

1实验材料

1.1器材

打火机油性笔酒精灯接种环接种针污物盘普通冰柜隔水式电热恒温培养箱奥林巴斯CX21型生物显微镜电炉试管(带棉塞)称量纸药勺牛皮纸硫酸纸橡皮筋尺子锥形瓶高压蒸汽灭菌器镊子bo片吸水纸拭镜纸

1.2 试剂药品

普通营养琼脂培养基蒸馏水脓汁标本粪便标本石蜡油生理盐水

结晶紫卢戈碘液95%乙醇稀释复红葡萄糖微量发酵管(2支)乳糖微量发酵管(2支)青霉素抗菌素纸片链霉素抗菌素纸片庆大霉素抗菌素纸片血浆福氏志贺菌诊断血清

2 实验方法与步骤

实验的总流程

细菌的分离培养细菌纯培养细菌的形态

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学检查细菌的生化试验细菌的血清学试验、结果分析

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2.1培养基制备

干粉培养基→蒸馏水→加热溶化→分装→集中放在试管筐里→罩上硫酸纸、牛皮纸→用橡皮筋扎好→放入讲台边的灭菌桶或灭菌筐内→送到高压蒸汽灭菌室(洗刷室)→灭菌→

1)平板培养基:倾注平板10ml→琼脂完全凝固后,平板倒放

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→4℃冰箱保存备用。

2)斜面培养基:培养基趁热斜放→琼脂凝固以后,4℃冰箱保存备用。

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贴上标签后灭菌使用。

2.2空气与人体体表细菌学检查

2.2.1空气的细菌学检查

2.2.1.1实验方法

自然沉降法:根据空气中细菌气溶胶粒子,在地心引力的作用下,以垂直的自然方式沉降到培养基表面,培养以后,计数菌落形成单位

(colony forming unit ,CFU),可了解空气的污染情况。

2.2.1.1实验步骤:

每组1个营养琼脂平板,选择采样地点(实验室、卫生间或任选地点)→将平板盖打开,盖朝下放置在平板旁边→平板暴露于空气中15分钟→平板倒扣盖上→作标记→37℃温箱培养24小时→观察结果。

2.2.2人体体表的细菌学检查

甲乙常规洗手,丙丁标准洗手。甲和乙、丙和丁共用1个平板按下图在普通平板上接种手指上的细菌。第1格为洗手前,第2格为洗手后,第3格为消毒后,第4格空白对照。

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图1

2.3 细菌的分离培养

2.3.1实验方法

平板划线法:借助于划线,将混杂的多种细菌,在平板表面分散成单个细菌,并固定在某一点上。培养以后细菌各自分裂繁殖,形成肉眼可见的细菌集团(单菌落)。

2.3.2实验步骤

接种环烧灼灭菌→分别取脓汁标本与粪便标本点在普通平板和依红

美蓝平板上,各做两份,→烧掉接种环上多余的标本→冷却后,应用分区划线分离法,将脓汁标本接种于营养琼脂平板(2份),粪便标本接种于伊红美蓝平板(2份)→接种环烧灼灭菌→将平板倒置37℃培养18~24h→观察结果。

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图2

2.4细菌的群体生长特性观察和纯化培养

2.4.1实验方法

斜面接种法:是一种从已经生长好的菌种中挑取少量菌种移植到另一个斜面培养基的饭方法。该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。用灭菌的接种环取单个菌落或少许细菌,从培养基斜面底部向上划一条直线,然后从底部向上作连续曲线划线,一直划到斜面顶端。

2.4.2实验步骤

接种环烧灼灭菌→挑选平板上典型的四种单菌落(白色、黄色、紫黑色、粉红色)进行斜面接种纯培养→做好标记→接种环烧灼灭菌→斜面培养基置于37℃培养过夜→保存备用

2.5细菌的个体形态特征的观察

2.5.1实验方法:革兰氏染色,肉汤接种法

2.5.2实验步骤

革兰氏染色:取洁净载玻片→用灭菌操作后的接种环取生理盐水1-2环于玻片上→挑取细菌培养物少许与盐水轻轻抹匀→待涂片干燥后在酒精灯火焰外侧快速来回2-3回合→

结晶紫→初染1分钟→水洗→

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卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→

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95%乙醇→脱色约20秒钟→水洗→

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稀释品红→复染1分钟→水洗→

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吸干,镜检。

2.5.3肉汤接种法:

接种环烧灼灭菌→分别在斜面培养物中挑取菌苔少许→立即移入肉汤培养基管中→在接近液面的管壁上轻轻研磨→沾取少量肉汤调和→混匀→试管口通过火焰2-3次灭菌→塞好棉塞→35℃培养4~6小时2.6 药敏试验

2.6.1实验方法

纸片扩散法:将含有定量抗菌素的纸片,平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分,溶解后不断向周

围扩散,形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长受到抑制,而形成没有细菌生长的抑菌圈

2.6.2实验步骤

接种环烧灼灭菌→分别取之前实验中得到的四种菌液在普通平板密集涂布→接种环烧灼灭菌→标记:青、链、庆→镊子火焰消毒→贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片→按压→镊子消毒→倒置37℃培养18~24小时→观察结果

2.7 血浆凝固酶试验

2.7.1实验方法:玻片法

2.7.2实验步骤

取干净bo片一张→在左右两边分别滴加兔血浆1-2滴,生理盐水1滴→接种环烧灼灭菌→冷却→分别用接种环取之前实验所得到的白色和黄色菌苔(2~3个菌落的菌量)与血浆研磨混合→边混匀边观察结果→接种环烧灼灭菌→稍等片刻,观察结果

2.8 糖发酵试验

接种针烧灼灭菌→用灭菌接种针分别刮取实验所得到的紫黑色和粉红色菌苔→分别接种在葡萄糖发酵微量管中和乳糖发酵微量管内→接种环烧灼灭菌→将微量管平放在平板内→37℃培养过夜后→观察结果。

2.9 动力试验

2.9.1实验方法:半固体接种法

2.9.1实验步骤

接种针烧灼灭菌→分别用接种针在紫黑色和粉红色的斜面取菌→

从半固体培养基中心垂直刺入,可刺达近底管处,但不要到达管底→循原来的路线退出接种针→试管口迅速通过火焰2-3次灭菌→塞好棉塞→烧灼灭菌接种针→37℃培养24小时→观察结果

2.10血清学实验

取洁净的载玻片一张→将磨面近端设为对照区→滴加生理盐水15ul →远端设为试验区→滴加福氏志贺菌诊断血清15ul →接种环烧灼灭菌→用接种环分别取粉红色菌苔→研磨于盐水或血清内,混合均匀→接种环烧灼灭菌→载玻片来回倾侧→观察结果

3结果

3.1细菌分离培养结果

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细菌分离培养结果表

标本

脓汁 粪便 菌落颜色 黄色 白色 紫黑色

淡粉红色 形态特征

圆形、隆起、表面光

具有金属光泽、

半透明,直

明,菌落直径2mm 左右 明,菌落直径2~3mm

结果

典型的葡萄球菌;结合菌落颜色,黄色的是金黄色葡萄球菌,白色的是白色葡萄球菌

从形态上不能鉴别是什么细菌

3.2细菌的个体形态特征的观察

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G-杆菌 G+球菌

细菌的个体形态特征表

菌落来源 脓汁标本 粪便标本 菌落颜色 黄色 白色 紫黑色 淡粉红色 油镜下特征 均为G+球菌,排列不规则,呈葡萄串状。

均为G-杆菌,散在排列

3.3药敏试验结果

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粉红色菌落紫黑色菌落

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白色菌落黄色菌落

药敏试验结果

菌落黄色白色紫黑色粉红色

青霉素+ + - -

链霉素+ + + +

庆大霉素+ + + +

备注:“+”为敏感,“-”为耐药

分析讨论:从种种的现象与结果可知,黄色的是G+金黄色葡萄球菌,白色的是白色葡萄球菌,紫黑色的是大肠埃希菌,粉红色的是痢疾志贺菌。其中,四种菌对链霉素和庆大霉素都敏感,而金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌对青霉素敏感,大肠埃希菌和痢疾志贺菌对青霉素表现为耐药。

3.4血浆凝固酶实验结果

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黄色(左)与白色(右)两种细菌血浆凝固酶实验图

血浆凝固实验表格

菌落黄色菌落白色菌落

现象血浆产生颗粒性物质不出现凝集反应

分析讨论:观察到黄色菌落的细菌能使血浆产生颗粒性物质,说明其为凝固酶阳性,是致病菌;白色菌落细菌不出现凝集反应,说明其为凝固酶阴性,不是致病菌

3.5糖发酵实验和动力试验结果

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糖发酵实验图动力试验图

糖发酵实验和动力试验表格

菌落

葡萄糖发酵现象

乳糖发酵现象 动力试验现象

紫黑色

黄色,分解糖,产酸又产气

黄色,分解糖,产酸又产气

扩散生长,培养基呈扩散云雾混沌状态 粉红色

黄色,分解糖,产酸不产气

无明显颜色变化,不分解糖

沿穿刺线生长,穿刺线边缘整齐,周围培养基清澈透明

分析讨论:半固体动力试验表明紫黑色菌落菌种半固体动力试验结果阳性,有鞭毛;粉红色菌落菌种半固体动力试验结果阴性,无鞭毛。

3.6血清学实验

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粉红色菌落血清学实验图 实验记录表

玻片凝集实验 福氏志贺菌诊断血清 生理盐水 现象

出现片状凝集现象

Bu 凝集

分析讨论:通过血清学实验,

粉红色菌落菌种与福氏志贺菌诊断血清

发生凝集反应,确定其为福氏志贺菌。

4.综合结果讨论

4.1对

脓汁中细菌的分析讨论

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4.2对粪便中细菌的分析讨论

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5.结论

综上所述,脓汁标本中分离得黄色菌落为金黄色葡萄球菌,白色菌落为白色葡萄球菌,致病菌为金黄色葡萄球菌;粪便标本中分离得紫黑色菌落为大肠埃希菌,粉红菌落为福氏志贺菌,致病菌为福氏志贺菌。

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