稳定株嘌呤霉素使用

使用过表达抗性慢病毒如何制备稳定细胞系？

步骤1，使用目的过表达gene-3xFLAG-IRES-puromycin慢病毒先在96孔板感染中目的细胞，可以设置3个左右不同的MOI组，待感染2-3天后，加入puromycin抗性药物进行筛选；（我们在293T细胞中puromycin维持药物浓度在5 μg/ml，2天即可杀死目的细胞；目的细胞的药物作用浓度可以参考该数值进行摸索）。实验过程中必须设置空细胞的加药组，以确保药物的有效性。

步骤2，对具有抗药的混淆细胞感染株进行消化，稀释，然后分散在96孔板中，确保平均每孔细胞数量1个左右。使用带有puromycin药物的培养基正常维持细胞，然后逐步放大，获得抗性稳定细胞系；

补充说明：对照病毒是GFP-3xFLAG-IRES-puromycin双标慢病毒，是带有荧光和抗性的，筛选对照稳定株的方法同步骤1和步骤2.

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嘌呤霉素用法

嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。 嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。 溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。 使用方法 1.建议使用浓度 哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定； 大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 2.溶解方法 用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。 3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例） 嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。 1） Day 1：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜；

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考） （1）24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）； （3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞； （4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基； （5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。 （6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。 嘌呤霉素筛选稳定转染细胞 （1）day0：24孔板内以5~8x104?cells/孔的密度铺板，孵育过夜； （2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基； （3）day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。） （4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜； （5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 （6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基； （7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。 注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。 储存方法和稳定性： 嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放； 嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。 Starttoselectonpuromycin(2ug/mlfinalconcentration)3-4daysposttransfection.Massivecelldeathwillbeevi dentafter36-48hoursselectiononpuromycin.Dependentonthetransfectionefficiency,mosttransfectionwon' testablishsomepuromycin-resistantcoloniesexceptthattheretrovirus-producingcelllinesareusedforgener atingviralvector.Ifthefirstgenerationlentiviralvectorisusedinthetransfection,trytouseMo-MLVenvelopexpre ssingvector,ratherthanVSV/Gexpressingvectorforpackagingviralvectors.Thestablecolonies(trytopoolthe differentpuromycin-resistantcellcoloniestogehter,don'tmakesinglecolonyclone)willbeamplifiedafter10-14 daysselectiononpuromycin.

嘌呤霉素说明书

说明：蛋白质合成抑制剂。抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。 嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。 嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。 溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。 使用方法 1.建议使用浓度 哺乳动物细胞：1-10μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定； 大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为 125μg/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 2.溶解方法 用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50mg/ml的母液，经0.22μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10mg/ml的储存液。 3.嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例） 嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。 1）Day1：24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜；

嘌呤霉素说明书教学内容

精品文档 说明：蛋白质合成抑制剂。抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。 嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger内发现的pac基因编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶（PAC），赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。 嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。 溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。 使用方法 1.建议使用浓度 哺乳动物细胞：1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定； 大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为 125μg/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 2.溶解方法 用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 μm滤膜过滤除菌后分装于-20℃冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。 3. 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（以shRNA转染或者慢病毒转导为例） 嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线（kill curve）。 1）Day 1：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37℃细胞孵育过夜； 精品文档

嘌呤霉素筛选程序

嘌呤霉素筛选程序 一、杀伤曲线 1. 在24 孔板内接种细胞，约3x104/孔，共11孔，培养过夜。 2. 第二天，观察细胞密度为20%-30%。稀释嘌呤霉素(0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 μg/ml)至培养基, 每孔加入0.75m l培养基。 3. 每隔2天观察细胞的存活情况（贴壁细胞飘起即为死亡，悬浮细胞，可以通过观察细胞的膜情况来判断，死亡细胞的细胞膜较为粗糙，有皱褶，没光泽，准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准），每隔2天更换0.75m l含相应浓度嘌呤霉素的培养基。 4. 筛选4-7天内使细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度，即为杀伤浓度（筛选浓度）； 二、细胞筛选 1.转染（24孔板进行）或电转后培养24小时，按10%密度传代（传至35mm 平皿），继续培养24小时，待细胞密度增至20％～25％汇合时； 2.去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度（杀伤曲线实验确定）配制 好的嘌呤霉素筛选培养基2-3ml。 3.根据培养基的颜色和细胞的存活情况，每隔2天更换一次筛选培养基(培养 基用量为2-4ml，细胞多，多加培养基，细胞少，少加培养基), 一般在3-4天内出现细胞大量或少量死亡情况（如果转染效率或电转效率高，则死亡少； 如果转染效率或电转效率低，则死亡多；如果筛选浓度偏低，筛选培养基用量少，细胞密度大于80%，会导致大量假阳性克隆）。如果筛选第一周，出现细胞大量死亡，则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周；如果

筛选第一周，出现细胞少量死亡，则把细胞按10%密度传代（传至35mm平皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃），利用筛选培养基进行筛选一周； 4.筛选第二周结束后，则把细胞消化下来，进行终点稀释（10ul培养基中含1 个细胞，用筛选培养基），把上述10ul细胞悬液加入96孔板中（提前加入40ul 筛选培养基），一共加24孔，4小时后观察每个孔的情况，记录只含一个细胞的孔，含有一个细胞的孔用于继续筛选，其余孔舍弃； 5.根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基，待细胞密度为80% 时，将其传代至24孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至6孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至T25瓶（一传3）中增殖, 每隔3天换液。 6.细胞大量扩增后，一瓶用于提取总RNA进行QPCR检测，一瓶用于总蛋白 进行WB检测，另一瓶用于保种，根据QPCR和WB结果取舍阳性克隆；

抗生素的功能与使用

抗生素的功能与使用 抗生素是细菌、霉菌或其他微生物的代谢产物或人工合成的类似物，通俗地讲，抗生素就是用于治疗各种细菌感染或抑制致病微生物感染的药物。其主要用途是抑制其他种类微生物的生长（抑菌作用）或将它们杀死（杀菌作用），一般情况下对其宿主不会产生严重的副作用。由于最初发现的一些抗生素主要对细菌有杀灭作用，所以一度将抗生素称为抗菌素。1981年，中国第四次全国抗生素学术会议决定将抗菌素正式更名为抗生素。20世纪90年代以后，科学家们发现，有些抗生素具有抑制某些特异酶的功能，另外一些抗生素则具有其他的生物活性或生理活性的作用。科学家们将抗生素的范围扩大，统称生物药物素。现已报道的几千种抗生素，按结构可分为6个类型： （1）糖的衍生物，主要由氨基己糖的衍生物组成，如链霉素； （2）多肽类抗生素，主要或全部由氨基酸组成，有多肽或蛋白质的某些特性，如多粘菌素、青霉素； （3）多烯类抗生素，分子结构中有多个双键，如制霉菌素、两性霉素； （4）大环内酯抗生素，是由一个或多个单糖组成并与碳链一起形成一个巨大的芳香内酯不化合物，如红霉素； （5）四环类抗生素，都具有四个缩合苯环，如四环素（6）嘌呤类抗生素，都含有嘌呤环，如嘌呤霉素。抗生素不同于一般消毒齐或杀虫剂，它主要干扰细胞的生理代谢（包括酶活性），使细胞不能以正常途径维持其生命活动而停上去生长甚至死亡。因经，抗生素的作用也就消失。抗生至少的作用对象有一定范围：这种作用范围就称为该抗生素的抗菌素、四环素等。主要作用革兰氏阳性菌或阴性菌的称窄谱抗生素，前者如青霉素，后者如多粘菌至少。 由于抗生素可使95%以上由细菌感染而引起的疾病得到控制，因此被广泛应用于家禽、家畜、作物等病害的防治，现已成为治疗传染性疾病的主要药物。抗生素还应用于食品保存，如四环素应用于肉类等的保存，制霉菌素应用于柑桔等的保存。利用四环素能与肿瘤组织结合的特性，可将这种抗生素作为载体以提高抗肿瘤药物的药效。抗生素虽然能有效地防治人类的疾病，但在临床使用上还存在着微生物对抗生素的耐药性问题，如某些地方耐药的金黄色葡萄球菌已达80%～90%，有些用药者对抗生素会产生过敏反应。对于这些问题在临床应用

细胞筛选 一 嘌呤霉素

细胞筛选一嘌呤霉素 (一) 确定最优筛选浓度当用于筛选特定细胞的嘌呤霉素合适浓度未知时,需进行滴定,或制定针对那种细胞的嘌呤霉素杀菌曲线。一般而言,嘌呤霉素浓度范围在2－10微克/毫升时就是足以杀灭大多数未转染的哺乳动物细胞系。１. 培养待转染(而不就是转染后)的细胞。(筛选的目的就是杀灭未转染的细胞) 2、取对数生长期的细胞(一般在铺满培养器皿底部的70％~80%时),用新鲜无抗无血清的培养基制成1、５×１05 个／ml 的细胞悬液。3、向96孔培养板中加细胞悬液,每孔１0０微升(使每孔细胞数在1、5×104个),然后向每孔加新鲜无抗无血清的培养基适量,培养箱中静置培养过夜。(这样做就是为了保证在固定细胞密度下确定最佳Ｇ418药物筛选浓度。) ４.第二天用嘌呤霉素浓度分别为0, ２, 4, 6, 8, 10微克/毫升的新鲜无抗无血清培养基溶液替换各孔中的旧的培养基。(每个浓度可用两个复孔,相当于每个浓度测定三次)。(注意:对于多数细胞种类而言,过量的嘌呤霉素能引起许多非必需的表型的反应。) 5、每日检查细胞活力,根据细胞活力,每三天( 即每隔两天)更换含嘌呤霉素的新鲜无抗无血清培养基溶液一次。如细胞生长过快,可以缩短换液时间(每隔一天)。６.在正常的实验操作规程时,一种细胞最优筛选浓度的确立时间随细胞的生长率与一般生存时间而定,大概需3到１４天。在所需时间之后,嘌呤霉素的导致所有细胞死亡的最小浓度就就是应该用于该细胞与该实验的浓度。最优浓度为在3-5天内杀死所有细胞的浓度。 (二) 转染细胞１. 第一天:在6０ｍm培养皿内种植细胞,细胞密度为能使第二天细胞融合能达到70%－80%的密度,CO2孵箱过夜培养。2、第二天:准备3ml无抗生素无血清培养基,加入Pｏlybrene使其终浓度为8μg/ｍl。将已经制备的病毒颗粒0、５ml加至上述培养基,轻吹混匀。去除60mm培养皿内的旧的培养基,加入含病毒培养基。(Ｐolybrene能够增加病毒感染的效率,然而,有时候Ｐolybrｅne对细胞有毒性。这时,可以用ＰrｏtaminｅSulfate 代替Pｏlyｂrenｅ) (三) 筛选细胞1、病毒感染后24小时,可以换用含最优浓度puｒomyciｎ的培养基。2、如果病毒对细胞有毒性,可以减少感染时间至4-6小时,然后换用新鲜培养基,24-48小时后换加含最优浓度puroｍycin的培养基。最好设立一个对照皿,不加病毒液,加入Pｌoｙｂrene,观察Polyｂｒeｎe就是否对细胞有毒性;如果Pｏｌybreｎe没有毒性,还可以加入pｕromy ｃｉn,作为purｏmｙｃｉn就是否有效的对照。 3. 以后每隔一天换用新鲜含puｒomycin 的无抗生素无血清培养基,以替换含大量死细胞的培养基。直到抗性群落能被识别出(一般就是在筛选后1０到１２天)。4、待抗性细胞长满以后,细胞转入10cｍ培养皿,同时,留一部分细胞在原来的６0mm平皿内。5、60mm平皿内细胞长满后,收获细胞,在蛋白或ｍRＮA水平鉴定基因敲低效率。６、１０cm培养皿内的细胞待长满后传代,首先每种稳定细胞系冻存４-5支细胞,待基因敲低鉴定清楚后,解冻冻存细胞,进行表型观察分析。通常情况下,由于慢病毒为复制缺陷型病毒,受感染的细胞不能产生新的病毒,因此从加入病毒颗粒开始,经过5-6次换液后,培养基内已不存在病毒颗粒,可以移至普通细胞培养室内培养研究。

科研专用嘌呤霉素介绍

嘌呤霉素Puromycin 北京华越洋生物嘌呤霉素Puromycin 作用机制：嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，嘌呤霉素Puromycin通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。嘌呤霉素Puromycin某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。嘌呤霉素Puromycin作为氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。但是嘌呤霉素同A 位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素Puromycin抗性基因：对嘌呤霉素的抗性取决于编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC)的 Pac基因，遗传工程研究使用的Pac基因分离自嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger。 嘌呤霉素Puromycin最普遍应用：1）嘌呤霉素如今普遍应用于筛选和维持培养含Pac基因的哺乳动物稳定转染细胞。嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。2）在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。化学特性：化学名称：3 (a -Amino-p-methoxyhydro cinnamamido)- 3–deoxy- N,N–dimethyladenosine·2HClCAS No.：58-58.2，分子式：C22 H29 N7 O5 .2HCl，分子量：544.43 g/mol纯度：＞98%（HPLC）,易溶于水5-50mg/mL，-20度保存。 嘌呤霉素Puromycin应用浓度：哺乳动物细胞的推荐使用浓度为1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH 值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 嘌呤霉素Puromycin使用步骤：（哺乳动物细胞筛选）

生物嘌呤的知识

生物嘌呤的知识 关于生物嘌呤的知识 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考） （1）24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔 以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含 不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）； （3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞； （4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基； （5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时 间一般在1-4天之间。 （6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内 杀死所用细胞的最低筛选浓度。 嘌呤霉素筛选稳定转染细胞 （1）day0：24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，孵育过夜； （2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲 线确定）的新鲜培养基； （3）day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的 病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。） （4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜； （5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全 培养基。孵育。

（6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基； （7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。 注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的`细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。 储存方法和稳定性： 嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放； 嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。

嘌呤霉素说明书

精选文档 说明：蛋白质合成抑制剂。抑制细菌、藻类原生物和哺乳动物细胞生长。 嘌呤霉素( Puromycin )是由白黑链霉菌( Streptomyces alboniger )发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。作用机制在于嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3'末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。嘌呤霉素同A位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger 内发现的pac 基因编码嘌呤霉素N- 乙酰转移酶(PAC，赋予机体对嘌呤霉素产生抗性。这一特性如今普遍应用于筛选特定携带pac 基因质粒的哺乳动物稳定转染细胞株。 嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac 基因。在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac 基因质粒的大肠杆菌菌株。 溶解性：溶于水，参考浓度50mg/ml。 使用方法 1.建议使用浓度 哺乳动物细胞：1-10卩g/mL最佳浓度需要杀灭曲线来确定； 大肠杆菌：LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125卩 g/mL。注：使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 2.溶解方法 用蒸馏水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/ml的母液，经0.22 叩滤膜过滤除菌后分装于-20C冻存；也可溶于甲醇，配制成10 mg/ml的储存液。 3.嘌呤霉素杀灭曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒转导为例) 嘌呤霉素有效筛选浓度跟细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢情况及细胞 所处细胞周期位置等有关。为了筛选到稳定表达的shRNA细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。建议初次做实验的客户一定要建立适合自身实验体系的杀死曲线( kill curve) 。 1) Day 1：24孔板内以5~8 x 104 cells/ 孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。37C细胞孵育过夜； 精选文档

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结

嘌呤霉素筛选稳定表达细 胞系经验总结 Prepared on 22 November 2020

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考） （1）24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）； （3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞； （4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基； （5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。 （6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。 嘌呤霉素筛选稳定转染细胞 （1）day0：24孔板内以5~8x104cells/孔的密度铺板，孵育过夜； （2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基； （3）day1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。） （4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜； （5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 （6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基； （7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。 注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。 储存方法和稳定性： 嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放； 嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。 Starttoselectonpuromycin(2ug/mlfinalconcentration)',trytouseMo- MLVenvelopexpressingvector,ratherthanVSV/(trytopoolthedifferentpuromycin-resistantcellcoloniestogehter,don'tmakesinglecolonyclone)willbeamplifiedafter10- 14daysselectiononpuromycin.

puromycin 使用

使用步骤：（哺乳动物细胞筛选） ?嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考） 为了筛选到稳定表达待研究shRNA的细胞株，确定杀死未转染/转导细胞的最低浓度嘌呤霉素至关重要。所以初次做实验的客户一定要建立适合自己体系的杀死曲线（kill curve）。 （1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）； （3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞； （4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基； （5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。 （6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。 ?嘌呤霉素筛选稳定转染细胞 （1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜； （2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基； （3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。） （4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜； （5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 （6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基； （7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。 注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。 储存方法和稳定性： 嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放； 嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。 Puromycin（嘌呤霉素）——pac基因筛选抗生素 2013-11-26 17:21 来源：深圳欣博盛生物科技有限公司点击次数：170 关键词：Puromycin invivogen Puromycin是由Streptomyces alboniger（白黑链霉菌）产生的一种肽基核苷抗生素，可抑制原核细胞和真核细胞的肽基转移。Puromycin可抑制革兰氏阳性菌和多种动物细胞和昆虫细胞的增殖，但是真菌和革兰氏阴性菌对Puromycin具有抗性，在一些特殊的情况下，Puromycin 也可用于大肠杆菌。目前，Puromycin最重要的应用是用于选择携带pac抗性基因的转染细胞。 Blasticidin化学特性 CAS号：58-58-2 分子式：C22H29N7O5, 2HCl 分子量：471.51 pKa值：6.8 和7.2 分子结构：

药物微生物

药物微生物 一.药源微生物 药物的来源无外乎化学合成、生物合成，以及化学半合成。 微生物作为天然药物的资源已经完全显露出它的优势： 首先，微生物种类繁多，并且生活环境条件复杂多样，从而使得微生物在生理代谢上和遗传上存在着其他生物类群无法比拟的多多样性，其生活过程中产生的代谢产物也因此多种多样，为我们寻找药物提供了充分的可能性。 其次，微生物生长快速，并且可以进行大规模的工业化生产。 第三，微生物的遗传背景简单，易于利用各种遗传突变手段，改变微生物的代谢途径和调控方式，使得各种微量的药用成分能够大量合成，开发价廉物美的药物 第四，药物的疗效包括两个方面，一是治疗疾病的效果，二是药物的毒性大小。 1.微生物的多样性 细菌真菌藻类植物动物 2.药源微生物 （1）放射菌（链霉菌庆大霉素） （2）细菌 （3）真菌 二.药用微生物 药用微生物通常是指传统中药（汉方药）中的大型药用真菌，如灵芝、虫草等。 三.基因工程菌 基因工程微生物的应用主要要求是：一个适宜外源基因操作的载体系统和一个适宜外源基因活性产物表达的宿主系统。 第二节微生物药物 在医药用微生物中，最重要的是药源微生物。一方面是由于大量的药物来自微生物的天然产物，另一方面，即使是药用微生物，其有效部位也是各种微生物的代谢产物。 一．初级代谢和次级代谢

从表中可以得出次级代谢产物合成的特点：1.次级代谢产物多在细胞生长停止以后合成；2.初级代谢产物可直接或修饰后成为次级代谢产物合成的前体；3.合成反应常包括聚合作用和修饰；4.次级代谢产物分泌胞外；5.合成反应受初级代谢影响，但控制较为间接、松弛，主要受次级代谢自身系统控制。 次级代谢产物可能的合成理由是：1.食物储备；2.拮抗作用；3.次级代谢过程的重要性；4.诱导产生菌的细胞分化；5.诱导其他生物的细胞分化。 将次级代谢系统按如下方式进行分类（1）I 级反应 在这一步反应中，初级代谢物被转化为次级代谢合成的中间体。 这类反应根据其相关的初级代谢途径可以进一步划分，如氨基酸的合成和代谢、核苷酸的代谢、糖的转化或辅酶的合成。（2）II 级反应 这是一类缩合反应，相近的小分子单元被聚合成大分子（1）乙酸-丙二酸单元的缩合（2）氨基酸的缩合 二.次要组分 通常是主要产物的同系物，但是在有些列子中它们会呈现不同的结构类型。 三.微生物药物的定义 微生物药物通常来源于微生物的次级代谢产物，但并不是所有的微生物次级代谢产物都可以作为药物。 抗生素是指能够以低浓度仰制其他微生物生长的低分子量的微生物代谢物。 低分子量的微生物代谢物：指的是在大多数情况下抗生素的相对分子质量为几千以内，而酶以及其他复杂蛋白质分子尽管可能具有抗微生物活性，却不认为是抗生素。 人们所说的抗生素还包括由天然产物经化学修饰后的产物，即半合成抗生素 一个狭义的微生物药物的定义为：微生物在其生命活动过程中产生的能以及低浓度有选择地抑制或影响其他生物机能的低分子量的代谢物。 微生物药物的广义定义为：能以低浓度有选择的抑制或影响其他生物机能的微生物或微生物的代谢。 四.微生物药物的几个相关基本概念 （1）最小抑制浓度 （MIC ）这是药物活性测定常用的参数。 （2）抑制谱 药物能够选择性抑制/影响（即MIC 值较低）的生物或生物分子的范围。抗菌药物的抑制谱是指选择性抑制微生物的范围，抗肿瘤药物的抑制谱是指选择性抑制肿瘤细胞的范围等， （3）药物活性 是指药物对病原体作用的强弱 （4）毒性 药物对宿主生物细胞的抑制或杀死作用，通常半致死剂量（50LD ）表示。 （5）化疗指数 判断一种药物的安全性和有效性的综合指标。 ((= (C CI T 明显疗效的最低给药剂量） 化疗指数）治疗对象对药物不呈明显毒性反应的最大耐受剂量） （6）抑制曲线 药物对作用对象的抑制活性随时间变化的曲线，如抑菌曲线。 （7）药物敏感性 药物对其所作用的对象的抑制活性的高低。 （8）药物的相互作用 不同药物同时存在时，将会对各自的活性产生相互的影响。 五.微生物药物的命名 一般有以下几种命名药物的方法： （1） 根据产生药物的微生物分类命名 如青霉素 链霉素等。 （2） 根据结构类型的特征命名 常常是一族药物，如四环素类药物、氯霉素药物等。 （3） 根据地名或纪念意义而命名 如井冈霉素、土霉素、制霉菌素等。

嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结电子教案

学习资料 仅供学习与参考嘌呤霉素筛选稳定表达细胞系经验总结 嘌呤霉素杀灭曲线的确定（shRNA稳定转染细胞株，仅作参考） （1）24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，铺足够量的孔以进行后续的梯度实验。细胞孵育过夜；（2）准备筛选培养基-含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基（如0-15μg/mL，至少5个梯度）； （3）细胞孵育过夜后加入筛选培养基，孵育细胞； （4）约2-3天更换新鲜的筛选培养基； （5）每日监测细胞观察存活细胞比例。嘌呤霉素的最佳作用时间一般在1-4天之间。 （6）最小的抗生素使用浓度就是指从抗生素筛选开始1-4天内杀死所用细胞的最低筛选浓度。 嘌呤霉素筛选稳定转染细胞 （1）day 0：24孔板内以5~8 x 104 cells/孔的密度铺板，孵育过夜； （2）制备筛选培养基：含有最佳筛选浓度嘌呤霉素（由杀灭曲线确定）的新鲜培养基； （3）day 1：筛选第一天，去除旧的培养基，加入一定量MOI的病毒颗粒；（加入无血清培养基的总量必须充分覆盖住细胞。） （4）病毒转导后约6-8h，再添加1ml完全培养基（血清和双抗，如果已经使用双抗。）到细胞内，然后孵育过夜； （5）病毒转导后48h，使用嘌呤霉素筛选培养基替换旧的完全培养基。孵育。 （6）约每2-3天替换新鲜配制的筛选培养基； （7）每天检测细胞并观察活细胞生长比例，以及turboGFP表达的水平及所占比例。在某一个时间点几乎所用存活细胞都可以表达TurboGFP。嘌呤霉素最佳的作用时间在3-10天之间。 注：病毒的MOI越高，每个细胞含有的shRNA拷贝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素筛选时，需记住越高MOI,含越多pac拷贝的细胞能耐受更高的嘌呤霉素浓度。调整嘌呤霉素的浓度去筛选预定量的转导细胞，但是嘌呤霉素的量不能低于杀死曲线建立的最低浓度。 储存方法和稳定性： 嘌呤霉素稳定性高，可以常温运输，收到产品后4℃存放； 嘌呤霉素在室温条件下可存放3个月，4℃条件下保质期一年。为了达到最理想的稳定状态和最长的保质期，最好存放于-20°C，保质期为2年。 Start to select on puromycin (2 ug/ml final concentration) 3-4 days posttransfection. Massive cell death will be evident after 36-48 hours selection on puromycin. Dependent on the transfection efficiency, most transfection won't establish some puromycin-resistant colonies except that the retrovirus-producing cell lines are used for generating viral vector. If the first generation lentiviral vector is used in the transfection, try to use Mo-MLV envelop expressing vector, rather than VSV/G expressing vector for

嘌呤霉素溶液配制及使用介绍

北京华越洋生物提供QQ:1733351176 嘌呤霉素Puromycin 嘌呤霉素Puromycin 作用机制：嘌呤霉素（Puromycin）是由白黑链霉菌（Streptomyces alboniger）发酵代谢产生的一种氨基糖苷类抗生素，嘌呤霉素Puromycin通过抑制蛋白质合成而杀死革兰氏阳性菌，各种动物和昆虫细胞。嘌呤霉素Puromycin某种特殊情况下有效作用大肠杆菌。嘌呤霉素Puromycin作为氨酰-tRNA分子3’末端的类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸的肽链中。但是嘌呤霉素同A 位点结合后，不会参与随后的任何反应，从而导致蛋白质合成的提前终止并释放出C-末端含有嘌呤霉素的不成熟多肽。 嘌呤霉素Puromycin抗性基因：对嘌呤霉素的抗性取决于编码嘌呤霉素N-乙酰转移酶(PAC)的 Pac基因，遗传工程研究使用的Pac基因分离自嘌呤霉素产生菌Streptomyces alboniger。 嘌呤霉素Puromycin最普遍应用：1）嘌呤霉素如今普遍应用于筛选和维持培养含Pac基因的哺乳动物稳定转染细胞。嘌呤霉素在细胞稳转株筛选中的普遍应用与慢病毒载体的特性有关，现在商业化的慢病毒载体多数都携带pac基因。2）在某些特定情况下，嘌呤霉素亦可以用来筛选转化携带pac基因质粒的大肠杆菌菌株。化学特性：化学名称：3 (a -Amino-p-methoxyhydro cinnamamido)- 3–deoxy- N,N–dimethyladenosine·2HClCAS No.：58-58.2，分子式：C22 H29 N7 O5 .2HCl，分子量：544.43 g/mol纯度：＞98%（HPLC）,易溶于水5-50mg/mL，-20度保存。 嘌呤霉素Puromycin应用浓度：哺乳动物细胞的推荐使用浓度为1-10 μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定。LB琼脂培养基筛选稳定转化pac基因的大肠杆菌，使用浓度为125μg/mL。使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌稳转株需要精确的pH 值调节，而且受宿主细胞本身的影响。 嘌呤霉素Puromycin使用步骤：（哺乳动物细胞筛选）

慢病毒感染protocol

慢病毒载体感染流程（带嘌呤霉素筛选标签） 方案 1.取对数期生长的待感染细胞铺入24孔板，分别设置空白对照孔、对照 慢病毒感染孔、目的基因慢病毒感染孔，37℃孵箱培养至细胞密度为50%－60% ；培养时间在24h之内要达到，否则重新铺3细胞。 技巧，在你算好的细胞体积，按70% 100%（你的计算细胞浓度和体积）130% 铺三种浓度，一般过夜后至少有一组将满足你的要求，省时、省力。 2.取对照慢病毒和目的基因慢病毒，置于冰盒融化，用含10%胎牛血清的 培养液+（24孔板每孔约500μl）稀释病毒原液成所需浓度（最佳MOI 值，因细胞而异），同时加入Polybrene 5μg/m l（增加病毒感染效率），轻轻混匀后，分别加入对照慢病毒感染孔、目的基因慢病毒感染孔，空白对照孔只加入含10%胎牛血清的培养液。 3.轻轻混匀后，37℃细胞培养箱培养12－16小时，使病毒感染细胞； 4.移除含病毒的培养液，更换含10%胎牛血清的培养液+青链霉素，继续 培养48－72小时至细胞密度为90%左右； 5.不带EDTA的胰酶消化细胞下来以后，直接加温浴过的10%胎牛血清的 培养液+青链霉素至24孔板中，连同胰酶一起转移到6孔板，根据细胞类型，贴壁时间不一样，经过3-10h不等，细胞贴壁后移去带胰酶的培养基，加10%胎牛血清的培养液+青链霉素，培养48-72h后。 如果你的慢病毒是带有嘌呤霉素筛选标志，执行以下方案 培养分别在空白对照孔、对照慢病毒感染孔、目的基因慢病毒感染孔加入合适浓度的嘌呤霉素（1ug-2ug/ml终浓度）筛选7－10天后（视情况换液或传代），可见空白对照孔的细胞均已死亡；对照慢病毒感染孔和目的基因慢病毒感染孔仍有一定比例的细胞存活，这些存活的细胞即为稳定感染株。 用含1μg/m l嘌呤霉素（维持筛选压力）的培养液扩增稳定感染株细胞，冻存或用于后续研究。 附：嘌呤霉素筛选浓度的获得