基于测序的微生物多样性分析总结
基于二代高通量测序的环境微生物多样性分析
一般认为土壤、海洋、肠道等生态系统中的微生物数量繁多、种类多样。传统的培养方法只限于对环境样品中极少部分（0.1%-1%）可培养的微生物类群的研究，而变性梯度凝胶电泳（DGGE）、克隆文库等常规的分子生物学方法也因操作复杂、成本高、痕量菌发现困难等因素无法达到深入分析环境微生物多样性的目的。高通量测序技术的出现，极大的促进了对环境中不可培养微生物以及痕量菌的研究，为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。
微生物群落中物种的多样性依然是目前研究的重点。对群落结构的研究，将有助于了解种群结构的稳定性，进而了解种群内物种间的相互依赖、相互制约的内在联系，为将来构建功能性种群服务。鉴于微生物群落是一个多物种的集合体，其中高达95%以上的微生物物种无法分离也不能独立培养，拼装出每个独立个体的基因组现在也无法实现，细菌16S 或真菌ITS测序分析依然是现阶段微生物群落多样性和多态性分析的基石。
一、高通量测序背景介绍
高通量测序技术，可以一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，使得对PCR扩增产物直接进行序列测定成为可能。极大的促进了对环境中不可培养微生物以及痕量菌的研究，为环境微生物多样性的研究开启了新的研究热潮。目前高通量测序的主要平台代表有Illumina公司的Solexa基因组分析仪（Illumina Genome Analyzer）、罗氏公司(Roche)的454测序仪（Roch GS FLX sequencer）和ABI的SOLiD测序仪（ABI SOLiD sequencer）。微生物多样性分析中，以Illumina 及454测序平台应用最为广泛。
二、工作流程
1 PCR引物的设计
2 PCR扩增条件摸索
3琼脂糖凝胶电泳检测结果
4 全部样品进行PCR
5 PCR产物的凝胶回收及检测
6 PCR产物精确定量（Qubit 2.0 ）
将纯化后的PCR产物采用微量荧光核酸定量仪进行精确定量（精确到0.1ng/ul）
7. 将定量后混匀的DNA样本再次进行磁珠法纯化后，进行高通量测序
三、可分析项目
1)有效序列数据统计
在测序实验中，通常采用多个样品平行测序的方法，即多个样品混合测序。为了能区分样品，各样品中的序列均引入了一段标示其样本来源信息的barcode标签序列。若所测序列中不含有barcode 标签序列，则无法确定其样本来源，进而导致后续生物信息错误或意义不明。因此，仅当原始序列中含有完整的barcode 标签序列时，该条序列才被认可为有效序列。
2）优化序列数据统计
通常情况下，有效序列可以直接用于后续生物信息学分析。在实验过程中，测序产物可能含有非特异性扩增片段，利用特异性引物信息可以将其去除；序列中可能含有模糊碱基（ambiguous）、单碱基高重复区（homologous ）以，长度过短的序列(序列长度小于200bp)，及PCR过程中产生的一些嵌合体，将这些序列纳入分析范围会降低分析质量，因此修剪、去除（trim）此部分序列，可得到供精准分析的优化序列。在数据去除（trim）时，把maxambig=0，axhomop=8，maxlength=200，及其嵌合体序列去掉，并对数据进行统计，得到优化序列的百分率。
3) OTU生成
根据序列的相似性，将序列归为多个OTU（操作分类单元），以便后续分析。OTU （Operational Taxonomic Units）是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。在生物信息分析中，一般来说，测序得到的每一条序列来自一个菌。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就需要对序列进行归类操作（cluster）。通过归类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，一个小组就是一个OTU。根据客户指定的相似度（96%、97%或者98%），对所有序列进行OTU 划分并进行生物信息统计分析。
OTU 分析主要步骤
(1) 提取非重复序列，碱基完全一致序列为重复序列；
(2) 与silva库中的aligned(16S/18S, SSU)核糖体序列比对；
(3) Chimeric 序列检测与去除
(4) 距离计算与OTU 聚类。
4) 多样性分析（Alpha-diversity）
计算菌群丰度（Community richness）的指数有：
（1）Chao：是用chao1 算法估计群落中含OTU 数目的指数，chao1 在生态学中常用来估计物种总数，由Chao (1984) 最早提出。
（2）Ace：用来估计群落中含有OTU 数目的指数，由Chao 提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一，与Chao I 的算法不同。
计算菌群多样性（Community diversity）的指数有：
（1）Simpson：用来估算样品中微生物的多样性指数之一，由Edward HughSimpson (1949) 提出，在生态学中常用来定量的描述一个区域的生物多样性。Simpson 指数值越大，说明群落多样性越低。
（2）Shannon：用来估算样品中微生物的多样性指数之一。它与Simpson多样性指数均为常用的反映alpha多样性的指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。
测序深度指数有：
Coverage：是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。
使用软件：mothur及BioLinker自编程序。
5) 稀释性曲线（Rarefaction curve）
稀释性曲线：一般是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计出这些个体所代表物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线。它可以用来比较测序数量不同的样本物种的丰富度，也可以用来说明样本的取样大小是否合理。分析采用对优化序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建稀释性曲线。稀释性曲线图中，当曲线趋向平坦时，说明取样的数量合理，更多的取样只会产生少量新的OTU，反之则表明继续取样还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可以得出样品的取样深度情况。
稀释性曲线分析结果默认是在97%相似性水平下划分OUT并制作各样品的稀疏曲线。
6) 分类学分析（Taxonomy）
在之前的分析步骤中，已经将序列按照其自身的碱基组成的相似性，分归到各OTU 中。在进行分类学分析时，首先，将每一条优质序列都与SILV A（最新版）数据库进行比对，找出其最相近且可信度达80%以上的种属信息。之后，将每一个OTU 中的所有序列进行类比，找出同一OTU 中的不同序列的最近祖先的种属信息。最后，将得到的结果记录在表格文件中。这样做，可以在保留最可能多的信息量的情况下，确保得出信息的准确性。
7) 样本间比较
各样品群落结构分析柱状图或者饼状图
在某一分类地位上根据各样品中的微生物组成绘制饼图或者柱状图。
8) 全样品相似度分析树状图
比较多个样品中OTU组成的差异及各OTU中含有序列的丰度，计算这些样品的相似性，并绘制相似性图谱。
9) 样品OTU分布比较-VENN图
统计多个样品中所共有的OTU 数目可以反映环境样品的相似性及重叠情况。10) Heatmap热图分析
Heatmap可以用颜色变化来反映二维矩阵或表格中的数据信息，它可以直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来。常根据需要将数据进行聚类，将聚类后的数据表示在heatmap的相似性和差异性。如在属水平上对样品和OTU 类型（样品所含菌属）进行聚类（依据是不同样品中各OTU 所含序列数越相近，即所含菌属数量越相近，样品间相似性越高），对聚类后各样品中不同OTU（不同菌属）所含序列的丰度作heatmap图，能够反映出在菌属水平上各样品菌落结构的相似性和差异性。将指定种属水平上的分类信息分别按照样品和分类进行聚类后作出Heatmap图，能够反映出所有样品在各分类水平上表现的相似性或者差异性。
11) 组间显著性差异分析（metastats分析）
分析多个样品时，如果这些样品分属于两个组，则可以进行Metastats分析。该分析通过对比两组条件下的多个样品，找出两组中具有显著差异的微生物类型。结果如下表所示：
12) PCA分析(Principal Component Analysis)
PCA 分析，即主成分分析，是一种对数据进行简化分析的技术，这种方法可以有效的找出数据中最“主要”的元素和结构，去除噪音和冗余，将原有的复杂数
据降维，揭示隐藏在复杂数据背后的简单结构。它的优点是简单，而且无参数限制，可以方便的应用于各个场合。我们可以用PCA 来分析不同样品OTU组成的差异，通过方差分解，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够最大反映方差值的两个特征值。如样品组成越相似，反映在PCA图中的距离越近。不同环境间的样品可能表现出分散分布。PCA 分析可以用来反映不同样品中微生物群落组成的相似性以及影响微生物多样性的主要因素，一般情况下是用来对假设进行验证。
如PCA 可以用来做以下分析：
确定环境中的样品是否具有显著不同的微生物群落。将环境间的差异以图的形式表现出来等。
13) RDA分析
利用冗余分析（RDA）可以反映在OTU的水平或者某生物学分类水平上各样品中菌群与环境因子之间关系。
14) UniFrac分析
选取一个组的多个样品或者不同组的样品，进行Weighted unifracPCoA分析或者unweightedunifracPCoA分析，可以在OTU的水平上反映各样品间或者不同组间微生物群落结构的差异。
15) 进化树分析
挑选各样品丰度≥0.1%的OUT的代表序列，构建系统发育树。
16) 微生物种类分级进化树分析
以样本所得genus菌种信息为源数据，对其进行微生物的分级进化树分析，图中不同的颜色对应不同的样本，饼图的面积代表序列数目的多少，最后一个级别的饼图代表每个genus水平的序列数目，前一个级别饼图的大小为后面相应物种信息序列数目的汇总，所以级别越高，饼图的面积就会越大。
高通量测序：环境微生物群落多样性分析
(5)高通量测序：环境微生物群落多样性分析 微生物群落多样性的基本概念 环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究 热点。长期以来，由于受到技术限制，对微生物群落结构和多样性的认识还不全面， 对微生物功能及代谢机理方面了解的也很少。但随着高通量测序、基因芯片等新技术 的不断更新，微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。第二代高通量 测序技术（尤其 是Roche 454高通量测序技术）的成熟和普及，使我们能够对环境微生物进行深度测序，灵 敏地探测出环境微生物群落结构随外界环境的改变而发生的极其微弱的变化，对于我 们研究微生物与环境的关系、环境治理和微生物资源的利用以及人类医疗健康有着重 要的理论和现实意义。 在国内，微生物多样性的研究涉及农业、土壤、林业、海洋、矿井、人体医学等诸多领域。以在医疗领域的应用为例，通 过比较正常和疾病状态下或疾病不同进程中人体微生物群落的结构和功能变化，可以 对正常人群与某些疾病患者体内的微生物群体多样性进行比较分析，研究获得人体微 生物群
落变化同疾病之间的关系；通过深度测序还可以快速地发现和检测常见病原及新发传 染病病原微生物。研究方法进展 环境微生物多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看大致上包括以下四 类：传统的微生物平板纯培养方法、微平板分析方法、磷脂脂肪酸法以及分子生物学 方法等等。 近几年，随着分子生物学的发展，尤其是高通量测序技术的研发及应用，为微生物分 子生态学的研究策略注入了新的力量。 目前用于研究微生物多样性的分子生物学技术主要包 括:DGGE/TGGE/TTGE 、 T-RFLP 、SSCP、FISH 、印记杂交、定量 PCR、基因芯片等。 DGGE 等分子指纹图谱技术，在其实验结果中往往只含有数十条条带，只能反映出样品中少数 优势菌的信息；另一方面，由于分辨率的误差，部分电泳条带中可能包含不只一种 16S rDNA 序列，因此要获悉电泳图谱中具体的菌种信息，还需 对每一条带构建克隆文库，并筛选克隆进行测序，此实验操 作相对繁琐；此外，采用这种方法无法对样品中的微生物做 到绝对定量。生物芯片是通过固定在芯片上的探针来获得微
导学案(教师版)探究土壤微生物的分解作用
班级 小组 姓名 评价等级 沅江三中四环八步教学模式 生物模块三导学案 第1页（共6页） 探究土壤微生物的分解作用(教师版) 【学习目标】 1.设计和进行对照实验，尝试探究土壤微生物的分解作用，进一步培养探究和创造能力。 2.分析土壤微生物分解淀粉的情况。 3.学会检测淀粉和还原糖的方法，并根据现象作出合理判断和解释。 案例1: 探究土壤微生物对落叶的作用 一、提出问题: 秋天，落叶纷飞。春天，绿草如茵。且不见落叶痕迹！落叶去哪里了？ 结合上面的实例，你能提出什么问题呢？请写下来。 落叶在土壤中能被分解掉,这究竟主要是土壤的物理化学因素的作用,还是土壤中微生物的作用呢 ？ 注意: （1）要选择有研究意义的问题作为课题来研究 （2）要选择我们能力范围之内的问题作为实验研究课题。 二、作出假设: 落叶是在土壤微生物的作用下腐烂的 提示:假设既可以是基于已有的知识或经验作出的解释,也可以是想像或猜测。 三、设计实验 1、设计方案 （1）实验原理: 微生物能分泌多种水解酶将大分子有机物分解成小分子有机物，如纤维素酶、淀粉酶可将纤维素、淀粉水解成葡萄糖。然后被分解者吸收到细胞中进行氧化分解，最终形成CO2、水和各种无机盐，同时释放能量。 （2）、实验材料: 土壤、落叶、 （3）、实验器具: 玻璃容器、标签、塑料d 袋、恒温箱、纱布。 （4）、实验设计步骤: ①取两个圆柱形的玻璃容器,一个贴上“甲组”标签,另一个贴上“乙组”标签。 ②将准备好的土壤分别放入两个玻璃容器中,将其中乙组放入恒温箱, 60℃灭菌1h 。 ③取 大小、形态相同的落叶12片,分成2份,分别用包好,埋入2个容器中,深度约5cm 。 ④将2 个容器放于实验室相同的环境中, 一段时间后,取纱布包。 ⑤观察比较对照组与实验组落叶的 腐烂程度。 提示: （1）要确定实验变量是什么 需要控制的变量有哪些如何控制这些变量 ； （2）要注意实验步骤的先后顺序。 （3）要注意写出具体的实验步骤以便指导实验的进行。
土壤微生物的分类、多样性及作用 王悦 1521011188
土壤微生物的分类及作用 摘要：土壤是生态系统中岩石圈、大气圈、水圈和生物圈的交界面，而土壤微生物分布广、数量大、种类多，是土壤的重要组成部分，也是土壤生物中最活跃的部分。其在地球生境中数量最多、生物多样性最复杂、生物量最大。土壤微生物能够参与土壤有机质的分解、腐殖质的合成、养分的转化和推动土壤的发育和形成，同时它也是土壤肥力水平的活性指标。因此研究土壤微生物的分类、多样性以及其在土壤中的作用有重要意义。 关键词：土壤微生物分类；土壤微生物多样性；土壤微生物作用 Abstract:The soil is the interface of lithosphere, atmosphere, hydrosphere, and biosphere in the ecosystem.There are many kinds of soil microbial,their havel wide distribution and large quantity and, they are an important component of the soil, as well as the most active part of soil organisms. In the earth's habitats, their biodiversity is the most complex and the biomass is the largest. Soil microorganisms can participate in soil organic matter decomposition, synthesis of humus, nutrient transformation and promote the development and form of the soil, it is also the activity indicators of soil fertility level .So research the classification, the diversity of soil microorganisms and its role in the soil have important significance. Key words: the classification of soil microorganisms, the diversity of soil microorganisms, the role of soil microorganisms. 1 引言 土壤微生物是从19世纪中叶发展起来的一支生命科学的分支学科[1]，这时学术界己经将土壤内部的三大过程(土壤有机质的分解、硝化和固氮作用)清晰界定为生物过程，对这些土壤内部过程的机理探索直接催生了土壤微生物学，并导致20世纪初土壤微生物学的空前繁荣。土壤微生物是土壤生物的重要组成部分，参与了土壤发生、发展和发育的全过程。其群落结构组成和生物量等可以反映土壤的肥力状况。土壤微生物可以分解土壤有机质和促进腐殖质形成，吸收、固定并释放养分, 对植物营养状况的改善和调节有重要作用。有些微生物可以和植物形成共生系统，促进植物的生长发育。同时土壤微生物在降解土壤污染物方面也有重要作用。 2 土壤微生物的组成及分类[2] 土壤微生物的生物量通常以生物量碳表示。它是指土壤中体积小于5x103um3的生物总量，包括细菌、放线菌、真菌和小型动物，不包括植物根系。测量土壤微生物生物量的方法包括传统镜检法、成分分析法、底物诱导呼吸法和熏蒸法。 土壤微生物按形态可以分为真核微生物，原核微生物和分子微生物。其中真核微生物包括真菌和藻类。原核微生物有细菌、放线菌和蓝细菌。分子生物则无
微生物学[第十三章微生物物种的多样性]山东大学期末考试知识点复习
第十三章微生物物种的多样性 一、要点提示 1．生物的多样性系指遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性。由于微生物具有与高等动植物迥然不同的特点，使微生物在营养类型、呼吸类型、代谢类型3方面也呈现出丰富的多样性。 2．长期以来人们对细菌的认识仅从形态结构、生理生化、免疫学特性、生态分布进行区分。由于分子生物学方法的建立和发展，特别是16S rRNA寡核苷酸的序列分析，改变或修正了对细菌人为地传统分类的概念，进入了细菌系统发育和自然进化的研究阶段。按照Woese的观点，真细菌占据自然界生物三大域中的一个域，即：细菌域。在确认了16S rRNA中标志性的寡核苷酸保守序列后，真细菌被划分为12个独特的类群。每个类群可以看成是独立的门，它包括了《伯杰系统细菌学手册》中所描述的23个门的细菌。腐生型的细菌在自然界中碳、氮、硫、磷4种元素的循环和能量流动中起着不可替代的作用；一些种是动、植物和人的致病菌，与动、植物的生长和人体健康密切相关；一些具有特殊形态，如具附属物或鞘的细菌，产子实体的黏细菌等，它们的存在丰富了微生物物种的多样性。 3．古生菌是极端环境微生物，它们在形态结构、营养代谢、生理特性、遗传物质及生态分布等方面与真细菌具有十分明显的差异。16S rRNA寡核苷酸序列分析表明它们是生物总系统发育中一个重要的域，包括：产甲烷古生菌、极端嗜热S0代谢菌、极端嗜盐古生菌、无细胞壁的热原体和还原硫酸盐古生菌5个类群。古生菌的发现为人们利用古生菌中的嗜热酶(例如：Taq、Pfu DNA聚合酶)、产甲烷辅酶及其他参与碳、氮物质代谢的酶类，进行分子生物学研究和进行酶法水解、酶法转化制取有用产品提供了丰富的微生物资源。另外，对古生菌嗜热、嗜酸、厌氧、耐高盐、产甲烷、还原硫酸盐及光介导ATP合成的研究，为探索地球上早期原始生命的起源，提供了有力的佐证。 4．生物的共同祖先沿着真细菌、古生菌、真核生物3条路线进化。目前认
微生物多样性研究—β多样性分析概述
微生物多样研究中的—β多样性分析概述
一、β-多样性分析介绍 1. β（Beta）Diversity： 是对不同样品/不同组间样品的微生物群落构成进行比较分析。 ?β多样性分析前的数据“来源”： 1）OTUs的丰度信息表； 2）OTUs之间的系统发生关系， 计算Unweighted Unifrac及Weighted Unifrac距离。 ?通过多变量统计学方法主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)，主坐标分析(PCoA，Principal Co-ordinates Analysis)，非加权组平均聚类分析(UPGMA，Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Means)等分析方法，从中发现不同样品（组）间的差异。
2. PCA & PCoA分析 ?主成分分析（PCA）是多变量统计学中最为人熟知的分析方法，它通过线性变换，将原始的高维数据投影至少量新合成的变量（即主成分），从而简化数据结构，展现样品的自然分布。 ?主成分分析不考虑原始变量之间可能存在的相互关系，并且是基于欧式距离评价样品之间的相似度。 ?多维尺度分析与主成分分析类似，但是它可以采用任何距离评价样品之间的相似度。主坐标分析（Principal coordinates analysis，PCoA）是经典的多维尺度分析方法。
3.UniFrac距离 ?由于微生物极其多样，不同微生物彼此之间的系统发育关系往往千差万别，仅仅将群落中不同微生物成员视为相互独立的变量显然并不合理。 ?因此，在比较不同群落样品之间的差异时，需要考虑两个群落成员之间的系统发育关系是否相似。 ?基于这个思想，计算微生物群落样品间距离的UniFrac距离应运而生，通过比较两个群落各自独有的微生物成员之间系统发育关系的远近，更为客观地反映两个群落样品之间的相似程度。
中国微生物物种多样性研究进展_郭良栋.
生物多样性 2012, 20 (5): 572–580 Doi: 10.3724/SP.J.1003.2012.10129 Biodiversity Science http: //https://www.wendangku.net/doc/646177573.html, —————————————————— 收稿日期: 2012-06-13; 接受日期: 2012-08-10 基金项目: 国家自然科学基金重点项目(30930005) ? 通讯作者 Author for correspondence. E-mail: guold@https://www.wendangku.net/doc/646177573.html, 中国微生物物种多样性研究进展 郭良栋* (中国科学院微生物研究所真菌学国家重点实验室, 北京 100101) 摘要: 微生物是分布最为广泛的生命形式, 几乎分布到地球上的所有生境, 具有丰富的物种多样性。我国地域辽阔, 跨越热带至寒温带, 气候条件多样, 地理环境与生态系统类型复杂, 是世界上生物多样性最丰富的国家之一。我国已开展了大量微生物多样性研究, 并证实我国多样的生境蕴藏着丰富的微生物物种多样性。目前我国已报道真核微生物(菌物)约14,700种, 其中包括真菌约14,060种、卵菌约300种、黏菌约340种, 而真菌中有药用菌473种、食用菌966个分类单元。特别是近年来通过免培养的分子生物学技术发现我国存在丰富的原核微生物多样性。本文概述了传统方法和现代分子生物学技术在我国原核微生物(古菌、细菌)和真核微生物(真菌、卵菌、黏菌)物种多样性研究的最新进展。 关键词: 真核微生物, 原核微生物, 物种多样性, 培养方法, 分子技术 Progress of microbial species diversity research in China Liangdong Guo * State Key Laboratory of Mycology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101 Abstract: Microbes with rich species and genetic diversity are widely distributed throughout various habitats in the world. China possesses a variety of climate zones, geographic environments, and complex ecosystems, which play a large role shaping the complex biodiversity of this country. Microbial diversity has been widely studied and well documented by Chinese scientists. For example, a total of ca. 14,700 eukaryotic microbe species have been recorded, including ca. 14,060 fungi, ca. 300 oomycetes, and ca. 340 slime molds. Within the Fungi, there have been 473 medicinal fungal species and 966 edible fungal taxa recorded. However, re-cent studies have documented much high species diversity of prokaryotic microbes using molecular tech-niques, which have greatly promoted the study level of microbial diversity in China. This review paper sum-marizes recent research progress of microbial (i.e., archaea, bacteria, fungi, oomycetes, and slime molds) di-versity in China based on traditional and molecular techniques. Key words: eukaryotic microbe, prokaryotic microbe, species diversity, cultivation method, molecular technique 微生物是分布最为广泛的生命形式, 几乎分布到地球上的所有生境, 可利用各种有机化合物、无机盐等作为能源, 在有氧或无氧条件下, 在寒冷的极地、高达100℃的热泉或高盐碱度等极端环境中生活。微生物具有丰富的物种和遗传多样性, 并以高度的变异性适应不同的生境。作为生态系统中的重要组分, 微生物在自然界的物质与能量循环、生态系统的演替以及生物多样性的维持中发挥重要的生态功能。微生物与人类的生活休戚相关, 在直 接或间接地为人类提供了极其丰富的物质资源的同时, 也为人类带来了巨大危害。 Woese 和Fox(1977)以核糖体RNA(rRNA)的小亚基(原核生物的16S 、真核生物的18S 基因)序列为依据, 提出了独立于真细菌(Eubacteria)和真核生物(Urkaryotes)之外的第三种生命形式——古菌(Archaea), 认为它和真核生物以及真细菌是从一个具有原始遗传机制的共同祖先分别进化而来。随后Woese 等(1990)提出了三域(Domain)分类系统, 将
微生物的生物多样性简介
微生物的生物多样性简介 微生物是地球上生物多样性最为丰富的资源。微生物的种类仅次于昆虫，是生命世界里的第二大类群。然而由于微生物的微观性，以及研究手段的限制，许多微生物的种群还不能分离培养，其已知种占估计种的比例仍很小。从下面的两张统计表中可以看出。 中国微生物已知物种数与世界已知物种数的比较 微生物的已知种数和估计总种数
微生物是生物中一群重要的分解代谢类群，没有微生物的活动地球上的生命是不可能存在的。它们是地球上最早出现的生命形式，其生物多样性在维持生物圈和为人类提供广泛而大量的未开发资源方面起着主要的作用。 微生物的多样性包括所有微生物的生命形式、生态系统和生态过程以及有关微生物在遗传、分类和生态系统水平上的知识概念。 物种是生物多样性的表现形式，与其它生物类群相比，人类对微生物物种多样性的了解最为贫乏。以原核生物界为例，除少数可以引起人类、家畜和农作物疾病的物种外，对其它物种知之甚少。人们甚至不能对世界上究竟存在多少种原核生物作出大概的估计。真菌是与人类关系比较密切的生物类群，目前已定名的真菌约有8万种，但据估计地球上真菌的数量约为150万种，也就是说人们已经知道的真菌仅为估计数的5％。 微生物的多样性除物种多样性外，还包括生理类群多样性、生态类型多样性和遗传多样性。 微生物的生理代谢类型之多，是动植物所不及的。微生物有着许多独特的代谢方式，如自养细菌的化能合成作用、厌氧生活、不释放氧的光合作用、生物固氮作用、对复杂有机物的生物转化能力、分解氰、酚、多氯联苯等有毒物质的能力，抵抗热、冷、酸、碱、高渗、高压、高辐射剂量等极端环境的能力，以及病毒的以非细胞形态生存的能力等。微生物产生的代谢产物种类多，仅大肠杆菌一
土壤微生物研究土壤采集方法
土壤微生物研究规范——II. 土壤样品的运输和贮存 1. 土壤微生物样品的运输 土样从采集点到实验室往往需要经历一定时间的运输，土样运输过程中难免影响土壤的温度、水分、氧气等环境条件，所以要尽快置于黑暗、低温（4℃）的密闭环境，尽量维持土壤含水量稳定不变，黑暗环境是为了避免光照下藻类在土壤表明的生长，低温是为了减少细菌繁殖，维持微生物区系稳定。一般装于聚乙烯袋子，并松扎。另外，储存时尽可能避免物理压实，样品袋不要堆叠过多，以免破坏土壤原有的团粒结构，并导致底层样品处于厌氧环境。 微生物取样的土壤样品需要在0-4℃的条件下保存，所以土壤样品应及时保存在保温箱或冰箱中（设置0-4℃），并最好在一周内完成前期处理。 如果采集地有冰箱、熏蒸所需的真空干燥器和通风橱等设施，建议将微生物土壤样品熏蒸浸提后，以冷冻的浸提液保存在塑料小瓶中，以方便运送。 如果采集地没有通风橱等设施，建议将所取的土壤样品过筛后冷藏在保温箱中，以方便运送。具体的流程如下： （1）提前准备好保温箱及冷冻好的冰板。冰板需要提前1-2 d冷冻，可以再用自封袋装一定量水分放平冷冻为规则的冰块备用。 （2）按照微生物取样规范进行取样，及时过筛去除根系、土壤动物等杂质，放置在0-4℃保鲜冰箱中保存。用于DNA或RNA分析的土壤样品应用干冰速冻。用于RNA分析的土壤样品在运输过程中应用干冰保持低温。用于DNA分析的土壤样品应用冰盒运输，也可用干冰。 （3）运输当天将土壤样品密封好，放入保温箱中，保温箱底部、四周及顶部均放置冰板和用自封袋密封的冰块，保证样品四周均可接触冰板或冰块。注意保证土壤样品和冰块分别密封，以防路途中融化的水分进入土壤样品造成污染。 （4）到达目的地后，迅速将样品放入保鲜冰箱（0-4℃）保存待测。 如果采样地条件允许，可以根据规范上的实验方法，将样品熏蒸、浸提后保存在塑料小方瓶中，-20℃冷冻，然后再按照上述流程放置保温箱中运送到目的地，迅速放置在冷冻冰箱中（-20℃）保存待测。 如果购买不到保温箱，可以选用运输水果、蔬菜等的白色泡沫箱，密封严实后亦可。由于泡沫箱保温效果可能不及保温箱，路途较远时应多放置冰板及冰块，途中尽量不要打开，放入及取出都要及时，且需要提前确认样品采集地和目的地
微生物之微生物多样性分析-DGGE
变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE） 普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳只能通过片段大小不同在同一浓度的胶上电泳迁移率不同而分离不同的DNA片段，对于片段大小接近或相同的DNA片段无法做到有效地分离；DGGE(denaturing gradient gel electrophoresis) 即变性梯度凝胶电泳，是利用DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的DNA片段分开。 DGGE作为一种成熟的分子生物学技术被广泛应用于环境科学（土壤、海洋、河流、冰川、淤泥等）、医学（各种疾病治疗前后，病变部位微生物的差异）、人体（鼻咽、口腔、黏膜、肠道）等领域进行微生物多样性分析。 实验流程图： 实验结果 实验结果包括以下内容 1 引物设计 以下是DGGE中常用的引物，我们将根据客户的不同需求，进行针对性的引物设计。 引物序列（5’-3’）
细菌 16S V3 区扩 增引物 357-F-GC CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG 518r ATTACCGCGGCTGCTGG 引物 序列（5’-3’） 真核 18S V1-3区扩增引物 Euk1A CTGGTTGATCCTGCCAG EukA516r-GC CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGACCAGACTTGCCCTCC 2 基因组DNA 抽提电泳检测图 针对客户的样本来源不同，我们针对性优化不同的基因组抽提方法，已达到提取效果最佳。 说明：1-8为样本所抽提基因组DNA，上样量3uL；M 为1kb Marker 上数第一条带为8 kb，中间的亮带为3kb，浓度为30ng/uL，其余为10 ng/uL。 3 目的片段PCR 检测 说明：1-8为样本，负为负对照（说明我们的实验没有污染，这对分子实验是至关重要的），上样量为5uL；M 为DL2000 Marker，上样量3uL。其中亮带为20ng/uL，其余为10 ng/uL。 Reconditioning PCR： 第一轮PCR 产物将会作为新的模板再进行少数循环的第二轮PCR 扩增，这叫做“Reconditioning PCR”。由于在“ Reconditioning PCR”的过程中引物和模板之
土壤微生物测定指标的分析方法和适用范围
土壤微生物监测常规测定指标的分析方法和适用范围
其他方法： 一、土壤DNA提取和纯化： 方案1，参考(1, 2) 1.称取样品土样5g, 加入灭菌的石英砂，液氮研磨；
不要液氮研磨，这样子对DNA伤害很大，几乎全部片段化了。可以加上PBS洗涤下土壤，一是能够去除些杂质，二是能够使得土壤处于悬浮状态，然后可以在涡旋仪上剧烈涡旋2－3min，使得土壤颗粒破碎。然后12000rpm离心5min，弃上清。 2.加入1 3.5mL的DNA提取Buffer，100微升20mg/mL蛋白酶K，37℃225rpm摇30min-2h 3.加入700微升20%SDS，65℃水浴2h,间隔15min颠倒摇匀数次； 4.6000rpm室温离心15min,收集中间液相层；向沉淀中加入3mLDNA提取液，300微升20%SDS，65℃水浴30min，同上离心，收集中间液相层，合并；重复一次；可考虑再 增加抽提一次。或者用5mL而不是3mL。最后实在装不下了可以分在两个50mL离心管里面离心。 5.向收集的液相层中加入等体积氯仿：异戊醇（24：1）抽提一次，8000rpm离心10min，收集上部液相层； 6.第5步收集液相层中加入0.1倍体积的乙酸钠，0.6倍体积的异丙醇，4℃过夜沉淀； 这个千万不要4度过夜啊，四度过夜你会发现很多的絮状悬浮物，我之前犯过类似错误，这个是SDS和高浓度的盐在低温条件下析出来了。室温放置1－2h就好。 7.过夜沉淀物12000rpm离心15min，弃上清；向沉淀中加入10mL冷乙醇洗涤，12000rpm离心5min，弃上清；12000rpm离心30sec，移液枪析出残留液体； 8.室温自然干燥沉淀，干燥后向沉淀中加入400微升TE溶解。 方案2： 购买DNA提取试剂盒，如SoilMaster DNA Extraction Kit (Epicenter) 或UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MO BIO) 二、DNA定量和质量检测： 提取后的DNA使用紫外分光光度法进行浓度和纯度检测。DNA纯度以OD260/ OD280比值来反映。当OD60 /OD80比值<1.8时，说明样品存在蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用乙醚抽提去除残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE悬浮后再测定。当OD60/OD280比值>2.0，说明样品存在RNA污染，可以用RNA酶处理样品去处RNA 。和定量，应用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA大小及完整度。 三、土壤宏基因组测序 将质检合格的土壤DNA随机打断，加接头序列构建测序文库，利用Roche 454或Illumina Hiseq系统进行测序反应。 四、生物信息分析： 1.原始数据整理、过滤及质量评估： 应用中科院青能所自主开发的质量控制软件QC-Chain进行原始测序数据的质量控制，去除低质量碱基和read，并进行污染序列的监控(3)。
土壤微生物群落多样性研究方法及进展_1
第27卷增刊V ol 127,Sup 1广西农业生物科学Journal o f Guangx i A g ric 1and Biol 1Science 2008年6月June,2008 收稿日期:20080122。 基金项目:广西大学博士启动基金项目(X05119)。 作者简介:姚晓华(广西大学副教授,博士;E -mail:x hy ao@g xu 1edu 1cn 。文章编号:10083464(2008)增008405 土壤微生物群落多样性研究方法及进展 姚晓华 (广西大学农学院,广西南宁530005) 摘要:微生物多样性是指群落中的微生物种群类型和数量、种的丰度和均度以及种的分布情况。研究 土壤微生物群落多样性的方法包括传统的以生化技术为基础的方法(直接平板计数、单碳源利用模式等) 和以现代分子生物技术为基础的方法(从土壤中提取DN A ,进行G+C%含量的分析,或杂交分析,或进 行PCR,产物再进行D GGE/T GG E 等分析)。现代生物技术与传统微生物研究方法的结合使用,为更全面 地理解土壤微生物群落的多样性和生态功能提供了良好的前景。 关键词:微生物多样性;生化技术;分子生物学技术;DN A 中图分类号:.Q 938115 文献标识码:A Advancement of methods in studying soil microbial diversity YAO Xiao -hua (Co llege of Ag ricultur e,G uangx i U niv ersit y,N anning 530005,China) Abstract:Species div ersity consist o f species richness,the total number of species,species ev enness,and the distribution of species 1Methods to measure microbial diversity in so il can be categ orized into tw o g roups:biochemica-l based techniques and m olecular -based techniques 1The fo rmer techniques include plate counts,sole carbon so urce utilizatio n patterns,fatty acid methy l ester analysis,and et al 1The latter techniques include G +C%,DNA reassociation,DNA -DNA hy br idization,DGGE/TGGC,and et al 1Ov er all,the best w ay to study soil microbial diversity w o uld be to use a variety of tests w ith differ ent endpoints and degr ees o f r esolutio n to o btain the bro adest picture possible and the most inform ation r eg ar ding the microbial co mmunity 1 Key words:microbial diversity;biochem ica-l based techniques,mo lecular -based techniques,DNA 微生物多样性研究是微生物生态学最重要的研究内容之一。微生物在土壤中普遍存在,对环境条件的变化反应敏捷,它能较早地预测土壤养分及环境质量的变化过程,被认为是最有潜力的敏感性生物指标之一[1] 。但土壤微生物的种类庞大,使得有关微生物区系的分析工作十分耗时费力。因此,微生物群落结构的研究主要通过微生物生态学的方法来完成,即通过描述微生物群落的稳定性、微生物群落生态学机理以及自然或人为干扰对群落产生的影响,揭示土壤质量与微生物数量和活性之间的关系。利用分子生物学技术和研究策略,揭示自然界各种环境中(尤其是极端环境)微生物多样性的真实水平及其物种组成,是微生物生态学各项研究的基础和核心,是重新认识复杂的微生物世界的开端。
土壤微生物测定方法
土壤微生物测定 土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。 测定指标： 1、土壤微生物量(Mierobia lBiomass，MB) 能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。 目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。 此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。 熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取 将熏蒸土壤无损地转移到200mL聚乙烯塑料瓶中，加入·L-1 K2SO4（图水比为1:4；w：v），振荡30min（300rev·min-1），用中速定量滤纸过滤于125mL 塑料瓶中。熏蒸开始的同时，另称取等量的3份土壤于200mL聚乙烯塑料瓶中，直接加入·L-1 K2SO4提取；另作3个无土壤空白。提取液应立即分析。 （3）测定 吸取10mL上述土壤提取液于150mL消化管（24mmх295mm）中，准确加入mol·L-1K2Cr2O7—12 mol·L-1H2SO4溶液，加入2~3玻璃珠或瓷片，混匀后置于175±1℃磷酸浴中煮沸10min（放入消化管前，磷酸浴温度应调至179℃，
污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性测定方法
第26卷第10期 2006年10月生 态 学 报ACT A EC O LOGIC A SI NIC A V ol.26,N o.10Oct.,2006 污染土壤微生物群落结构多样性及 功能多样性测定方法 陈承利,廖 敏3 ,曾路生 (污染环境修复与生态健康教育部重点实验室,浙江大学环境与资源学院,杭州 310029)基金项目:国家重点基础研究发展规划“973”资助项目(2002C B410804);国家自然科学基金资助项目(40201026) 收稿日期:2005206227;修订日期:2006205220 作者简介:陈承利(1982～),男,浙江平阳,硕士,主要从事土壤环境化学与环境生态毒理学研究.E 2mail :clchen1982@1631com 3通讯作者C orresponding author.E -mail :liaom in @https://www.wendangku.net/doc/646177573.html, or liaom inzju1@1631com Found ation item :The project was supported by National K ey Basic Research Support F oundation of China (N o.2002C B410804)and National Natural Science F oundation of China (N o.40201026) R eceived d ate :2005206227;Accepted d ate :2006205220 Biography :CHE N Cheng 2Li ,M aster ,mainly engaged in s oil environmental chem istry and ecotoxicology.E 2mail :clchen1982@1631com 摘要:土壤微生物在促进土壤质量和植物健康方面发挥着重要的作用,土壤微生物群落结构和组成的多样性及其变化在一定程度上反映了土壤质量。为了更好地了解土壤健康状况,非常有必要发展有效的方法来研究污染土壤微生物的多样性、分布以及行为等。回顾了近年来国内外污染土壤微生物群落结构多样性及功能多样性的测定方法,包括生物化学技术和分子生物学技术,现将它们的原理、优缺点、实用性及其发展动态作一阐述,同时指出结合这两种技术可为微生物群落分析提供一个更全面的、精确的方法。 关键词:污染土壤;微生物多样性;分子生物学;BI O LOG;P LFA ;PCR ;DNA 文章编号:100020933(2006)1023404209 中图分类号:Q143,Q938,S154 文献标识码:A Methods to measure the microbial community structure and functional diversity in polluted soils CHE N Cheng 2Li ,LI AO Min 3,ZE NG Lu 2Sheng (MOE K ey Laboratory ,Environmental Remediation and Ecosystem H ealth ,College o f Environmental and Resources Sciences ,Zhejiang Univer sity ,Hangzhou ,310029,China ).Acta Ecologica Sinica ,2006,26(10):3404～3412. Abstract :S oil m icroorganisms ,such as bacteria and fungi ,play im portant roles in prom oting soil quality and im proving plant health and nutrition ,thus in fluencing terrestrial ecosystems.Increasing anthropogenic activities ,such as spraw ling urbanization ,agricultural development ,pesticides utilization ,and pollutions from all sources ,can potentially affect soil m icrobial community com position and diversity ,leading to deterioration of soil quality and fertility.H owever ,it is yet to be determ ined how these changes in m icrobial diversity can in fluence surface and ground ecosystems.T o that end ,there is an acute need for reliable and accurate methods to study the community structure and tax onomy of soil m icroorganisms.W ithout the development of effective methods for studying the m icrobial diversity ,distribution ,and behavior in polluted soil ,a thorough understanding of m icrobial diversity ,as well as its im pact on soil health ,cannot be achieved. The determ ination of species diversity depends on several factors including the intensity of each species ,the total number of species present ,species evenness ,and the spatial distribution of species.M ethods to measure m icrobial community structure and functional diversity in polluted soils can be classified into tw o groups ,i.e.,biochem ical 2based techniques and m olecular biological 2based techniques.T ypically ,diversity studies include the relative com parisons of communities across a gradient of stress and disturbance.W ith current techniques ,it is difficult to study true diversity due to lack of know ledge on com position and the techniques to determ ine the accuracy of the extraction or detection methods.T raditionally ,the analysis of soil m icrobial
土壤微生物多样性的主要影响因素
龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/646177573.html, 土壤微生物多样性的主要影响因素 作者：汪海静 来源：《北方环境》2011年第02期 摘要：土壤微生物是土壤生态系统的主要组成部分，而且不同的土壤具有不同的土壤微生物群落。影响土壤微生物多样性的因素很多，主要可以分为自然因素和人为因素。本文将从土壤微生物多样性的影响因素的两个方面阐述目前国内外土壤微生物多样性的研究现状。 关键词：土壤微生物；微生物多样性；影响因素 中图分类号：X53文献标识码：A文章编号：1007-0370(2011)1，2-0090-02 土壤微生物系统作为稳定生态系统，是保证动植物生存、农业健康、持续发展的基础。在一定程度上地球生态系统的变化与土壤微生物群落的变化密切相关。研究土壤微生物多样性的变化情况对评价生态系统、维护生态平衡有着十分重要的意义，因此土壤多样性的研究得到了广泛学者的关注。 影响土壤微生物群落的结构组成和多样性的因素可大体分成自然因素和人为因素两大类。自然因素包括土壤类型、温度、水分、植被等；人为因素包括土壤的耕作方式、农药的施用、施肥的施用等。本文将分别对几种有代表性的土壤微生物多样性影响因素加以阐述。 1、自然因素 1.1土壤类型 地球上土壤类型是多种多样的，不同土壤类型中的微生物群落结构及组成也是千差万别的。目前来许多的研究都表明土壤类型是土壤微生物群落结构的主要影响因素之一。例如：Gelsomino等通过比较不同地理位置的16种土壤微生物DGGE图谱发现土壤类型是决定土壤 微生物群落结构的主要因素。杨超等研究了我国皖南烟区四种不同植烟土壤类型在烟叶生长期内的微生物种类、数量变化情况。其结果表明了在不同的土壤环境下土壤微生物的数量和土壤养分含量呈正相关关系。这同时也说明了土壤类型在土壤微生物多样性方面具有一定的影响力。 1.2植被情况