高效液相色谱实验报告

联苯、甲苯、萘和菲以及它们混样的高效液相色谱分析

实验目的

1.熟练掌握高效液相色谱相关仪器的操作流程。

2.通过高效液相色谱的方法对已知物质进行分析

3.通过谱图分析，掌握运用谱图数据处理目标物质的方法。

一、实验原理

色谱分析是运用物质在固定相和流动相两相间的分配系数不同而达到分离，它是一种分离技术，主要目的是对混合物中目标产物进行分离并定量分析的一种技术。

二、实验内容

运用高效液相色谱仪测定联苯、甲苯、萘和菲以及四者混合物的色谱，熟练仪器的相关操作流程，能从检测的谱图中定性的指认四者峰的归属，并能定量的描述四者混合物中各自的相对含量。

三、实验步骤

1、打开仪器电源开关，让仪器预热一段时间，此时可准备待测样品；

2、待仪器运转正常，打开测试软件，先用甲醇清洗柱子（在Load状态下进样，分析时在Inject状态下）；

3、进样状态下插入微量注射器，切到装填状态，注入样品，切回到进样状态。

4、点击分析按钮，输入分析的样品名；

5、数据分析，通过软件查看积分面积。

五、实验结果

液相色谱图 （1）混样

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0 2.5

3.0 3.5

4.0 4.5

5.0 5.5

6.0min

0.01.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

mV(x100)

Detector A:254nm

1.722/15606

3.034/1116886

3.383/709768

4.037/2542977

5.046/7069594

（2）联苯

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0min

0.00.51.0

1.5

2.02.5

3.03.5

4.04.5

5.05.5

6.06.5

mV(x100)Detector A:254nm

1.731

2.578

4.147

5.213

（3）萘

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0min

0.00.51.0

1.5

2.02.5

3.03.5

4.04.5

5.0mV(x10)

Detector A:254nm

1.721

3.043

3.408

4.084

5.152

（4）甲苯

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

min

0.00.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

mV(x10)Detector A:254nm

1.721

3.056

5.193

（5）菲

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0min

0.01.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

7.0

mV(x100)Detector A:254nm

1.730

3.406

5.075

谱图分析：

依据各个物种标样的色谱图可以知道他们各自的出峰时间大致为：菲：5.075min ；联苯：4.147 min ；萘：3.408 min ；甲苯：3.032 min ； 故此可以判断混样中出峰位置所对应的物种，5.046 min 对应为菲，4.037 min 对应为联苯，3.383 min 对应为萘，3.034 min 对应为甲苯。从混样所得的色谱图中给出的峰面积数据可以知道四种物质的含量约为:菲占61.80%，联苯占22.24%，甲苯占9.76%，奈占6.20%。

高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯

实验七高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯 一.实验目的 1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。 2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。 3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。 二.实验原理 高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。 在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。反之，则称为正相色谱分离系统。反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。 定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为： R＝ 2[t (R2)-t (R1) ] /1.7*(W 1 ＋W 2 ) 式中 t (R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t (R1) 为相邻两峰中前一峰的保留 时间； W 1及W 2 为此相邻两峰的半峰宽。除另外有规定外，分离度应大于1.5。 本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。待测物性质见表1。 表1色谱柱测试条件 如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。

三.仪器与试剂 1、仪器 Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。 2、试剂 甲醇（色谱专用），高纯水 四.实验步骤 1、色谱条件 色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8） 柱温：室温 流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％ 检测器：DAD检测器; 检测波长：220nm； 进样体积：100μl定量环，实际注射每次可控制在200μl。 2、待测溶液的配制 首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。然后各取1mL储备液用水和甲醇（20：80）稀释至10mL，作为待测溶液。 3、色谱测定 (1) 按操作规程开启电脑，开启脱气机、泵、检测器等的电源，启动Agilent 1100在线工作软件，设定操作条件。流量为1.000ml/min。 (2) 待仪器稳定后，开始进样。将进样阀柄置于“LOAD”位置，用微量注射器吸取混合物溶液50ul，注入仪器进样口，顺时针方向扳动进样阀至“INJECT”位置，此时显示屏显示进样标志。 (3) 记下各组分色谱峰的保留时间及峰面积及分离比。 (4) 实验完毕，清洗系统及色谱柱。依次用甲醇-水（60：40）、甲醇-水（70：30）……直到纯甲醇作流动相清洗，每次清洗至基线走稳，至少清洗15min。 五.实验结果

高效液相色谱仪(HPLC)校正方法

高效液相色谱仪（HPLC）校正方法 0.1输液系统： 0.1.1梯度误差G C不超过±3% 0.1.2泵流量设定值误差 S s＜±2% 0.1.3流量稳定性误差 S R＜±2% 0.2紫外检测器性能 0.2.1基线噪声不超过5×10-4AU，基线漂移不超过5×10-3AU 0.2.2定量测量重复性误差（6次进样）RSD≤1.5% 0.2.3最小检测浓度不超过1×10-7g/ml萘/甲醇溶液 0.2.4可调波长紫外可见光检测器波长示值不超过±2nm(HP1100高效液相色谱仪可由仪器自身完成) 1校正条件 1.1环境温度10-30℃，相对湿度低于65% 1.2校正设备 1.2.1秒表分度值小于0.1 s 1.2.2分析天平最大称量200g,最小分度值0.1mg 1.2.3容量瓶 1.2.4微量注射器 1.3标准物质和试剂 1.3.1HPLC用甲醇、纯水，分析纯的丙酮 1.3.21×10-4g/ml，1×10-7g/ml的萘甲醇溶液 1.3.3紫外波长标准溶液 2校正方法 2.1梯度误差G C的校正 2.1.1进行梯度洗脱程序，A溶剂为水，B溶剂为0.1%丙酮的水溶液，B经5个阶段从0变到100%， 20%—40%—60%—80%—100%，重复测量两次，取平均值，求各段梯度误差Gci，取最大作为仪器梯度误差，公式：Gci=（Li—Lm）/Lm×100% Li：第i段信号值的平均值； Lm ：各段输出信号平均值的平均值 可接受标准： -3%≤Gci≤3% 2.2泵流量设定值误差Ss、流量稳定性误差S R的校正 2.2.1将仪器的输液系统、进样器、色谱柱和检测器联接好，以甲醇为流动相，按表一设定流量，待 流速稳定后，在流动相排出口用事先清洗称重过的容量瓶收集流动相，同时用秒表计时，准确的收集10-25

实验一 高效液相色谱柱效能的评价

高效液相色谱柱效能的评定 1. 实验目的和要求 1.1了解高效液相色谱仪的基本结构。 1.2初步掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。 1.3学习高效液相色谱柱效能的评定及分离度的测定方法。 2. 实验原理 苯、萘、联苯分子非极性部分的总表面积不同，缔合能力不同，其保留时间也不同。通过计算色谱峰的理论塔板数以及各个化学物质间的分离度评价色谱柱的效能。 3. 实验仪器与试剂 3.1 仪器 高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器） 分析天平 3.2 试剂 苯、萘、联苯（均为分析纯） 甲醇（色谱纯） 纯净水 4. 实验步骤 4.1 色谱条件 色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm 流动相：甲醇-水（80：20，v/v） 流速：1mL·min-1 检测波长：254nm 柱温：30℃ 进样量：10μL 4.2 操作步骤 分别精密配制含苯、萘、联苯浓度均为约1mg·mL-1的3份对照品溶液各10mL。

● 分别精密吸取上述对照品溶液各2mL 置于10mL 容量瓶中，加流动相稀 释，并定容至刻度，摇匀，得到含苯、萘、联苯的混合对照品溶液。 ● 按照上述色谱条件操作，进样，记录色谱图。 ● 计算各色谱峰的理论塔板数及各峰间分离度。 4.3 实验数据处理 ● 记录实验条件，测试各试样后记录苯、萘、联苯的保留时间、峰宽、半 峰宽，计算出各物质对应的理论塔板数。根据保留时间与峰宽信息，计算相邻物质对间的分离度。 ● 柱效计算 式中：t R 为峰值保留时间（min ），W 1/2为半峰宽（min ），W 为峰宽（min ） ● 式中：t R1和t R2分别为相邻两组分的峰值保留时间（min ） W 1和W 2分别为相邻两组分色谱峰的峰宽（min ） 5. 问题与讨论 2 2 1 2) (54.5)(16W t W t n R R ==

高效液相色谱法的应用

高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展 摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。 关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术 Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect. Keywords: high performance liquid chromatography，HPLC ,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques 引言： 高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。 1 在药物分析中的应用 1.1 在药物鉴别中的应用 在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，

高效液相色谱方法的验证

高效液相色谱方法的验证 ?方法验证的目的 ?方法验证的内容 ?方法验证的项目及测定方法

方法验证的目的 目的：证明采用的方法适合相应检测的要求。 方法验证是实验室针对特定方法的研究过程，通过设计方案，有步骤、系统地收集、处理实验数据，最终形成文件，以证明所用试验方法准确、灵敏、专属并重现。同一分析方法用于不同的检测项目会有不同的验证要求。

方法验证的内容 ?准确度 ?精密度 ?专属性 ?检测限 ?定量限 ?线性和范围 ?耐用性

准确度 定义：方法测定结果与真实值或参考值的接近程度。一般用回收率%表示。 1. 主成分含量测定 原料药：对照品或方法比对 2. 制剂、中药：标准加样回收 杂质定量 测定：加样回收（n 3 9） 杂质对照品 方法比对 回收率 C-A %=′ B 100% 杂质与主成分的相对含量 A:试验供试品中被测成分的量 （通常为含量测定量的50%） B: 试验供试品中加入的对照品的量 （通常为±20%） C:试验测定值

精密度 定义：在规定测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。一般用偏差，相对偏差和相对标准偏差 1. 重复性（n 9） 3 2. 中间精密度 3. 重复性 测定：HPLC方法的精密度测试，应从样品制备开始，设计3个浓度， 分别平行制备3份，以测定含量计算相对标准偏差；或同一样品平行制备6份供试品，分别进样，以峰面积计算相对标准偏差。 同一份供试品连续进样6次，计算得到的相对标准偏差只能表征进样精密度，不能作为方法精密度。

专属性 定义：在其它成分可能存在下，方法能正确测定出被测物的特性。 1. 鉴别反应 2. 含量测定 杂质测定 测定： 限量检查 空白制剂，模拟复方 加速破坏试样测试 DAD峰纯度检查

高效液相色谱法习题

第12章高效液相色谱法习题 （一）选择题 单选题 1. 在高效液相色谱中影响柱效的主要因素是( ) A 涡流扩散 B 分子扩散 C 传质阻力 D 输液压力 2. 在高效液相色谱中，提高柱效能的有效途径是( ) A 提高流动相流速 B 采用小颗粒固定相 C 提高柱温 D 采用更灵敏的检测器 3. 高效液相色谱法的分离效果比经典液相色谱法高，主要原因是( ) A 流动相种类多 B 操作仪器化 C 采用高效固定相 D 采用高灵敏检测器 4. 在高效液相色谱中，通用型检测器是( ) A 紫外检测器 B 荧光检测器 C 示差折光检测器 D 电导检测器 5. HPLC与GC的比较，可忽略纵向扩散项，这主要是因为( ) A 柱前压力高 B 流速比GC的快 C 流动相黏度较小 D 柱温低 6．液相色谱定量分析时，要求混合物中每一个组分都出峰的是( ) A 外标标准曲线法 B 内标法 C 面积归一化法 D 外标法 7．下述四种方法中最适宜分离异构体的是是( ) A 吸附色谱 B 反离子对色谱 C 亲和色谱 D 空间排阻色谱 8．在液相色谱中，梯度洗脱适用于分离( ) A 异构体 B 沸点相近，官能团相同的化合物 C 沸点相差大的试样 D 极性变化范围宽的试样 9．在HPLC中，范氏方程中对柱效影响可以忽略不计的因素是( ) A 涡流扩散 B 纵向扩散 C 固定相传质阻力 D 流动相传质阻力 10．当用硅胶为基质的填料作固定相时，流动相的pH范围应为( ) A 在中性区域 B 5一8 C 1一14 D 2一8

11．高效液相色谱法中，常用的流动相有水、乙腈、甲醇、正己烷，其极性大小顺序为( ) A 乙腈>水>甲醇>正己烷 B 乙腈>甲醇 >水>正己烷 C 水> 乙腈>甲醇>正己烷 D 水>甲醇> 乙腈>正己烷 12．高效液相色谱法中,使用高压泵主要是由于( ) A 可加快流速，缩短分析时间 B 高压可使分离效率显著提高 C 采用了细粒度固定相所致 D 采用了填充毛细管柱 13．液相色谱的H-u曲线（）。 A 与气相色谱的一样，存在着H min B H随流动相的流速增加而下降 C H随流动相的流速增加而上升 D H受u影响很小 14. 与气相色谱相比，在液相色谱中（）。 A 分子扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 B 涡流扩散项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 C 传质阻力项很小，可忽略不计，速率方程式由两项构成 D 速率方程式同样由三项构成，两者相同 15．液相色谱中不影响色谱峰扩展的因素是（）。 A 涡流扩散项 B 分子扩散项 C 传质扩散项 D 柱压效应 16．在液相色谱中，常用作固定相又可用作键合相基体的物质是（）。 A 分子筛 B 硅胶 C 氧化铝 D 活性炭 17．样品中各组分的出柱顺序与流动相的性质无关的色谱是（）。 A 离子交换色谱 B 环糊精色谱 C 亲和色谱 D 凝胶色谱18．高效液相色谱法中，对于极性成分，当增大流动相的极性，可使其保留值（）。 A 不变 B 增大 C 减小 D 不一定 19．在反相色谱法中，若以甲醇-水为流动相，增加甲醇的比例时，组分的容量因子k与保留时间t R的变化为（）。 A k与t R增大 B k与t R减小 C k与t R不变 D k增大，t R减小 多选题 20．下列检测器中，不属于高效液相色谱中的检测器是（） A 紫外检测器 B 氢火焰离子化检测器 C 荧光检测器 D 氮磷检测器 E 示差折光检测器 21．化学键合固定相具备下列何种特点（） A 固定液不易流失 B 选择性好 C 不适用于梯度洗脱 D 柱效高 E 易和组分形成氢键吸附

高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证

高效液相色谱法测定含量示例的方法再确证作者：张建芝冯顺 来源：《维吾尔医药》2013年第07期 摘要：目的：确证用反相高效液相色谱法测定头孢氨苄含量的方法有效性和准确性。方法：以Diamonsil CLC-ODS（150mm x 6mm，10 lm）为色谱柱，水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液- 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相，检测波长为254 nm，外标法定量。结果：头孢氨苄浓度线性范围为0.02～0.20mg / ml，相关系数r= 0.9991，方法重复性试验 RSD为 1.42%。结论：该方法可简单高效地完成，结果准确性好、稳定可靠，确证高效液相色谱依然为头孢氨苄制剂的质量控制中有效可靠的方法。 关键词：头孢氨苄高效液相色谱法 头孢氨芐（Cefalexin，又译先锋霉素Ⅳ、头孢力新等）是一种半合成的第一代口服头孢霉素类类抗生素药物，化学名（6R，7R）-3-甲基-7-[（R）-2-氨基-2-苯乙酰氨基]-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，化学式C16H17N3O4S，在临床上广为使用。其含量测定在旧版的中国药典（ 1995年版）采用碘量法○1。但此法不仅操作步骤繁多，费工费时，干扰因素多；然后人们发明采用高效液相色谱法内标法测定的方法，但内标物保留时间过长，依然存在问题。最后人们又发现采用高效液相色谱法，用外标法测定其含量，方法操作简单方便、数据准确可靠，灵敏度较高，重复性好，最终获得了较为满意的结果○2。现在本文对这个方法进行确证，以确定该方法的有效性和准确性。 1.仪器与试药 分析天平（precisa instrument ltd switzer land xs 225a precisa ），高效液相色谱柱（diamonsic C18 250 * 46mm），检测器（UVD 170v），泵（P680 HPLC pump），头孢氨苄胶囊（广州白云山制药总厂批号：2110102） 2. 色谱条件 用十八烷基硅烷键和硅胶为填充剂：水-甲醇- 3.89% 醋酸钠溶液 - 4% 醋酸溶液（700：300：15：3）为流动相；检测波长为254nm；理论塔板数按头孢氨苄峰计算不低于1500。 3. 实验试剂制备 3.1 对照品储备液的制备：对照品储备液的制备：取头孢氨苄对照品约10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，为对照品储备液。 3.2 供试品溶液的制备：去装量差异项下的内容物，混合均匀，精密量取适量（约相当于头孢氨苄0.1g），置于 100ml 容量瓶里，加流动相适量，充分振摇使溶解，再加流动相稀释至

高效液相色谱法测定手册

高效液相色谱法测定手册 一目的：制定高效液相色谱法，规范高效液相色谱法的测定操作。 二适用范围：适用于高效液相色谱法的测定。 三责任者：品控部。 四正文 1 简述 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液，作为流动相，用泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。由于应用了各种特性的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有分离性能高，分析速度快的特点。 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。有的药品需在色谱分离前或后经过衍生化反应方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶，用于正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱；离子交换填料，用于离子交换色谱；具一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 高效液相色谱仪基本由泵，进样器，色谱柱，检测器和色谱数据处理系统组成。检测器最常用的为可变波长紫外可见光检测器，其他检测器有如示差折光检测器和蒸发光散射检测器等。色谱信息的收集和处理常用积分仪或数据工作站进行。梯度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀进行程控实现。 2 高效液相色谱仪的使用要求 2.1 按国家技术监督局国家计量检定规程汇编中“实验室液相色谱仪检定规程（JJG705—90）”的规定作定期检定，应符合规定。 2.2 仪器各部件应能正常工作，管路为无死体积连结，流路中无堵塞或漏液，在设定的检测器灵敏度条件下，色谱基线噪音和漂移应能满足分析要求。 2.3 具体仪器在使用前应详细参阅各操作说明书。

高效液相色谱测定法标准操作规程

标准操作规程 1目的：建立高效液相色谱测定法操作规程，以使检验操作规化。 2适用围：适用于高效液相色谱测定法检验操作全过程。 3责任：QC人员对本SOP实施负责。 4容 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱，各组分在柱被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 4.1.对仪器的一般要求和色谱条件 高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱径一般为3.9~4.6mm，填充剂粒径为3~10μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。 4.1.1.色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。 色谱柱的径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分

离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在 2?8之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH 值小于2或大于8 的流动相。 4.1.2.检测器 最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应。结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定围呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 4.1.3.流动相 反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5％，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变围为0.7X?1.3X；当X大于33%时，允许改变围为X—10%?X+10% 。

高效液相色谱速率理论

高效液相色谱速率理论 1956年荷兰学者van Deemter 等在研究气液色谱时，提出了色谱过程动力学理论— 速率理论。 他们吸收了塔板理论中板高的概念，并充分考虑了组分在两相间的扩散和传质过程，从而在动力学基础上较好地解释了影响板高的各种因素。该理论模型对气相、液相色谱都适用。 式中：u 为流动相的线速度； A ， B ， C 为常数，分别代表涡流扩散项、分子扩散系数、传质阻力系数。 该式从动力学角度很好地解释了影响板高（柱效）的各种因素！ 任何减少方程右边三项数值的方法，都可降低 H ，从而提高柱效。 1、涡流扩散项A 在填充色谱柱中，当组分随流动相向柱出口迁移时，流动相由于受到固定相颗粒障碍，不断改变流动方向，使组分分子在前进中形成紊乱的类似“ 涡 流” 的 流动，故称涡流扩散。 Cu u B A H ++=

从图中可见，因填充物颗粒大小及填充的不均匀性，同一组分运行路线长短不同，流出时间不同，峰形展宽。 A ＝2 λdp dp：填充物平均颗粒的直径 ; λ：填充不均匀性因子 展宽程度以A表示 固定相颗粒越小 ( dp↓) ，填充的越均匀，A↓，H↓，柱效n↑。则由涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。对于空心毛细管柱，无涡流扩散，即A=0。 2、分子扩散项B /u（纵向扩散项） 纵向扩散是由浓度梯度造成的。

组分从柱口加入，其浓度分布的构型呈“塞子”状，如图所示。它随着流动相向前推进，由于存在浓度梯度，“塞子”必然自发地向前和向后扩散，造成谱带展宽。 分子扩散项系数为： B=2γD g B：分子扩散项系数 γ：阻碍因子（扩散阻止系数） , 因载体填充在柱内而引起气体扩散路径弯曲的因素 - 弯曲因子 D ：组分在流动相中扩散系数 3、传质阻力项C u 由于气相色谱以气体为流动相，液相色谱以液体为流动相，它们的传质过程不完全相同，现分别讨论之。 （l）对于气液色谱，传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数Cl两项，即： C＝Cg＋Cl 气相传质过程是指试样组分从气相移动到固定相表面的过程。这一过程中试样组分将在两相间进行质量交换，即进行浓度分配。有的分子还来不及进入两相界面，就被气相带走；有的则进人两相界面又来不及返回气相。这样，使得试样在两相界面上

游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法)

八．饮料中游离色氨酸的测定(高效液相色谱测定方法) 本方法适合饮料中游离色氨酸的测定 本方法检测限：饮料中游离色氨酸为30μg/100ml。 （一）方法提要 试样的游离色氨酸经处理后，在高效反相色谱C18柱上分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，外标法定量游离色氨酸的含量。 （二）仪器 1. 高效液相色谱仪带紫外检测器或二极管阵列检测器。 2. 超声清洗仪（溶剂脱气用）。 3. 天平（精确到0.0001g）。 4. 微孔滤膜（HF 0.45 μm）。 （三）试剂 1. 1.0mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠（分析纯），加适量去离子水并稀释到100ml。 2. 甲醇（色谱纯）。 3. 0.1%(m/V)磷酸溶液：1.0g磷酸（分析纯）加水至1000mL，溶解混匀，过微孔滤膜0.45μm，待用。 4. 色氨酸对照品，Fluka公司(纯度≥99.5%)。 5. 色氨酸标准溶液：精密称取色氨酸对照品约0.0300g，移入100ml容量瓶中，加入少许水，再加入50μL1.0mol/L氢氧化钠溶液，超声溶解并用水定容到100mL，成浓度为300μg/mL的标准储备液。取标准储备液5.0mL用去离子水定容到50mL，成为浓度为30μg/mL的标准溶液。 （四）测定步骤 1. 样品处理： ①汽水、可乐型饮料：取均匀试样置于小烧杯中，微温除去二氧化碳（或超声脱气10min），经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 ②果汁类：取均匀试样置于离心管中，5000rpm/min离心20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤后供进样用。 2. 标准工作曲线制作。精密吸取色氨酸标准溶液1.0，5.0，10.0ml，分别置于100mL容量瓶中，用水定容到100mL，摇匀。分别取10μL标准工作系列溶液进样

高效液相色谱法的分类及原理

高效液相色谱法地分类及其分离原理 高效液相色谱法分为：液固色谱法、液液色谱法、离子交换色谱法、凝胶色谱法. .液固色谱法（液固吸附色谱法） 固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上地吸附作用不同来进行分配地. ①液固色谱法地作用机制 吸附剂：一些多孔地固体颗粒物质，其表面常存在分散地吸附中心点. 流动相中地溶质分子（液相）被流动相带入色谱柱后，在随载液流动地过程中，发生如下交换反应： （液相）（吸附）<>（吸附）（液相） 其作用机制是溶质分子（液相）和溶剂分子（液相）对吸附剂活性表面地竞争吸附. 吸附反应地平衡常数为： 值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附地溶质分子很少，先流出色谱柱. 值较大：表示该组分分子地吸附能力较强，后流出色谱柱. 发生在吸附剂表面上地吸附解吸平衡，就是液固色谱分离地基础.资料个人收集整理，勿做商业用途 ②液固色谱法地吸附剂和流动相 常用地液固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等. 一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂（如硅胶、氧化铜）之间地作用力很弱，分配比较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间地作用力很强，分配比大，保留时间长.资料个人收集整理，勿做商业用途 对流动相地基本要求： 试样要能够溶于流动相中 流动相粘度较小 流动相不能影响试样地检测 常用地流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等. ③液固色谱法地应用 常用于分离极性不同地化合物、含有不同类型或不；数量官能团地有机化合物，以及有机化合物地不同地异构体；但液固色谱法不宜用于分离同系物，因为液固色谱对不同相对分子质量地同系物选择性不高.资料个人收集整理，勿做商业用途 .液液色谱法（液液分配色谱法） 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相. ①液液色谱法地作用机制 溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小地组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大地组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离地目地.资料个人收集整理，勿做商业用途 液液色谱法与液液萃取法地基本原理相同，均服从分配定律：固液 值大地组分，保留时间长，后流出色谱柱. ②正相色谱和反相色谱 正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂（如苯、正己烷等）作流动相. 反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂（如水、甲醇、己腈等）作流动相.

高效液相色谱法的计算方法

高效液相色谱法的计算方法 高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。 1、对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱;凝胶或玻璃微球等,用于分子排阻色谱等。注样量一般为数微升。除另有规定外,柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。 在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法(附录ⅣA)项下对溶剂的要求。 正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外,其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。 2、系统适用性试验 按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。 (1)色谱柱的理论板数（N,用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。 在选定的条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间ｔR（以分钟或长度计，下同,但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2),按n=5.5４(t R/Wｈ/2)2计算色谱柱的理论板数,如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数,应改变色谱柱的某些条件(如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等),使理论板数达到要求。 （2) 分离度（R)

高效液相色谱法含量测定操作规程

高效液相色谱法含量测定 1检验方法 高效液相色谱法 2检验原理 高效液相色谱法系采用高压输液泵，将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对样品进行测定的色谱方法。注入样品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依此进入检测器，由数据处理系统记录和处理色谱信号。 3检验试剂 甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、纯水（高纯水）、磷酸等。 4供试品溶液制备 取要测试的供试品适量，参照《药典》及《制剂规范》，用规定的溶剂适宜的提取精制方法，配制成一定浓度的供试品溶液。供试品溶液注入色谱柱前要经适宜的0.45nm的滤膜滤过。5对照品溶液制备 根据供试品所要测定的成分取相应的对照品，用适宜的溶剂配制成相应浓度的对照品溶液。6流动相配制 用高纯度的试剂配制流动相，水应为新鲜配制的高纯水。配制好的流动相通过适宜的0.45nm 的滤膜滤过，用前脱气。 7操作 7.1打开自动进样器、检测器、泵、柱温箱，进入工作站。 7.2自动进样器排气 自动进样器排气用50%甲醇（用前脱气），点击自动进样器界面上的purge键，自动排气25分钟。 7.3泵排气 分析界面中，设置方法参数，下载方法参数。用流动相冲洗吸滤头，再把吸滤头浸入流动相中，逆时针旋转排气阀90-180度，点击purge键，排气3-4分钟，顺时针旋转排气阀90-180度，激活仪器。 7.4进样操作 7.4.1.将对照品溶液和供试品溶液分别置于样品瓶中，盖上带有垫片的瓶盖，顺时针旋紧，7.4.2将样品瓶按顺序放置于样品瓶架上。 7.4.3设置方法参数，选择波长、柱温、流速、结束时间等，下载并保存方法文件，待色谱系统充分稳定，基线平直。 7.4.4设置批处理分析表。分析界面主项目中，点击批处理分析，依次设置样品瓶号、样品瓶架号、样品名、方法文件、数据文件、进样体积，保存批处理分析表，点击批处理分析开始，开始数据采集。 7.4.5不同浓度的对照品溶液和同一浓度的供试品溶液应分别进样不少于5针。 7.5色谱数据的收集处理 7.5.1 建立标准曲线 7.5.1.1再解析界面中，选择要处理的对照品数据的其中一个数据，点击向导，出现化合物表向导，选择最小面积，点击下一步，选择有效峰，点击下一步，输入浓度单位，最大级别数，点击下一步，输入化合物名，依次输入几个对照品溶液浓度，点击完成。保存方法文件。7.5.1.2在方法中，打开上述所保存的方法文件，出现校准曲线视图，将相应浓度的对照品色谱数据拖至数据文件相应的级别中，形成标准曲线图，查看R数值不大于0.9999，表明线性关系良好，方法文件另存为标准曲线。

高效液相色谱技术(HPLC)

140 7 高效液相色谱技术（HPLC ） 高效液相色谱（HPLC ：High Performance Liquid Chromatography ）是化学、生物化 学与分子生物学、医药学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的 分离分析技术，是分析化学家、生物化学家等用以解决他们面临的各种实际分离分析课题 必不可缺少的工具。国际市场调查表明，高效液相色谱仪在分析仪器销售市场中占有最大 的份额，增长速度最快。 高效液相色谱的优点是：检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精 度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点 是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗 大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。 7.1 基本原理 固定相 流动相 A B C C B A 固定相 —— 柱内填料，流动相 —— 洗脱剂。 HPLC 是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数 次的交换和分配而达到分离的过程。 通常，按溶质（样品）在两相分离过程的物理化学性质可以作如下的分类： 分配色谱：—— 分配系数 亲和色谱：—— 亲和力 吸附色谱：—— 吸附力 离子交换色谱：—— 离子交换能力 凝胶色谱（体积排阻色谱）：—— 分子大小而引起的体积排阻 分配色谱又可分为：

正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。 固定相（柱填料）： 固定相又分为两类，一类是使用最多的微粒硅胶，另一类是使用较少的高分子微球。后者的优点是强度大、化学惰性，使用pH范围大，pH=1～14，缺点是柱效较小，常用于离子交换色谱和凝胶色谱。 最常使用的全孔微粒硅胶（3～10μm）是化学键合相硅胶，这种固定相要占所有柱填料的80％。它是通过化学反应把某种适当的化学官能团（例如各种有机硅烷），键合到硅胶表面上，取代了羟基（－OH）而成。它是近代高效液相色谱技术中最重要的柱填料类型。 使用微粒硅胶要特别注意它的使用pH范围是2～7.5，若过碱（＞pH7.5），硅胶会粉碎或溶解；若过酸（＜pH2），键合相的化学键会断裂。 键合相使用硅胶作基质的优点是：①硅胶的强度大；②微粒硅胶的了孔结构和表面积易人为控制。③化学稳定性好。 硅胶( SiO2?n H2O) ：OH OH —Si—O—Si— 重要的键合相是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物。 最常用的键合相键型是： —Si—O—Si—C R1R1 —Si—OH + X—Si—R —Si—O—Si—R + HX R2R2 硅胶有机硅烷键合相 X ━Cl，CH3O，C2H5O等。 R ━烷：C8H17（即C8填料），C10H21，C18H37等。 R1、R2 ━X、CH3等。 最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种类型的生物大分子有更强的适应能力，因此在生物化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了 141

高效液相色谱(HPLC)基础知识

高效液相色谱（HPLC）基础知识我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表： 方法项目 数量 1985年版1990年版1995年版2000年版 HPLC法 鉴别9 34 150 检查12 40 160 含量测定7 60 117 387 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。 I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用

碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色 谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用 液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需 用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点： 高压——压力可达150~300 Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。 高速——流速为0.1~10.0 ml/min。 高效——可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。 高灵敏度——紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在 5

高效液相色谱法检验方法

生效日期20140101 负责姓名职位签名/日期 起草何瑞清QC 审核梁天静QC主管 批准张小伶质量部经理 分发部门： 部门份数部门份数QC室1 1 目的 建立高效液相色谱法检验程序 2 范围 本程序适用于高效液相色谱法检验标准操作 3 职责 3.1QC人员：严格按本程序操作 3.2QC主管：严格按本程序检查 4 内容 4.1 定义及概述 4.1.1 高效液相色谱法是一种现代液体色谱法，其基本方法是将具一 定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶液作为流动相，用高压 输液泵将流动相注入装有填充剂的色谱柱，注入的供试品被流 动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用记录仪 或数据处理装置记录色谱图或进行数据处理，得到测定结果。 由于应用各种性质的微粒填料和加压的液体流动相，本法具有 分离性能高，分析速度快的特点。 4.1.2 高效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的 药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分

子物质的测定。有的药品需要在色谱分离前或后经过衍生化反 应，方能进行分离或检测。常用的色谱柱填充剂有：硅胶用于 正相色谱；化学键合固定相，根据键合的基团不同可用于反相 或正相色谱，其中最常用的是十八烷基硅烷（又称ODS）键合 硅胶，可用于反相色谱或离子对色谱离子交换填料，用于离子 交换色谱，是有一定孔径的大孔填料，用于排阻色谱。 4.1.3 仪器的组成和一般要求： 4.1.3.1 仪器的组成：高压输液泵、色谱柱、检测器、积分仪、打印机。 4.1.3.2 对仪器的一般要求： ——所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱 的填充剂和流动相的组分按各品种项下的规 定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学健合硅 胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用， 辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶 也有使用。离子交换填充剂用于离子交换色 谱；凝胶或玻璃微球等填充剂用于分子排阻色 谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为 紫外吸收检测器。 ——在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符 合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。（紫外 分光光度法项下对溶剂的要求：用1cm石英吸 收池盛溶剂，以空气为空白（即空白光路中不 置任何物质），测定其吸收度。溶剂和吸收池 所吸收度，在220～240nm范围内不得超过 0.40，在241～250nm范围内不得超过0.20，在 251～300nm范围内不得超过0.10，在300nm以 上时不得超过0.05。）

高效液相色谱法操作规程-2015版药典

1. 目的 建立高效液相色谱法的测定法标准操作规程，规范高效液相色谱法测定的检验操作。 2. 范围 本规程适用于高效液相色谱法的检验操作。 3. 职责 3.1 质量研究员：严格执行本操作规程。 3.2 实验室主管：对本操作规程实施进行监督检查。 4. 内容 4.1 概述 高效液相色谱法系采用髙压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。 1.（正确编写）对仪器的一般要求和色谱条件 髙效液相色谱仪由髙压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般为3.9?4.6 mm，填充剂粒径为3?l0μm。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超髙压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。（1）色谱柱 反相色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。 正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反相色谱。 离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。 手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。

色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。 温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过 60 ℃。 残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相pH值一般应在2?8 之间。残余硅羟基巳封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛p H 值的流动相，适合于pH值小于2 或大于8 的流动相。 （2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用检测器，对所有物质均有响应，结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。 紫外-可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。 不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外-可见分光检测器所用流动相应符合紫外-可见分光光度法（通则0401）项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。 （3）流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇-水系统和乙腈-水系统，用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈-水系统。流动相中应尽可能不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般不低于5%，否则易导致柱效下降、色谱系统不稳定。 正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。 品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于33%时，允许改变范围为0.7X?1.3X，当X大于33%时，允许改变范围为X-10%?X + 10% 。