蔡淑梅 利用啤酒酵母提取RNA的氨法工艺研究

徐州工业职业技术学院

2007届毕业生

毕业专题（设计）

题目：利用啤酒酵母提取RNA的氨法工艺研究年级专业：生化大专04（1）班

学生姓名：蔡淑梅学号：

指导教师：乔德阳甘聃职称：教师

导师单位：徐州工业职业技术学院化学工程系

目录

0.题目 (2)

一.前言 (2)

二.正文 (2)

1.材料 (2)

2.方法 (3)

2.1啤酒酵母RNA含量的测定 (3)

2.2氨法破壁工艺 (3)

2.3沉淀提取RNA (4)

2.4核酸纯度测定 (4)

3.结果 (4)

3.1啤酒酵母泥的核酸含量测定 (4)

3.2不同酵母浓度对RNA提取率的影响 (4)

3.3不同氨浓度对酵母RNA提取率的影响 (5)

3.4 分步沉淀法去除蛋白质试验 (5)

4.结论 (6)

三.致谢 (7)

四.参考文献 (8)

利用啤酒酵母提取RNA的氨法工艺研究

摘要：采用氨法破壁提取RNA，当酵母质量分数为10%，氨为1.0%时，采用分步沉淀法，调蛋白质的等电点后，再加入复合蛋白质沉淀剂去除蛋白质，可获得纯度在83%的优质酵母RNA，核酸的提取率是干酵母的2%以上。

关键词：啤酒酵母；RNA；氨法工艺

Study on Beer Yeast RNA Extraction with Ammonia Method Abstract:The cell wall of beer yeast was broken with ammonia method. The best yeast and ammonia concentration for breaking cell was 10% and 1.0% respectively. The protein was removed by regulating the isoelectric point and chemical agents . Then the high quality yeast RNA with the purity of 83% was obtained.

Key Words:Beer yeast, RNA, Ammonia, Process

一、前言

酵母含有的较高的核酸（RNA），在医药、食品、化妆品以及农业等行业都有重要的用途。随着我国啤酒业的日益发展，啤酒厂淘汰的废弃啤酒酵母泥不断增多。综合利用大量的废弃啤酒酵母泥提取核酸，不仅可以增加经济效益，还能解决饲料酵母存在高核的问题。RNA的提取方法多有报导［1～3］，但国内用氨法破壁提取核酸的方法较为罕见。目前工业上常用的方法是：食盐法、混合盐法以及氢氧化钠破壁法［4］。

由于被淘汰的啤酒酵母菌龄较老，蛋白含量较高而核酸含量较低，因此采用工业上常用的一次沉淀提取工艺［4］，难以获得高纯度的优质核酸（RNA企业质量：经定磷法测定RNA含量≥80%，水分≤8%为优质品，RNA含量≥70%，水分≤8%为一级品）［1］。我们就淘汰的啤酒酵母进行氨法提取工艺研究，旨在为大工业化生产提取核酸，提供切实可行的工艺。

二、正文

1 材料

啤酒酵母泥：在徐州工业职业技术学院生物化工实验中心培养，酵母培养基

的配制为10克葡萄糖+300ml水+30克干酵母，用葡萄液培养,在1000ml的地烧杯里加10克葡萄糖和100ml蒸馏水中，加热置煮沸，取出冷却置25℃以下，才可以将30克干酵母倒入葡萄糖液培养基中，用玻璃棒稍加搅拌均匀后，然后把烧瓶放在25～30℃的恒温恒湿箱培养，然后经离心，酵母含水量为75%～78%左右。

标准啤酒酵母RNA：生化试剂，上海生化试剂厂。

氨水：化学纯（含量25%～28%，），福建三明化工厂产品。

三氯乙酸：化学纯，北京化工厂。

三氯化铁：化学纯，北京化工厂。

2 方法

2．1 啤酒酵母RNA含量的测定

高氯酸法：称取一定量的酵母泥，用5%高氯酸在100℃条件下水解破壁15 min，3600 r/min离心15 min，取其上清液，用752-G紫外分光光度计测定，波长260nm、280nm，石英比色皿，光程1cm。

研磨破碎法：称取一定量的酵母泥，加入适量石英砂置于研钵中，研磨数十分钟，3600 r/min离心15 min，取其上清液，用752-G紫外分光光度计测定，波长260nm、280nm，石英比色皿，光程1cm。

2．2 氨法破壁工艺

称取一定量的酵母泥，加入适量的氨水和水，置60℃温度的水浴条件下，破壁25min，离心（3600 r/min）10 min，其上清液即为核酸抽提液。

2．3 沉淀提取RNA

将核酸抽提液真空低温浓缩（真空度0.015Mpa，温度65℃），冷却后采用调蛋白质等电点法或再加蛋白沉淀剂去除杂蛋白，离心10min（3600r/min）后，取上清液调核酸等电点pH 2左右，离心（3600r/min）10min后，收集RNA沉淀，用2倍体积的95%乙醇洗涤2遍，置60℃烘干至恒重，计算RNA提取率。

2．4 核酸纯度测定

定磷法。［5］

3 结果

3．1 啤酒酵母泥的核酸含量测定

取经过培养的啤酒酵母泥数批，采用三氯乙酸破壁法和研磨破壁法测定酵母的RNA含量，结果见表1。从表中可知，随着酵母使用代数的增多，老龄酵母数量大，酵母泥的RNA含量降低。从总体水平上看被废弃的啤酒酵母泥的RNA含量约在4.5%～6.4%之间，不到高核假丝酵母核酸含量（13%）的一半，核酸抽提液中杂蛋白质含量高，这对提取高纯度优质核酸带来一定的困难。

Tab 1 The RNA content of the beer yeast

3．2 不同酵母浓度对RNA提取率的影响

采用氨1.0%，不同的酵母质量分数进行破壁离心、浓缩上清液，采用分步沉淀法调pH 6.0～6.2去除蛋白质，取上清液调核酸等电点pH 2.0，提取RNA，结果见表2。从表中可见酵母质量分数为10%时，RNA的提取率最佳，其次为12.5%。但此工艺所获得到RNA纯度很低，蛋白质等杂质含量高。

Tab 2 The effect of yeast concentration on RNA yield

3．3 不同氨浓度对酵母RNA提取率的影响

酵母质量分数10%，用不同的氨浓度破壁，浓缩后的核酸抽提液调pH 4.5，离心去除蛋白质，再提取RNA，结果见表3。从酵母RNA的提取率和所获得的RNA 纯度综合分析，在此工艺条件下，氨破壁的最适体积分数为1.0%。调pH 4.5去除蛋白质的效果比pH 6.0 的好，所获得的RNA纯度提高较多。

Tab 3 The effect of ammonia concentration on RNA yield

3．4 分步沉淀法去除蛋白质试验

由于使用过多代的啤酒酵母RNA含量较低，采用常规一步沉淀法提取RNA，杂蛋白质含量高，所获得的RNA纯度很低，难以达到产品要求。以酵母质量分数为10%，氨1.0%，RNA抽提液调不同的蛋白质等电点，沉淀去除蛋白质后，再提取核酸，结果见表4。从表中可知调pH 4.2沉淀去除蛋白质,所获得的RNA纯度最高，超过60%，RNA的提取率达2.3%，pH 4.0的次之。

Tab 4 The results after removing proteins

不同蛋白质沉淀剂的筛选:在选择酵母质量分数10%，氨1.0%，破壁、浓缩后，调pH分步沉淀再添加不同组合的蛋白质沉淀剂，使最终pH为4.2，离心、

过滤后再提取RNA。蛋白质沉淀剂分为五组，Ⅰ组（对照组）：H

2SO

4

；Ⅱ组：H

2

SO

4

+FeCl

3；Ⅲ组：H

2

SO

4

+CCl

3

COOH；Ⅳ组：H

2

SO

4

+FeCl

3

+CCl

3

COOH；Ⅴ组：H

2

SO

4

+FeCl

3

+CCl

3

COOH+NaCl，结果见表5。

Tab 5 The effect of protein sedimentary agents on extract yield of yeast RNA

Ⅰ：Control Ⅱ：H

2SO

4

+FeCl

3

Ⅲ：H

2SO

4

+CCl

3

COOH

Ⅳ：H

2SO

4

+FeCl

3

+CCl

3

COOH

Ⅴ：H

2SO

4

+FeCl

3

+CCl

3

COOH+NaCl

从表5可见添加蛋白质沉淀剂，蛋白质沉淀去除较完全，提高了所获RNA 的纯度。其中用复合蛋白质沉淀剂沉淀蛋白质的效果都比用单一蛋白质沉淀剂的好，Ⅳ组、Ⅴ组复合蛋白质沉淀剂所获得RNA的纯度可达到部颁一级品或优质品，RNA的提取率可达2%以上。

4 讨论

(1) 采用氨法破壁提取废弃的啤酒酵母RNA，所需氨的用量不大，仅为1.0%，最佳破壁温度和时间为60℃ 25min［6］，与盐法破壁工艺（盐10%，100℃ 4.5h）相比较，氨的用量少，温度低，时间短。

(2) 近年来，由于榨糖业不景气，糖蜜数量减少，价格上涨，使得传统核酸生产中培养高核假丝酵母的成本大幅度提高，导致核酸生产不景气。加之啤酒业的日益发展，大量被淘汰的啤酒酵母直接烘干作为饲料酵母，导致饲料酵母中存在高核问题。因此开展综合利用被淘汰的啤酒酵母泥提取核酸，可望获得良好的经济效益。

三、致谢

本文是在甘聃老师精心指导和大力支持下完成的。甘老师以其严谨求实的治学态度、高度的敬业精神、兢兢业业、孜孜以求的工作作风和大胆创新的进取精神对我产生重要影响。他渊博的知识、开阔的视野和敏锐的思维给了我深深的启迪。同时，在此次毕业设计过程中我也学到了许多了关于固体酸催化方面的知识，实验技能有了很大的提高。

另外，我还要特别感谢一些帮助过我的同学，他们的参与对我来我也是必不可少的。

最后，再次对关心我的老师。同学表示衷心的感谢。

四、参考文献

[1]乔宾福. 实用微生物技术.上海：上海科技文献出版社,1994.195

[2]Andren G. 酵母RNA的简易提取方法. 应用微生物，1989，10（6）∶14

[3]毛宁，洪智勇，黄谚谚. 利用啤洒酵母提取核酸工艺的研究. 中国商办工业，1999，11（3）∶43

[4]黄明育. 优质核糖核酸生产工艺. 应用微生物，1993，23（3）∶32

[5]李建武. 生物化学实验原理和方法.北京：北京大学出版社，1994.257

[6]洪智勇，毛宁，刘祖煌，等. 氨法提取啤酒酵母RNA的工艺研究Ⅰ. 中国商办工业，1999，11(10)∶40