WB实验步骤
离心 15min。取上
提取细胞或组织蛋白、测定大致含量
↓
制备SDS-PAGE胶
↓
蛋白样品变性、电泳
↓
电泳转膜
↓
封闭
↓
一抗
↓
TBST洗涤
↓
HRP标记的二抗
BST洗涤
↓
ECL试剂作用
↓
X-光片曝光、显影
↓
结果分析
[主要试剂]
1、SDS-PAGE 试剂：
2、匀浆缓冲液：1.0M Tris-HCl(pH 6.8)1.Oml；10%SDS 6.0ml；β-
巯基乙醇 0.2ml；
ddH2O 2.8ml。
3、转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇 200ml；
加 ddH2O 定容至
1000ml。
4、0.01M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0g；KCl 0.2g；Na2HPO4 1.44g；KH2PO4
0.24g；加 ddH2O
至 1000ml。
5、膜染色液：考马斯亮兰 0.2g；甲醇 80ml；乙酸 2ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱
脂奶粉，现配）：脱脂奶粉 1.0g 溶于 20ml 的 0.01M PBS 中。
6、显色液：DAB 6.0mg；0.01M PBS 10.0ml；硫酸镍胺 0.1ml；H202
1.0μl。
7、兔抗猪 R 蛋白抗体、HRP 标记羊抗兔 IgG（二抗）。
[操作步骤]
1、蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接
裂解细胞，真核细
胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆 0.5-1min。然后4℃，13,000g
（1）电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3 次。
（2）膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和 NC 膜，浸入转膜缓冲液中 10min。
（3）转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24 层滤纸、NC 膜、凝胶、24 层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC 膜精确对齐，每一步去除气泡，上压 500g 重物，将
碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流 1mA/cm2，转移 1.5hr。转移结束后，断开电源将膜
取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中 50s 后，在 50%
甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果
作对比。
4、免疫反应：
（1）用 0.01M PBS 洗膜，5min ×3 次。
（2）加入包被液，平稳摇动，室温 2hr。
（3）弃包被液，用 0.01M PBS 洗膜，5min×3 次。
置 12hr 以上。阴性对照，以 1%BSA 取代一抗，其余步骤与实验组相同。
（5）弃一抗和 1%BSA，用 0.01M PBS 分别洗膜，5min×4 次。
（6）加入辣根过氧化物酶偶联的二抗（按合适稀释比例用 0.01M PBS 稀释），平稳摇动，室温 2hr。
（7）弃二抗，用 0.01M PBS 洗膜，5min×4 次。
（8）加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。
[注意事项]
1、一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。
2、显色液必须新鲜配置使用，最后加入 H2O2。
3、DAB 有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。
技术服务流程：
1. 蛋白质抽提
o 实验对象为组织样品，取适量（250~500mg）新鲜组织样品或正确保存的组
匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
o 实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107 细胞，PBS清洗细胞，去
PBS 加0.1ml~1ml 含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）
抽提总蛋白（或核蛋白）。
2. 蛋白质定量：按 BCA 蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE):将准备好的样品液和预染蛋白 marker 分别
上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4. 蛋白质转移到 PVDF 膜,按 Bio-Rad 蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA 恒
流条件下，4°C 转移过夜。
5. western blot 膜的封闭和抗体孵育
膜在5％脱脂奶粉溶液中室温孵育 1 小时以封闭膜上的非特异结合。
封闭过的膜加入一抗室温孵育1.5 小时，抗原抗体结合。
加入HRP标记的二抗体以结合一抗，室温孵育膜1 小时。加入HRP标记的GAPDH
抗体可同时检测GAPDH 含量。
6. western blot 结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经 X 胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用 GIS1000 分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
7. western blot 数据分析：目的蛋白的灰度值除以内参 GAPDF 的灰度值以校正误差，所得
结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
8. 提供实验报告，包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关数据。
western blot 费用：每张膜上做一种目的蛋白和相应的内参蛋白。每张膜上可以做 8 个样
品。每张膜的费用是：1500.00 元。一抗另计，其它试剂免费，一抗订购时间约为 3 周。Western Blot相关试剂
产品名称包装单价(RMB)
Trypsin-EDTA 0.25%,100ml150.00蛋白裂解液（蛋白提取液）10ml60.00
PMSF100mM 10ml86.00 40% Acr/Bis (37.5:1)100ml 100.00
40% Acr/Bis (29:1)100ml 100.00
40% Acr/Bis (19:1)100ml 100.00 SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液2x,1ml 28.00 SDS-PAGE 电泳缓冲液10x,500ml100.00
蛋白胶快速染色液100ml 120.00
蛋白转移缓冲液10x,500ml 100.00可逆型转移膜染色液100ml 120.00 Tris-HCl Buffer,PH6.8(配浓缩胶）0.5M, 250ml100.00 Tris-HCl Buffer,PH8.8(配分胶） 1.5M, 250ml100.00 PBS buffer20x,500ml100.00
PBST buffer 20x,500ml 100.00
TBST buffer 20x,500ml 100.00
TBS buffer20x,500ml100.00 SDS10%,100ml100.00洗脱抗体缓冲液(膜再生液）100ml 100.00二抗-HRP 0.2mg 175.00 预染 Marker（20~120kDa）250ul 200.00 ECL 化学发光试剂25ml200.00显影液250ml45.00
定影液250ml 45.00 硝酸纤维素膜 NC 膜15cm*20cm 60.00 PVDF 膜13.5cm*15cm80.00
3MM 滤纸27cm*1M40.00
X 线暗盒5*7int.600.00
柯达 X 光胶片5*7int. 100/pk 200.00 乳胶手套100/pk 65.00
PE 薄膜手套100/pk 5.00
(完整word版)WB原理、步骤及总结,推荐文档
实验原理 蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液 10%分离胶 水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL 5%浓缩胶 水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL 1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液 Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L 2×SDS凝胶加样缓冲液 Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液 Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1L TBST Tris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1L Stripping 1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤 1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
WesternBlot原理和操作方法(全)讲解
Western Blot 原理和操作方法（全） Western Blot 工作原理 蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol 的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广旱挠τ? SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量. PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS 变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基. 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳. 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品溶液可以沉入样品加样槽底部. 重要参数 ①聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数.一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m*100%; 和C%=a/(a+b)*100% 其中: a=双体(bis)的重量;b=单体(arc)的重量;m=溶液的体积(ml) ②当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成4-10的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度.如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜的凝胶浓度(%) <104 20-30
WB的原理、操作及注意事项
WB的原理、操作及注意事项 原理： 通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1?5ng （最低可到10- 100pg）中等大小的靶蛋白。 一、抗原的选择和制备 A：样品的制备 1 组织： 组织的处理方法：组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS0C研磨，加入5X STOFbuffer , 180W6mins , 0C 超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。 2 细胞： 细胞的处理方法：离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入 5 x STOPbuffer，收集， 180W6mins , 0C超声波破碎，5000rpm,5mins 离心，取上清。加入B -ME（9.5ml 加入0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，用时取出，直接溶解上样。3 分泌蛋白的提取（特例）： 直接收集分泌液，加入B -ME、溴酚蓝制样。 B:蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因 1. 双缩脲法： 双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。双缩脲法常用于0.5g/L ?10g/L 含量的蛋白质溶液测定。干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%^的三 氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量 测定。 2. Lowry 法： 此法是双缩脲法的进一步发展。他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性 溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深 蓝色物。此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L?400mg/L 含量的蛋白质溶液。其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上 述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液 中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络 合物所还原。 3. 紫外吸收法： 大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1?0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。有核酸时，所测得的蛋白质浓度必须作适当校正，一般按下述公式粗略计算： M 白虜浓皮（m”/mi）—1 ” 55A”? - 0.76 \ m 280 260
WB实验原理
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理 1．SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅可以分离蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质亚基的分子量。 2．Western 印迹 在Western印迹法中，待测样品溶解于去污剂和还原剂的溶液中，经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后被转移到固相支持物上（常用硝酸纤维素滤膜），然后可被染色。随后滤膜可与抗靶蛋白的一抗反应。最后，结合上的抗体可用多种二级免疫学试剂（与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的A蛋白或抗免疫球蛋白）检测。Western 印记法可测出1-5ng中等大小的待检蛋白。 方法 1.样品的制备 从细胞中提取蛋白质样品用于Western印记的方法有两种，一是可以在加样缓冲液中直接溶解完整细胞；二是制备细胞提取液。可根据不同的目的采用不同的方法。如果仅是定性实验，可应用第一种方法；如果需测定蛋白含量并进行定量实验，可应用后一种方法。1.1 凝胶加样缓冲液裂解哺乳动物细胞和组织制备蛋白质样品 1）裂解细胞或组织 a.单层培养细胞：用PBS缓冲液漂洗细胞2次，弃去洗液并吸尽残余的PBS液体， 加入一定体积（50～200μl）的加热到85℃的1×SDS凝胶加样缓冲液[50mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 100mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝，10%甘油] 溶解细胞，用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物收集于一个微量离心管中，用于步骤2）。 b.悬浮培养细胞：用冷的PBS充分洗涤细胞后，去尽残液，加入一定体积用冰预冷 的悬浮缓冲液[0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris.Cl（pH 7.6），0.001mol/L EDTA （pH 8.0），1μg/ml Aprotinin，100μg/ml PMSF]，涡流振荡混匀后，加入等体积的2×SDS凝胶加样缓冲液[100mmol/L Tris.Cl(pH 6.8), 200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）, 4% SDS, 0.2% 溴酚蓝，20% 甘油]，混匀后，用于步骤2）。
WB实验基本步骤
实验基本步骤 提取细胞蛋白 ↓ BCA定量 ↓ 制备蛋白胶(SＤS-PAGE胶) ↓ 蛋白样品变性 ↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ ＴBＳT洗涤 ↓ 二抗 ↓ TBST洗涤 ↓ 显影 ↓ 结果分析
试剂配制 １。PBS磷酸盐缓冲溶液1L 磷酸二氢钾0、24g 磷酸氢二钠 1.44ｇ 氯化钠 8ｇ 氯化钾 0。2g 加入50０mｌ纯水,调PH=7、2 定容至1L,高压蒸汽灭菌 ２。PBST(PBS+０、05%吐温—2０) 5０0ｍｌPBS+0。２5ml吐温-２0 3。电转液50０mｌ Ｔris １。5g 甘氨酸 7。2ｇ ４０0ｍl水溶解 加入100ml甲醇,置于4℃冰箱预冷 ４.电泳液(1Ｘ) 1０x稀释,５０ｍl1０ｘ电泳液+450ml纯水 5.TBS 6。TBST(TBＳ+0。05%吐温－20) 5０ｍlＴBS+４50ｍl纯水+0.25ml吐温-2０
7、封闭液 ＴＢＳT1X＋５%奶粉 4０ml封闭液=4０mlTBST＋２g奶粉,40℃预热 ＷB实验 一、蛋白样品制备 准备:一管细胞,PBＳ(４℃预冷),PMSF(1０0ｍM),移液枪(1０00ul,１0ul),1、5ｍlEＰ管2个,高速冷冻离心机4℃预冷 1.于—2０℃冰箱中取出一管细胞样品,吸去培养液 2.加入1mｌ4℃预冷得PBS(0、0１M ｐＨ７。２～７、3)。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4℃,８0００r离心５ｍin,然后弃去上清、重复以上操作一次,共洗细胞两次以洗去培养液。 3、按1ml裂解液加10 μlＰMSＦ(100 mM),摇匀置于冰上。(ＰMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。) ４.在样品中加入3００ul含PMＳF得裂解液,吹匀,于冰上裂解30 ｍｉn,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动、 5.裂解完后,于4℃下1２000 rpm离心5 miｎ。 7.将离心后得上清分装转移倒0。5 ml得离心管中放于－20℃保存、 二、蛋白含量得测定(BCＡ定量) 准备:96孔板,移液枪(10０0uｌ,10ul,２00ul),ＢCA工作液(A+Ｂ),５０mlＥＰ管,１xPＢS,BＳA标准液 1.将９6孔板分好区域,若不够分则只做两个重复,(外围一圈得孔最好不用) 2.算好孔数(总得)每孔加２0０ｕlBCA工作液(Ａ+B),(A液:B液＝50:1,一般配多些,如６０孔,A液12000ｕl,B液2４0ｕl) 3.将样品稀释到一定倍数才能定量,(10倍,20倍,30倍),每孔需要20uｌ样品(2uｌ样品+１8ulPBS,即稀释10倍),
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
WB实验步骤详解
Western实验步骤 ????Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) ????可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的。 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(///)。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的。 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 (3) 上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用。
WB实验步骤详细总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行） 1. 裂解 1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天4℃解冻） 取2ml 裂解液，加20μlPMSF 混匀 2) 称取30mg 组织，切碎放入标记好的AP 管中，加入600μl 上述1中液体（加入液 体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2. 匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s ，两次（间隔5s ），冰上静置30min 3. 离心（在基础4楼416室） 1) 自带1ml 枪以及蓝枪头和黄枪头，三个的离心管（①，②两个标记，③加少量超 纯水，③号是为了离心平衡，对称放置） 2) 将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min 离心15min 3) 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1） 将样品转移至2~3个管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕： 5. 保存 变性结束 AP 管盖放一然后4℃1. 清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对 齐，以免漏胶。 2. 配制分离胶 1) 准备：1ml 枪（蓝色枪头），200μl 枪（黄色枪头）10μl （白色枪头） 2) 10%分离胶的配置：（用50ml 烧杯。板配块胶，板配2块板） 混合摇匀（用移液枪抽吸混匀液体，不要将液体完全打出防止气泡） 3. 灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止 4. 水封
WB操作原理以及流程细节.pdf
WB实验的基本原理及操作流程 【实验原理】 一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。因此检测蛋白质是测定基因表达的主要 标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的 蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决 定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。本法所需时间6小时或过夜。 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单 个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。在达到饱和的状态下， 每克多肽约可结合 1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩 于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。 最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含 Tris-Cl(pH8.8)的。系统中所有组分都含有0.1％的SDS(Laemmli, 1970)，样品和积层胶中的氯离干形成移动界面的先导边界而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位滴度较陡的区域，它推动样品中的多肽前移并在分离胶前沿积聚，此处pH值较高，有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的多肽并紧随氯离子之 后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS多肽复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。 【常用试剂】 1)30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺
WB实验步骤详细总结
WB实验步骤详细总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行） 1.裂解 1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF 在-20℃保存，提前一天4℃解冻） 取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀 2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2.匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min 3.离心（在基础4楼416室） 1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）
2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min 离心15min 3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4.变性（上样缓冲液：样品=4：1） 将样品转移至2~3个0.5mlAP管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕： S5 00：10 S5 100．0 00：10 温度时间（时： 5.保存 变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用 WB实验步骤
1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。 2.配制分离胶 1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头） 2)10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板） 5.91ml 超纯水 4.95ml 丙烯酰胺（30%）避光保存极易失效 3.75ml Ph8.8Tris?HCL 10%SDS 150μl AP（催化剂促凝作用） 150μl TEMED 9μl 3.灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml 移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封
最详细的Western Blot过程步骤详解
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 5.Marker的相关疑问 6.染色的选择
参照的疑问7. 8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，
WB原理步骤及总结
WB原理、步骤及总结 实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。 SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。 因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。 电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。 方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。
固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。 蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S 检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。 用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为 4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。 主要溶液10%分离胶水3.3mL、30%丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/LTris（pH8.8）2.5mL、10%SDS0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED0.004mL5%浓缩胶水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液 0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵 0.04mL、TEMED0.004mL1×Tris–甘氨酸电泳缓冲液Tris碱 3.03g、甘氨酸18.77g、SDS1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液Tris2.45g，甘氨 酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTris1.21gNaCl8.77g，Tween-201mL，加去离子水至1LStripping1.3mLTris（pH6.8）， 4mL10%SDS，140μlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL实验步骤 1SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配
WB实验步骤详细总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行） 1.裂解 1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻） 取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀 2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液 体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2.匀浆 先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min 3.离心（在基础4楼416室） 1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量 超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置） 2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min 3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4.变性（上样缓冲液：样品=4：1） 将样品转移至2~3个0.5mlAP管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕： 5.保存 变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用
WB实验步骤 1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对 齐，以免漏胶。 2.配制分离胶 1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl枪（黄色枪头）10μl（白色枪头） 2)10%分离胶的配置：（用50ml烧杯。1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板） 3.灌胶 沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止 4.水封 立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30min 5.浓缩胶的配制（5%）
WB实验步骤
蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。
WB操作步骤及经验
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v) 丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O 至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/L Tris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml 终体积。过滤后4°C保存。 4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调 至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后4°C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL 调节PH值，而不用Tris.CL。 5、TEMED原溶液四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时， 聚合反应受到抑制。AP提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制. 6. 10%过硫酸铵溶液：称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管 中，冻存。 7、SDS-PAGE加样缓冲液:在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。 8、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，临用前稀 释10倍。PH8.3 9、转移缓冲液：2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS（可不加），200ml甲醇（临用前加），加水 至总量1L。 10、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存 液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。 11、脱脂奶粉5%(w/v)。 12、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。 4.2.4 22. 聚丙烯酰胺凝胶溶液： 分离胶12.5% , PH8.8 5ml 10ml 15ml 超纯水 1.5ml 3.0 ml 4.5 ml 30%丙烯酰胺溶液 2.1 ml 4.2 ml 6.4 ml pH8.8、1.5mol/L Tris溶液 1.3 ml 2.6 ml 3.8 ml 10%SDS 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml TEMED 0.002ml 0.004 ml 0.006 ml 10%过硫酸铵 0.05ml 0.1 ml 0.15 ml 浓缩胶：5% ，pH6.8 2 ml 4 ml 6 ml 超纯水 1.4 ml 2.8 ml 4.1 ml 30%丙烯酰胺溶液 0.3 ml 0.6 ml 1.0 ml pH6.8、1.0mol/L Tris溶液 0.25 ml 0.5 ml 0.75 ml 10%SDS 0.02 ml 0.04 m 0.06 ml TEMED 0.002 ml 0.004 ml 0.006 ml 10%过硫酸铵 0.02ml 0.04ml 0.06ml 一．配胶 1．注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
WB实验步骤详解
Western实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western 可以参考如下步骤进行操作。 1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation) 可以使用适当的裂解液，例如碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)、RIPA裂解液等，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提，例如碧云天生产的细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(P0028)。 收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液或RIPA裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0009/P0010/P0011/P0012)。 2. 电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制 SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(P0012A)。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。 (2) 样品处理 在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以参考相关文献资料配制，也可以使用碧云天生产的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)(P0015)。 100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。 (3) 上样与电泳 冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。 为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准(P0066)。电泳时电泳液可以使用碧云天生产的SDS-PAGE电泳液(P0014A/P0014B)。 电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。SDS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，也可以采用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90－120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。 3. 转膜(Transfer) 我们推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP30/FFP33)。硝酸纤维素膜(NC膜)(FFN06/FFN09)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。 通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。转膜时也可以使用碧云天的多功能电泳仪(带定时)(EEP102)。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。 在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。 转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤 Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 1、甲醇活化PVDF膜10min 原理：PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。大于20000的蛋白选
用0.45um的膜，小于20000的蛋白选用0.2um的膜。PVDF膜在使用时需预处理，用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。 2、制备1xtransferbuffer（冰上保存） 10xtransferbuffer：tris 30.3g+Glycine144g+ddH20到1L 11xtransferbuffer：100ml10xtransferbuffer（一般都放在冷室里）+100ml甲醇（一般都在通风橱）+800mlddH20 3、关闭电源，取出胶，切去不用的区域，并在左上角做标记（目的是标记第一个条带的上方。分不清楚的话看marker颜色也行，第一条marker加的8ul，颜色浓。），同时立刻清洗玻璃板，留给下一个人一块干净的玻璃板。 4、在玻璃盒中加入转膜buffer，做三明治（黑底在下）：海绵-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵 注意：不要有气泡！不要将胶放干！