鸡传染性法氏囊病病毒gt 株感染性分子克隆的构建

中国农业科学 2007,40(10):2343-2349 Scientia Agricultura Sinica

收稿日期：2006-06-15；接受日期：2006-09-26 基金项目：国家“973”项目（2005CB523202） 作者简介：祁小乐（1980-），男，河南宜阳人，博士研究生，研究方向为动物病毒学。Tel ：0451-********；E-mail ：xiaoleqi973@https://www.wendangku.net/doc/6c13014448.html, 。通讯作

者王笑梅（1962-），女，博士生导师，研究方向为禽病病原学。Tel ：0451-********；Fax ：0451-********；E-mail ：xmw@https://www.wendangku.net/doc/6c13014448.html,

鸡传染性法氏囊病病毒Gt 株感染性分子克隆的构建

祁小乐，高宏雷，高玉龙，邓小芸，步志高，王晓燕，王笑梅

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，哈尔滨150001）

摘要：【目的】建立高效鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）拯救平台，为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】在IBDV Gt 株全基因组中引入分子标签（A 节段：Eco R V 酶切位点；B 节段：Pst I 酶切位点）。在基因组两端分别引入锤头状核酶结构（HamRz）和丁肝病毒核酶结构（HdvRz)。将带有分子标签和核酶结构的IBDV 基因组插入载体pCAGGS 的β肌动蛋白启动子下游，构建IBDV 感染性克隆pCAGGmGtAHRT 和pCAGGmGtBHRT，Lipofectamine TM 2000介导共转染DFI 细胞，进行病毒拯救研究。 【结果】 构建的IBDV 感染性克隆可在DFI、Vero/E6、Vero/P12等3种细胞上高效拯救出病毒。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的IBDV，且存在分子标签。拯救毒在CEF 上能产生特有的砂砾状CPE，且TCID 50与亲本毒差异不显著，具有相似的生物学特征。【结论】构建的RNA 聚合酶ⅢBDV 拯救系统高效、稳定、简便、经济，且具有良好的细胞普适性。

关键词：传染性法氏囊病病毒；感染性分子克隆；病毒拯救；分子标签；核酶

Development of Infectious Molecular Clones in Infectious Bursal

Disease Virus Gt Strain

QI Xiao-le, GAO Hong-lei, GAO Yu-long, DENG Xiao-yun, BU Zhi-gao,WANG Xiao-yan, WANG Xiao-mei

(Division of Avian Infectiouss Diseases, National Key Laboratory of Veterinary Biotechnology, Harbin Veterinary Research Institute,

Chinese Academy of Agricultural Sciences, Harbin 150001)

Abstract:【Objective 】The aim of the study was to develop a reverse genetics platform of infectious bursal disease virus (IBDV), which is a base for the construction and function researches of viruses.【Method 】EcoR V site or Pst I site genetic tags, was introduced separately into segment A or B of the IBDV Gt strain. The fμll-length genome was flanked by a hammerhead ribozyme (HamRz) and hepatitis delta ribozyme (HdvRz) sequence. The fμll-length genome containing genetic tags flanked by HamRz and HdvRz were arranged downstream of the beta chincken actin promoter of the vector pCAGGS. The recombinant plasmids, pCAGGmGtAHRT and pCAGGmGtBHRT, were transfected into DF1, Vero/E6, Vero/P12 cells to research reverse genetics of IBDV.【Result 】The infectious clones can infect DFI,Vero/E6,Vero/P12 cells effectively.The results of the RT-PCR, indirect immunofluorescence, electron microscope showed IBDV was rescued successfμlly. The genome of rescued IBDV has genetic tags. The rescued IBDV could cause CPE on CEF, and the TCID50 of rescued IBDV was similar to Gt.【Conclusion 】The RNA polymerase II-based reverse genetics system for IBDV developed in this research is efficient, stable, convinent, and fit to various cells.

Key words: Infectious bursal disease virus; Infectious molecular clones; Virus rescue; Genetics tags; Ribozyme

0 引言

【研究意义】鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus ，IBDV ）引起的鸡传染性法氏囊病

（infectious bursal disease ，IBD ）是一种危害鸡的急性、高度接触性传染病[1]。IBDV 属双RNA 病毒科（Birnaviridae ）禽双RNA 病毒属（Avibirnavirus ），主要侵害鸡的体液免疫中枢器官法氏囊，淋巴细胞（尤

2344 中国农业科学40卷

其是B淋巴细胞）是其主要的靶细胞，从而导致免疫抑制[2]。继经典株、变异株之后，20世纪90年代初出现了毒力大大增强的超强毒株（vvIBDV），对鸡的致死率高达70%以上[3,4]。该病在中国的流行十分复杂，已成为动物病毒研究领域的热点之一[5]。IBDV属非反转录RNA病毒，在其生命过程中不经历DNA 阶段，其基因结构与功能研究必须借助反向遗传（reverse genetics）操作平台[6]。【前人研究进展】自Mundt等于1996年在世界上首次拯救出IBDV[7]以来，IBDV 基因功能、致病机制、免疫抑制机制、毒力和细胞嗜性的分子基础等研究取得了可喜进展[8~14]。中国关于IBDV的基础研究刚刚起步[15,16]。迄今用于IBDV拯救的方法有3类。体外转录拯救系统步骤繁杂；随后发展的通过直接转染病毒全基因组cDNA来拯救IBDV 的方法[17~19]，虽然避开了RNA转染的种种弊端，但需要额外提供T7 RNA聚合酶来启动病毒cDNA的体内转录；Lim等[20]建立的RNA聚合酶Ⅱ拯救系统，方便快捷，但在设计上没有考虑病毒基因组的精确转录问题。【本研究切入点】本研究通过沉默突变的方法在IBDV Gt株全基因组中成功引入分子标签；用Multi PCR的方法在基因组两端引入了锤头状核酶结构（hammerhead ribozyme，HamRz）和丁肝病毒核酶结构（hepatitis delta ribozyme，HdvRz）。将带有分子标签和核酶结构的IBDV基因组插入载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游，构建了感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT，共转染多种细胞均可拯救出IBDV。【拟解决的关键问题】IBDV 高效拯救平台的建立为从分子水平上深入研究该病毒的基因功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞与单克隆抗体

IBDV Gt株，DFI、Vero/E6、Vero/P12细胞由哈尔滨兽医研究所免疫抑制病课题组保存；原代鸡胚成纤维细胞（CEF）由本课题组用SPF鸡胚常法制备；抗IBDV VP2单克隆抗体由本课题组制备。

1.2 质粒和菌种

重组质粒pUC18GtA和pUC18GtB（分别克隆有IBDV Gt株全基因组的A节段和B节段）由哈尔滨兽医研究所免疫抑制病课题组构建；真核表达载体pCAGGS由哈尔滨兽医研究所步志高研究员馈赠；Top10F’菌种由本课题组保存。

1.3 工具酶与主要试剂

各种限制性内切酶、PrimeSTAR TM HS DNA Polymerase 、dNTP等购于Takara（大连）公司；DpnI 为NEB公司产品；Plasmid Midi Kit为QIAGEN产品；Lipofectamine TM2000为Invitrogen产品；Opti-MEM I Medium为GIBCO产品；FITC Conjugate anti-mouse IgG为Sigma产品。

1.4 引物设计与合成

用于在IBDV全基因组内部引入分子标签（限制性酶切位点）和在全基因组两端引入核酶结构的引物见表1，由英俊生物技术有限公司（invitrogen）合成。

表1 引入分子标签和核酶结构所用的引物

Table 1 Primers for genetic tags and ribozyme sequence

引物 Primer 序列 Sequence 位置 Position (bp)

P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8 P9 P10 P11 P12 P13 GACACACGGAT A TCAAAGAAGATGGAGACCATG

CATGGTCTCCATCTTCTTTGA T ATCCGTGTGTC

CAAGAAGCCGTCTGCA G GATGCAGTTAAG

CTTAACTGCATC C TGCAGACGGCTTCTTG TGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCGGATACGATCGGTCTGAC CGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCGGGGACCCGCGAACGGATC ATTAATCGATTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAG GAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAG ATTAGGTACCCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTC TGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCGGATACGATGGGTCTGAC CGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCGGGGGCCCCCGCAGGCGAA ATTAGAGCTCTGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAG ATTACTCGAGCGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTC

2693～2725

2693～2725

2330～2358

2330～2358

-36～18

3242～+35

-58～-15

+16～+69

+48～+88

-36～18

2809～+35

-58～-15

+48～+88

P1、P2、P5、P6、P7、P8、P9和P3、P4、P10、P11、P12、P13参照毒株分别为IBDV Gt株A节段（GenBank登录号为DQ403248）和B节段（GenBank 登录号为DQ403249）。下画线部分为核酶结构序列，方框部分为引入的酶切位点，其中斜体的为突变碱基

The positions where the primers P1、P2、P5、P6、P7、P8、P9 and P3、P4、P10、P11、P12、P13 bind are in accordance with the published sequence of strain Gt (Assession number of GenBank: DQ403248 and DQ403249). The ribozyme sequence and restriction sites were highlighted by underline or boxes respectively. The mutated nucleotides were shown in italitics

10期祁小乐等：鸡传染性法氏囊病病毒Gt株感染性分子克隆的构建 2345

1.5 分子标签引入

以pUC18GtA作模板，用PrimeSTAR TM HS DNA Polymerase通过PCR的方法在A节段上引入分子标签Eco RⅤ限制性酶切位点，所用引物是P1和P2。然后用DpnⅠ降解PCR产物中被甲基化模板pUC18GtA，将处理过的PCR产物转化感受态细胞Top10F’，提取并筛选阳性质粒。采用类似方法在B节段上引入分子标签PstⅠ，所用模板和引物分别是pUC18GtB、P3/P4。用Eco RⅤ、PstⅠ分别酶切鉴定在A、B节段引入分子标签的阳性质粒（分别命名为pmGtA和pmGtB）。将pmGtA和pmGtB送英俊生物技术有限公司（invitrogen）测序，分别测3个克隆。

1.6 核酶结构引入

采用PrimeSTAR TM HS DNA Polymerase通过多重PCR（Multi-PCR）分3步在基因组A节段的5′端引入HamRz（58 bp），在3′端引入HdvRz（88 bp）。第一步PCR以pmGtA为模板，下一步PCR以上一步PCR产物为模板，三步所用的引物分别是P5/P6、P7/P8、P7/P9，将最终PCR产物命名为mGtAHRT。用同样方法在B节段两端引入核酶结构。第一步PCR 以pmGtB为模板，三步所用的引物分别是P10/P11、P7/P12、P7/P13，将最终PCR产物命名为mGtBHRT。

1.7 感染性分子克隆的构建

用ClaⅠ和KpnⅠ分别处理mGtAHRT和真核表达载体pCAGGS，并将其连接、转化，酶切鉴定阳性质粒（命名为pCAGGmGtAHRT）。用SacⅠ和SphⅠ分别处理mGtBHRT和真核表达载体pCAGGS，连接、转化后，酶切鉴定阳性质粒（命名为pCAGGmGtBHRT）（图1）。选pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT 各3个克隆送英俊生物技术公司（invitrogen）测序。

图1 重组载体PCAGGmGtAHRT和PCAGGmGtBHRT示意图

Fig. 1 Schematic diagram of PCAGGmGtAHRT and PCAGGmGtBHRT

1.8 转染

用QIAGEN Plasmid Midi Kits制备纯化重组质粒pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT。各取2μg转染级质粒，由Lipofectamine TM2000（Invitrogen）介导转染DFI细胞（培养面积10 cm2，单层细胞生长至70%）。同时设立阴性对照（空载体pCAGGS）、脂质体对照和正常细胞对照。转染后12 h吸去细胞上清，用Hanks液洗细胞3次，加入2 ml DMEM（含10%PAA 胎牛血清和100 U·ml-1双抗）置37℃ CO2继续培养。转染后72 h收获病毒，反复冻融3次后连续在CEF 上传代。

1.9 病毒粒子鉴定

1.9.1 RT-PCR及分子标签鉴定用RNeasy Mini Kit（QIAGEN）按说明书从第4代细胞毒中提取RNA，然后用SuperScrime TM III Reverse Transcriptase （invitrogen）进行反转录。用PrimeSTAR TM HS DNA Polymerase扩增IBDV全基因组，A、B节段用的引物分别是P5/P6、P10/P11。将PCR产物送英俊生物技术公司（invitrogen）测序。

1.9.2 间接免疫荧光将第4代细胞毒常法接种CEF（单层细胞生长至50%），12 h后按常规方法作间接免疫荧光，所用一抗为抗IBDV VP2单克隆抗体，二抗为FITC Conjugate anti-mouse IgG。同时设阴性血清对照、不接毒细胞对照。

1.9.3 电镜检查将收获的第4代细胞毒反复冻融3次，3 000 r/min离心10 min，取其上清12 000 r/min 离心10 min，适量TNE重悬沉淀，负染后电镜观察。

1.9.4 TCID50测定取第4代毒按Reed-Muench法进行TCID50滴定，做3个平行重复，同时做Gt株病毒对照。

2 结果与分析

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2.1 感染性分子克隆的构建

Multi-PCR 产物mGtAHRT 和mGtBHRT ，与预期大小（3 426 bp 和2 993 bp ）相符（图2）。阳性重组质粒的酶切鉴定结果如下：Cla Ⅰ和Kpn Ⅰ均能将pCAGGmGtAHRT 切成约8 152 bp 的片段，Cla Ⅰ/ Kpn Ⅰ双酶切将pCAGGmGtAHRT 切成约4 700 bp 和3 400 bp 的片段，与预期大小相符（图略）。Sac Ⅰ和

M. DNA 分子量标准；1. mGtAHRT PCR 产物；2. mGtBHRT PCR 产物 M. 1 kb DNA ladder (10,8,6,5,4,3.5,3,2.5,2,1.5,10.75,0.5, 0.25 kb); 1. PCR products of mGtAHRT; 2. PCR products of mGtBHRT

图

2 带有分子标记和核酶结构的

Gt 株全基因组PCR 产物 Fig. 2 PCR products of the genome of Gt including gene-tag

and rebozyme

Sph Ⅰ均能将pCAGGmGtBHRT 切成约7 719 bp 的片段，Sac Ⅰ/Sph Ⅰ双酶切将pCAGGmGtBHRT 切成约4 700 bp 和3 000 bp 的片段，与预期大小相符（图略）。阳性重组质粒pCAGGmGtAHRT 和pCAGGmGtBHRT 的测序结果也显示，基因组除了引入的分子标签外，无其它任何突变：GtA 因C2704A 而在A 节段中引入了EcoR V 酶切位点（GATCTC ），GtB 因A2346G 而在B 节段中引入了Pst Ⅰ酶切位点（CTGCAG ）。基因组两端引入的核酶结构正确，分别为HamRz （58 bp ）：5′TGT TAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGA- CGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTC3′和HdvRz （88 bp ）：5′ GGGTCGGCATGGCATCTCCACC- TCCTCGCGGTCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGG-

ACGCACGTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG 3′。

2.2 病毒粒子鉴定

2.2.1 在CEF 上的CPE 重组质粒pCAGGmGtAHRT 和pCAGGmGtBHRT 共转染的DFI 细胞在转染后48 h 出现病变并逐渐加剧，脂质体对照孔的细胞也有类似CPE 。从第二代开始，转染阳性质粒的细胞上清在每次传代时均出现典型的CPE （细胞团聚、碎裂但不悬浮，折光性增强，呈砂砾状）：24 h 开始有CPE ，48 h 更明显，72 h 病变程度可达95%以上（图3）。转染脂质体的对照组细胞从第二代开始不再出现CPE 。

左. CEF 细胞被拯救毒感染后引起的CPE ；右. 正常状态CEF 细胞

Left. CPE occurred on CEF culture infected with rescued IBDV; Right. Normal CEF culture

图3 IBDV 拯救毒在CEF 上引起的CPE

Fig. 3 CPE occurred on CEF cμlture infected with rescued IBDV(20×)

2.2.2 RT-PCR 及分子标签测定 拯救毒第4代RT-PCR 分别得到了约3 200 bp 或2 800 bp 左右的条带，与IBDV A 节段和B 节段大小一致（图略）。测序

结果显示，基因组除了引入的分子标签外（A ：C2704A ：Eco RV ，B ：A2346G ：Pst I ），与亲本毒Gt 株基因组完全一致（图4）。

1 M 2

3426 bp

2993 bp

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左. 分子标签Eco R Ⅴ；右. 分子标签Pst Ⅰ（下划线部分为分子标签，黑三角为相应的突变位点）

Left. genetic tag Eco RV; Right. genetic tag Pst Ⅰ(The genetic tags and mutated sites were highlighted by underline or blank tringle respectively)

图4 分子标签序列 Fig. 4 Sequence of genetic tags

2.2.3 间接免疫荧光 抗VP2单克隆抗体介导的间接免疫荧光检测拯救毒第4代，可见到绿色特异性荧 光，而阴性血清对照和正常细胞对照无可见荧光（图5）。 2.2.4 电镜检查 电镜下可以观察到直径60 nm 左

左. 拯救的IBDV ；右. 阴性血清对照

Left. Rescued IBDV; Right. Negative serum control

图5 间接免疫荧光检测拯救毒在CEF 上的复制

Fig. 5 Detection the Replication of rescued IBDV on CEF with indirect Immunofluorescence (20×)

右、无囊膜的病毒粒子存在，这与IBDV 特有的形态结构一致（图6）。

图6 电镜下的IBDV 拯救毒粒子

Fig. 6 Rescued IBDV under electron microscope (50 000×)

2.2.5 TCID 50测定 Reed-Muench 法对拯救毒第4代滴定的结果是：TCID 50为10-5.2/100 μl ，这与同时滴定的Gt 株毒（TCID 50为10-5.5/100 μl ）在一个数量级上。

3 讨论

3.1 RNA 聚合酶Ⅱ病毒拯救系统

国外构建IBDV 感染性克隆大多是将基因组克隆在T7启动子下游[7,17,21]，需要体外转录[7,17]或额外提供T7 RNA 聚合酶[21]，操作繁琐。最近，RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ）拯救系统在狂犬病病毒[22]、

麻疹病毒[23]、博尔纳病病毒[24]的反向遗传研究中均获得了成功。RNA polymerase Ⅱ有良好的校正功能，错配率相对较低。最近的研究结果显示，病毒基因组RNA 的表达效率与病毒拯救效率呈正相关。

RNA

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polymeraseⅡ启动子能够促进病毒基因组的表达进而将博尔纳病病毒的拯救效率提高近20倍[24]。Kenichi 等关于狂犬病的反向遗传研究也显示，RNA polymeraseⅡ启动子也比传统的T7 RNA聚合酶效率更高[22]。1999年，Lim等将经过基因修饰的vvIBDV HK46毒株的基因组克隆到真核表达载体pALTER-MAX CMV启动子的下游进而获得了病毒的拯救[20]。然而，该感染性克隆的设计没有很好地考虑病毒基因组的精确转录问题。本研究首次将核酶结构HamRz和HdvRz引入IBDV Gt株全基因组两翼，然后将引入分子标签和核酶结构的全基因组cDNA插入真核表达载体pCAGGS的β肌动蛋白启动子下游，构建了IBDV感染性克隆pCAGGmGtAHRT和pCAGGmGtBHRT。将这两个感染性克隆共转染DFI 细胞，借助RNA聚合酶Ⅱ系统，成功拯救出了IBDV。与转染RNA相比，直接转染DNA方便快捷。对拯救毒进行检测，单克隆抗体介导的间接免疫荧光显示阳性，电镜下也能观察到IBDV粒子。测序结果显示，除独特的分子标签外，拯救毒基因组与Gt株基因组完全一致。拯救毒在CEF上能产生IBDV特有的砂砾状CPE，且TCID50与Gt株差异不显著，说明拯救毒与亲本毒有相似的生物学特征。

3.2 分子标签的引入

全基因组中分子标签的引入是拯救毒区别于亲本病毒的有力证据。本研究设计了一套高效、快捷的沉默突变方法，仅需一次PCR即可引入感兴趣的突变或缺失，与传统的融合PCR法介导的突变方法相比，更简便适用。经序列分析，IBDV Gt株A节段基因中不存在EcoR V酶切位点，该位点也不存在于减毒株CEF94、D78、P2、HZ2、JD1、Edgar、CT和超强毒株Gx、BD399、UK661、D6948、HK46等的基因中。IBDV Gt株B节段基因中不存在PstⅠ酶切位点，该位点也不存在于减毒株CEF94、P2、HZ2、JD1、Edgar、CT和超强毒株Gx等的基因中。故选择EcoR V酶切位点和PstⅠ酶切位点作为IBDV Gt株全基因组的分子标签。

3.3 基因组的完整性

基因组的完整性对病毒拯救效率有重大影响[25]。本研究运用Mμlti-PCR分三步将顺式作用元件HamRz 和HdvRz的cDNA分别引入IBDV Gt株全基因组（A 节段和B节段）cDNA的两端，实现了从转录水平上控制IBDV基因组的完整性。关于重组质粒转录的正确终止，研究者做过很多尝试。世界上首例IBDV拯救是依靠转录本3′端引入的单酶切位点来解决这一问题的[7]。核酶结构的引入，更使这一难题得到了近乎完美的解决。核酶的本质是一种具有剪切酶活性的RNA。核酶HamRz核心序列共有58个核糖核酸，自我剪切位点在其3′末端C处；HdvRz共有88个核糖核酸，自我剪切位点在其5′末端G处。Hei J Boot在做IBDV的反向遗传研究时就将HdvRz引入基因组的3′末端[15,17~19]，但在IBDV基因组5′末端引入核酶结构尚未见报道。

3.4 影响病毒拯救的其它因素

除了重组载体的构建，还有很多因素影响病毒拯救效率。首先是转染用的质粒质量，最好选用转染级别的质粒提取试剂盒。本研究选用QIAGEN公司的Plasmid Midi Kit，所提质粒超螺旋占多数，转染效率100%，远远高于其它方法提取的质粒。再者，筛选转染用的细胞也十分重要。病毒适应的细胞并不一定是最合适的转染细胞。本研究最开始转染原代CEF成功率甚低，后来转染DFI细胞获得了100%的拯救效率，这可能是原代细胞摄取外源核酸能力低的缘故。IBDV 在Vero/E6和Vero/P12上CPE不明显，但也获得了高效拯救。本研究建立的RNA聚合酶Ⅱ拯救系统稳定性良好，在3种细胞（DFI、Vero/E6、Vero/P12）上分3批作了20余次转染，均拯救出了IBDV。

4 结论

采用独特的策略，建立了IBDV 的 RNA聚合酶Ⅱ病毒拯救系统，该系统高效、稳定、简便、经济，具有良好的细胞普适性，不仅对IBDV毒力和细胞嗜性分子基础的深入研究有重要意义，也能为双RNA 病毒属其它成员的反向遗传研究提供参考。

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（责任编辑林鉴非）