蛋白质组
蛋白质组学论文
学号：2002009192
单位：研究生三队
姓名：靳志平
专业：肿瘤学
蛋白质组CD40-CD40L靶向DC细胞抗肿瘤免疫的研究进展
机体的免疫反应首先是由抗原递呈细胞(APC)捕获抗原，经过加工和处理后将抗原信息递呈给T、B淋巴细胞，继而引发一系列的特异性免疫应答。树突状细胞(DC)是目前认为体内功能最强的APC，其最大的特点是能够刺激初始型T细胞（Naive T cells）的增殖和活化，是启动、调控并维持特异性免疫应答的中心环节［1］。在机体抗肿瘤免疫中，由T细胞介导的细胞免疫发挥着重要作用。诱导T细胞肿瘤特异性免疫杀伤反应是目前肿瘤免疫研究中的重点。大量研究表明，CD40-CD40L介导的信号能够诱导APC的活化。后者在激活肿瘤特异性免疫杀伤T 细胞中发挥着重要作用：提供抗原刺激信号和第二信号，两者协同作用启动免疫级联反应，发挥肿瘤免疫功能。本文就近年来这一方面的现状作一概述。
1DC的生物学特性
DC是体内最重要的专职APC，其特点在于：①能合成大量的MHC-Ⅱ类分子；
②具有表达、摄取和转运抗原的特殊膜受体功能；③能有效摄取并处理抗原，然后迁移至T细胞区域，具有一个成熟化的过程；④能激活初始型T细胞；⑤少量的抗原和DC即足以激活T细胞，DC激活T细胞的能力是其他APC的100～10000倍；
⑥表达丰富的共刺激分子、黏附分子及高水平的TH1型应答主导因子IL-12［2］。
DC的分化发育过程与其由非淋巴器官经血液或淋巴向淋巴组织内的流入过程紧密相关。骨髓中的CD34 +造血干细胞发育为DC前体细胞（pDC）后，进入到外周血中，随血液分布于非淋巴组织如皮肤、胃肠道、呼吸道及实质器官如心脏、肾脏、脾脏中发育为未成熟树突状细胞，此时只表达低水平的免疫共刺激分子和黏附分子，体外激发混合淋巴细胞反应（MLR）的能力较弱，但其FCγ和FCε受体丰富、摄取和加工抗原及形成MHC-肽复合物的能力最强。未成熟的DC在炎性介质如LPS、IL-1β、TNF-α等及抗原作用下逐渐成熟，表现为捕获抗原的能力减弱，抗原提呈功能明显增强，特征性高表达MHC(Ⅰ类、Ⅱ类)分子、LFA-39（CD58）、ICAM-1（CD54）、CD40和CD80等免疫刺激分子，同时分泌一些重要的生物因子（如IL- 2、TNF-α等）。在成熟过程中DC同时发生迁移，在外周组织获取抗原信号后通过淋巴管迁移至T细胞富积的引流淋巴结内。在此处，DC将抗原递呈给抗原特异性的T淋巴细胞并分泌趋化因子和细胞因子来发挥其独特功能，即激活静息的T细胞，启动特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）免疫反应［3］。
2 CD40-CD40L的生物学特性及靶向DC的作用机制
2．1 CD40及CD40L的结构与分布
2．1. 1 CD40 的结构与分布
人CD40分子属于肿瘤坏死因子受体超家族（TNFR-SF）成员，是相对分子质量为48000的I型跨膜糖蛋白，其基因定位于20q11-13.2，cDNA长约115kd编码277 个氨基酸（AA），其中氨基末端193个AA构成胞外段，跨膜段含22个AA，胞浆段含66个AA。与TNFR家族其他成员一样，CD40分子的胞外段有四个富含丝氨酸的氨基酸重复序列（CRDs1-CRDs4），与CD40L结合的区域主要是CRD2和CRD3［4］。CRD1虽然不直接与CD40L结合，但却是CD40配基化所必须的，这可能与维持CD40正确的空间构像有关。CD40分子胞浆段虽短，但可以与多种信号转导分子结合介导多种信号转导通路。CD40主要表达于B细胞、胸腺上皮细胞、活化的单核/ 巨噬细胞、树突状细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞及一些肿瘤（如卵巢癌、鼻咽癌、膀胱癌、肝癌、腺癌、何杰金病、慢性淋巴细胞白血病、非何杰金B淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌）细胞等［5］。在胸腺里，CD40在皮质、髓质的上
皮以及胸腺间质细胞上表达。这些细胞在非疾病状态持续低水平表达CD40，当受炎性细胞因子如IL-1、IL-3、TNF-α、GM-CSF、IFN-γ等的刺激，这些细胞表达CD40的能力显著增强，且以IFN-γ刺激时，CD40表达上调最明显，并可刺激肿瘤细胞表达CD40。
2．1. 2 CD40L 的结构与分布
人CD40分子的天然配体CD40L，亦称CDl54，属于TNF家族，是相对分子质量为39000的II型跨膜糖蛋白，其基因定位于X染色体q26.13-q27.11，由261个氨基酸构成，胞浆区、跨膜区和胞外区分别由22、24和215个氨基酸残基组成，以三聚体的形式存在。CD40L分为可溶性及膜结合性两型，两型均可与CD40相结合后发挥生物学效应，可溶性CD40L（sCD40L）是由膜结合性CD40L水解而成。CD40L 表达谱广泛，主要表达在CD4+T细胞表面，包括Th0、Th1及Th2细胞亚群。近来研究表明，CD40L也表达在其他T细胞表面，如CD8+或CD45RO+/CD45RA+T细胞、
Tc1/Tc2细胞或B细胞表面［6］。实验表明，功能性的CD40L也表达在造血系中非淋巴细胞，如嗜碱/嗜酸性粒细胞、单核/巨噬细胞、Kupffer细胞、Nk细胞以及血小板细胞的表面。非造血系细胞，如肥大细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、树突状细胞以及上皮细胞表面都有表达［7］。与CD40相反，在非疾病状态下，CD40L并不表达。IL-1、IL-12、TNF-α、肾上腺糖皮质激素可诱导T淋巴细胞表达CD40L。IFN-γ及IL-4诱导淋巴细胞表达CD40L的观点一直没有确认，但CD40L与CD40结合后，CD40L的表达量却可升高，提示可能存在着旁分泌的反馈环。
2．2 CD40-CD40L的相互作用
CD40L与CD40分子结合后，能使膜CD40分子交联和配基化，继而使CD40分子多聚化，构成CD40信号传导的结构基础和始动因素。CD40/CD40L分子在特异性免疫应答中居于重要的上游位置，主要功能包括（1）促进B细胞的分化、发育、增殖、成熟，参与免疫球蛋白的分泌及类型转换；（2）促进T细胞的激发和定向分化；（3）参与DC的分化及功能调节［8］。鉴于CD40-CD40L在免疫反应中起重要作用，近年来在肿瘤免疫中的作用越来越受到重视。癌细胞株分泌CD40，通过CD40的刺激提高抗原呈递作用。CD40分子与活化的T细胞表面的CD40L相互作用，增强细胞毒的活性，增加细胞因子的释放，有效提高宿主的抗肿瘤免疫反应。CD40表达上调B7-l、B7-2、ICAM -I和LFA -4，这些分子分别与其配体CD28、IFA -1和CD2的相互作用使肿瘤细胞与活化的T细胞之间结合更稳定。由于CD40L在肿瘤免疫中的作用，因此在CD40L治疗中即是通过树突状细胞激活来提高肿瘤排斥的免疫反应，和通过上调上皮癌细胞表面的共刺激信号来提高肿瘤的免疫原性［9］。
2. 3 CD40-CD40L靶向DC抗肿瘤免疫的作用机制
实验研究表明，肿瘤的发生、发展与机体抗肿瘤免疫力低下有关，如肿瘤细胞低表达主要组织相容性复合体（MHC）分子、缺乏共刺激分子、存在抗原加工处理缺陷及T细胞信号传导分子表达改变等。CD40L分子可以与APC表面CD40相互作用激活APC，促进APC共刺激分子表达和细胞因子分泌。活化的APC是肿瘤细胞与肿瘤特异性免疫杀伤T细胞之间的桥梁，能呈递肿瘤抗原给T细胞和激活T细胞，产生肿瘤特异性杀伤T细胞。因此，通过CD40-CD40L信号分子途径激活APC，增强对弱免疫原性肿瘤细胞抗原的递呈，诱导肿瘤特异性免疫，为肿瘤治疗提供新的方法和思路。
2．3．1 CD40的配基化促进DC的成熟，上调DC表面共刺激分子和MHC类分子的表达，提高DC的抗原提呈能力，从而发挥激发Th细胞和CTL的功能，并且CD40信号对Th1和Th2反应的诱导都很重要。
Th细胞表达的CD40L或它的同源体在与DC上的CD40受体相互作用后，DC分子具有的特性为：1）DC形态学向成熟DC改变，如胞浆减少、树枝状形态的增加、诱导DC的表型的成熟，同时使DC保持高水平MHCⅡ抗原表达；2）DC摄取抗原的能力减弱、加工处理抗原的能力提高、抗原递呈能力增强；3）DC具有较强的T淋巴细胞趋化能力；4）DC体外刺激T淋巴细胞增殖反应能力增强；5）DC表面的共刺激分子如CD83、ICAM-1、CD58、CD80和CD86明显上调，并能够产生较高水平的IL-8、IL-12、TNF-α、IFN-γ、巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）等细胞因子，并使Th0细胞向Th1细胞分化［10-13］。最近研究[16]发现CD40/CD40L信号在DC驱动的Th2反应中也起着必要的作用。业已表明，在DC并不表达CD40分子的情况下，某些Th1反应仍能有效激活，这可能是因为DC分泌一系列炎症因子上调了其他共刺激分子的表达，代偿了CD40/CD40L途径对Th1反应的激活作用。而DC诱导Th2型免疫应答完全依赖于CD40/CD40L信号，敲除CD40分子，动物体内的DC完全缺乏对Th2抗原的应答能力[14]。
近期文献报道了CD40L介导的单核细胞来源的DC的活化、生存和CD8+T细胞的扩增作用的三个信号通路。P38有丝分裂原-活化蛋白激酶（MAPK）通路、胞外信号调节激酶（ERK）通路和磷酰肌醇-3OH激酶（PI3K）通路。P38MAPK通路是评定CD40L介导的上调表达CD83（DC成熟的表面标志）的最重要通路。CD40L引起单核细胞来源的DC的IL-12的分泌由P38MAPK通路和ERK通路共同介导。CD40L的抗凋亡机制主要由PI3K途径引起，少许和p38MAPK和ERK途径有关。尽管，P38MAPK、PI3K，ERK途径非依赖性地影响CD40L介导的DC成熟中各种各样的参数，而P38MAPK却是其中最重要的通路途径，可最大化地引发T细胞免疫应答。这个通路途径还有待开拓了解其在体内是否完全抑制或增强CD8+T细胞的免疫应答作用［15］。
CD40L-CD40的相互作用诱导IL-12的分泌是很令人感兴趣的，因为IL-12可上调T细胞表面CD40L的表达，在IL-2及其他共刺激分子（如B7-1/B7-2）的协同作用下，可使CD40L的表达量达到很高的水平［16］。另外，IL-12是Th1细胞相关的异二聚体细胞因子，促进Th1细胞诱发的免疫反应，调节Th1/ Th2 细胞之间的平衡，介导活化T细胞和自然杀伤细胞的直接有丝分裂和IFN-γ分泌。因此CD40L 活化的DC能增加局部细胞因子浓度，并在细胞因子协助下摄入肿瘤抗原，呈递给T细胞，激发T细胞的肿瘤特异性杀伤效应［17］。在体外，可将CD40L与鼠B细胞淋巴瘤（38C13）的肿瘤特异个体基因型（Id）抗原相连接，形成Id-CD40L抗原。Id-CD40L 能增加鼠DC细胞表面分子CD40、CD80、CD86等表达和细胞因子IL-12分泌。这种DC免疫鼠，能产生高浓度的Id抗体和诱生肿瘤特异性免疫杀伤T细胞，可以抵御38C13肿瘤细胞的攻击，在已负瘤的体内则能延缓肿瘤生长，而单纯Id不能激发有效的DC免疫反应［18］。将鼠CD40L基因转染给鼠DC，也能激发有效的T细胞抗肿瘤免疫［19］。
2．3．2 CD40L激发的DC可以不依赖Th细胞的辅助直接激活CTL。
在特异性免疫反应中，特异性CTL的激发和扩增必须首先由Th细胞与APC细胞（DC）的相互作用，被Th激发的DC再将信号传递给CTL，其中DC在Th细胞和CTL 间起了桥梁的作用。然而，最近的研究发现，CTL的激发可通过激发DC的CD40分子而绕过Th细胞。这无疑对激发体内CTL提供了新的手段（见附图）[20]。
国外有文献报道，缺乏CD4+T细胞辅助不影响CD40依赖性的CD8+T细胞反应，这表明有其他细胞提供表达CD40L以激活抗原呈递细胞。因为CD8+T细胞能够表达CD40L，它们能够直接与APCs相互作用，为自身激活提供帮助［21-25］。
2．3．3 CD40L信号还可以延长DC的生存期，提高拮抗肿瘤微环境中IL-10的能力。
肿瘤细胞分泌IL-10被证明是肿瘤细胞逃逸免疫识别和杀伤的机制之一。
IL-10抑制DC分泌IL-12，并且能够诱导CD4+T和CD8+T细胞的抗原特异性的反应无力。然而，令人兴奋的是最近有研究显示：CD40L诱导人外周单核细胞向DC的分化与成熟，并能拮抗IL-10细胞因子对DC细胞分化、成熟和功能的抑制效应，并认为可能与CD40L直接作用于DC表面的CD40分子使之配基化，启动并特异性地激活了NF-κB信号通路、下调DC表面IL-10R有关[26]。
有实验分析了脂多糖（LPS）、TNF-α、CD40L等不同的活化刺激对于IL-10引发的DC功能抑制的影响，最终发现TNF-α或者CD40L能够对抗IL-10引起的DC 功能抑制。鼠膀胱癌细胞株MB49能够分泌IL-10，Angelica等报道，应用编码CD40L 的腺病毒，可以明显抑制C57BL/6小鼠体内接种的MB49细胞分泌IL-10和TGF-β的能力，并在肿瘤区诱导典型的Th1型反应，该反应是MB49特异性的［27］。
在遭遇抗原特异性T细胞时，DC可以抵抗Fas导致的凋亡，是CD40配基化的结果和可能由于上调bcl-2蛋白表达相关的机制作用的［28］。
3 临床应用及展望
树突状细胞（DC）作为体内专职的APC，是激活免疫反应的启动细胞，在免疫治疗中具有重要的意义。常用来评估增强免疫抗感染和抗癌症的免疫方法。人们做出了大量的实验研究，希望通过激活扩增DC，调节DC的功能来调节免疫应答，从而应用于感染、肿瘤、移植排斥、自身免疫性疾病的治疗和预防。研究CD40L 修饰的DC的免疫学效应对探索诱导抗肿瘤免疫具有重要意义。
急性白血病（acute leukemia，AL）细胞虽表达MHCⅠ、MHCⅡ类分子，但是由于B7等共刺激分子表达缺乏，不能有效地将肿瘤抗原的呈递给T细胞，甚至不能激活异基因T细胞。CD40L可以改变AL细胞表型使AL向DC分化。Todisco［29］等用stCD40L与儿童急性淋巴细胞白血病前B细胞（BCP-ALL）共同培养，BCP-ALL的粘附分子，共刺激分子CD40、CD80（B7-1）、CD86（B7-2）和MHCⅠ、MHCⅡ、CD54、CD58等分子发生表达上调。这种细胞表型的改变使BCP-ALL成为有效的APC，能诱导异基因T细胞增殖。CD40L、粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白介素--4能诱导急性髓性白血病（acute myeloid leukeina，AML）CD14+白血病细胞和髓性DC（myeloid dendritic cell，MDC）向DC分化，使之具有成熟DC形态学特征和表型，并能诱导静止T细胞增殖和细胞因子IL-12分泌［30］。
1998年7月至1999年8月，美国进行了三聚体重组人CD40L的Ⅰ期临床试验。32例患者中有23例实体瘤（包括肾细胞癌、头颈癌、宫颈癌、肉瘤等）和9例非霍奇金淋巴瘤，采用皮下注射方式，5天为一疗程，每4-6周重复一疗程。结果表明，三聚体重组人CD40L的最大耐受剂量为0.1mg/kg/d，半衰期约24h。2例出现部分抗肿瘤反应，其中1例经过1年治疗后停止给药，未接受任何抗癌治疗无病生存己超过1年。12例经过1疗程治疗后病情稳定，其中4例维持了4疗程。76 %的患者外周血CD19+B淋巴细胞减少，81%的患者CD4+T淋巴细胞增多，而血清免疫球蛋白和细胞因子水平无变化，亦未发生淋巴结和脾脏肿大。主要副作用是肝脏毒性（转氨酶升高）［31-32］。可溶性重组人CD40L也被应用于黑色素瘤、Ewing肉瘤、结直肠癌、非小细胞肺癌等肿瘤疫苗的临床试验。其基本策略是将患者自体DC 与CD40L及多种细胞因子（如粒-巨噬细胞集落刺激因子、IL-4）在体外共培养，并用肿瘤抗原进行冲击。再将这些DC回输体内，之后（或同时）辅以其他细胞因子如IL-2或过继T细胞治疗，以增强体内的抗肿瘤免疫反应［33］。
CD40-CD40L靶向DC在细胞免疫、体液免疫中均起着重要的作用，随着近年来对其生物学功能及作用机制的研究，其在临床上的应用得到更多的关注，尤在抗肿瘤及诱导移植耐受等方面显示了更大的应用前景。
参考文献：
1. Banchereau J，Steinman R M.Dendritic cells and the control of immunity [J]. Nature，1998；392：245-25
2.
2. Maegara Y，Kabashima A. Recurrences and relation to tumor growth potential and local immune response in node-negative advance gastric
cancer [J]. Oncology ，1999 ，56：322-327.
3. Manome H，Aiba S，Tagami H. Simple chemicals can induce maturation and apoptosis of dendritic cells[J] .Immunology ，1999 ；98（4）：481.
4. Ka-Ming FC，Chun HJ，Lixin ZH，et al.A domain in TNF receptors that mediates ligand-independent receptor assembly and signaling [J]. Science，2000，288：2351.
5. Inwald DP，McDowall A，Peters MJ，etal. CD40 is constitutively expressed on platelets and provides a novel mechanism for platelet activation. Circ Res，2003，92（9）：1041-1048.
6. Clark LB，Foy TM，Noelle RJ. CD40 and its ligand，Adv[J].Immunol，1996，63：43–78.
7. Hakkinen T，Karkola K，Yla-Herttuala S. Macrophages，smooth muscle cells，endothelial cells，and T-cells express CD40 and CD40L in fatty streaks and more advanced human atherosclerotic lesions.Colocalization with epitopes of oxidized low-density lipoprotein，scavenger receptor，and CD16（Fc gammaRⅢ）[J].Virchows Arch ，2000，437（4）：396-405. 8. 周桓，顾宗江，张学光等. CD40分子在树突状细胞中的信号转导通路[J]现代免疫学，2004，24（5）：429-431.
9. 韩梅，肖菊香，王一理等.CD40-CD40L配体与肿瘤[J]西部医学，2005，17，（1）：75-77.
10. Schoenberger SP，Tose RE，Van derVoort EI，et al.T-cell help for cytotoxic T lymphocytes is mediated by CD40-CD40L interactions[J]. Nature. 1998，393（6684）：480～483.
11. Korskaja SN，Buffo MJ，Bunker M，et al.Interleukin-2 induces development of dendritic cell from cord blood CD34+cell[J]. J leukoc Biol. 1998，63（5）：620～630.
12. Gomez J，Gonzalez A，Martinez-A C，et al.IL-2-induced cellular events[J].Crit Rev Immunol.1998，18：185～220.
13. Grunig G，BanzA，deWaalMalefyt R，et al. Molecular regulation of Th2 immunity by dendritic cells [J]. Pharmacol Ther，2005，106（1）：75-96.
14. MacDonald AS，Straw AD，Dalton NM，et al. Cutting edge：Th2 response induction by dendritic cells：A role for CD40 [J]. J Immunol，2002，168 （2）：537-540.
15. Qigui Yu，Colin Kovacs，Feng Yun Yue，and Mario A. Ostrowski.
The Role of the p38 Mitogen-Activated Protein Kinase，Extracellular Signal-Regulated Kinase，and Phosphoinositide-3-OH Kinase Signal Transduction Pathwaysin CD40 Ligand-Induced Dendritic Cell Activation and Expansion of Virus-Specific CD8+T Cell Memory Responses［J］.The Journal of Immunology，2004，172：6047-6056.
16. Peng X，Remacle JE，Kasran A，et al .IL-12 up-regulates CD40 ligand （CD154）expression on human T cells[J].J Immunol，1998，160（3）：1166-1172.
17. 朱芳兵，王少元等.CD40-CD40L与血液肿瘤免疫，国外医学内科学分册，2004，31（6）：235-237.
18. Watson SA，Morris TM，Varro A，et al.[J].Gut，1999，45（6）：812-817.
19. Yamagishi H，Ueda Y，Oka T.[J].Cancer Immunol Immunother，1998，46（2）：113-119.
20. Ridge JP，et al.A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+T-helper and T-killer cell.Nature，1998，393：474.
21. Roy M， T. Waldschmidt， A. Aruffo， J. A. Ledbetter， and R. J. Noelle. 1993.The regulation of the expression of gp39，the CD40 ligand，on normal and cloned CD4+T cells.J.Immunol. 151：2497-2510.
22. Cronin，D. C.，2nd，R.Stack，and F.W.Fitch. 1995.IL-4-producing CD8+T cell clones can provide B cell help.J.Immunol.154：3118-3127.
23. Hermann，P.，C. Van-Kooten，C. Gaillard，J.Banchereau，and D. Blanchard.1995.CD40 ligand-positive CD8+T cell clones allow B cell growth and differentiation.Eur.J.Immunol. 25：2972-2977.
24. Sad，S.，L. Krishnan，R. C. Bleackley，D. Kagi，H. Hengartner，and T. R. Mosmann.1997.Cytotoxicity and weak CD40 ligand expression of CD8+type 2 cytotoxic T cells restricts their potential B cell helper activity. Eur.J.Immunol.27：914-922.
25. Whitmire，J. K.，R. A. Flavell，I. S. Grewal，C. P. Larsen，T. C. Pearson，and R. Ahmed.1999.CD40-CD40 ligand costimulation is required for generating antiviral CD4 T cell responses but is dispensable for CD8 T cell responses.J.Immunol.163：3194-3201.
26. Brossart P，Zobywalski A，Grunebach F，et al. Tumor necrosis factor alpha and CD40 ligand antagonize the inhibitory effects of interleukin 10 on T-cell stimulatory capacity of dendritic cells [J].Cancer Res，2000，60：4485.
27. Loekog A，Dzojic H，Vikman S，et al. Adenovious CD40 ligand gene therapy counteracts immune escape mechanisms in the tumor Microenvironment［J］.J Immuno1，2004，172（11）：7200-7205.
28. Bjorck P，Banchereau J，Flores-Romo L.CD40 ligation counteracts Fas-induced apoptosis of human dendritic cells[J].International Immunology. 1997，9（3）：365～372.
29. Yamaguchi Y，Satoh Y，Miyahara E，et al.[J ].Anti-cancer Res，1995，15（5B）：2201-2206.
30. Kim SY，Park HC，Yoon C，et al.[J]. Cancer，1998，83（10）：2054-2059.
31. Vonderheide RH，Dutcher JP，A nderson JE，et al. Phase I study of recombinant human CD40 L igand in cancer patients [J]. J Clin Onco l，2001，19：3280-3287.
32. Younes A.CD40 Ligand therapy of lymphoma patients [J].J Clin Oncol，2001，19∶4351-4353.
33. 陈凌等.CD40 配体在肿瘤免疫治疗中的应用［J］国外医学肿瘤学分册，2004，31（8）：584-587.