不同亚型转化生长因子β(TGF-β1、 TGF-β2、TGF-β3)对 前软骨干细胞增殖分化增值活动的影响

不同亚型转化生长因子β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)对于

前软骨干细胞增殖分化增值活动的影响

摘要

目的：前软骨干细胞作为一种组织工程学种子细胞被用于修复软骨损伤，近年来受到了越来越多的学者的关注。本文通过观察三种不同亚型的转化生长因子（TGF-β）：TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3对于前软骨干细胞（PSCs）细胞增殖分化活动以及细胞外基质合成的影响并加以比较为构建组织工程学软骨组织以修复软骨损伤，寻找一种理想的细胞因子。

方法：通过免疫磁珠分选法得到经过筛选和纯化的PSCs细胞，使用含有浓度为10ng/ml 的三种亚型的重组TGF-β培养基对PSCs进行培养。采用MTT法与BrdU/PI 双参法测不同组别PSCs培养后第0,3,6,9d细胞增殖及DNA合成水平，并采用rt-pcr法测定培养后第0，3，6，9天不同组别Col II,Aggrecan基因的表达情况。采用免疫组化法测定培养2周后各组细胞SOX9蛋白表达情况。

结果：培养三天后与对照组相比使用TGF-β1干预组的活性明显下降（P<0.05）,而TGF-β2、3组增殖活性与对照组相比较无明改变（P>0.05）。6天后，与对照组相比较TGF-β1组细胞增值活性明显降低(（P<0.01），而TGF-β2、3组则显示了相反的结果，使用TGF-β2、3组细胞的增殖活性较对照组明显增前且TGF-β3组高于TGF-β2组（P<0.05）。rt-pcr 分析显示随着时间的延长，与空白对照组相比实验组A、B、C Col II基因表达均呈上升趋势，然而使用TGF-β1与TGF-β3组Aggrecan的表达随时间延长而增加，但使用TGF-β2组Aggrecan的基因表达无明显改变。免疫组化显示与对照组相比，TGF-β1、TGF-β3组的SOX9蛋白合成高于对照组（P<0.05），而TGF-β2组与对照组相比无明显差异性（P>0.05）。

结论：TGF-β1能抑制PSCs 增殖活性，而TGF-β2和TGF-β3具有促进PSCs增殖的作用，TGF-β1与TGF-β3均能促进PSCs细胞分化，而TGF-β2对于分化的诱导作用不明显。

[关键词] 前软骨干细胞，转化生长因子亚型，增殖与分化

Study of the effect of Transforming Growth Factor Beta (TGFβ1, TGFβ2 and TGFβ3) on the activities of proliferation and

differentiation of precartilaginous stem cells（PSCs）

Abstract

Objective：P recartilaginous stem cells（PSCs）as a promising tissue engineering seed cells to cure cartilage injury attach more and more importances from researchers recently. To observe the effect of different TGF-βisforms: TGF-β1, TGF-β2 and TGF-β3 on the proliferation and differention of precartilaginous stem cells ( PSCs) and compare their capacity between each other，further more to find an ideal cytokine to construct tissue engineering Cartilage to repair Cartilage defect.

Methods:obtain the PSCs by the ways of Immun-Magnetic activated cell sorting after seperation and purifcation. Culture PSCs in the medium with the concentration of 10ng/ml of different TGF-β isfroms .Proliferation and DNA synthesis of PScs in response to TGF-β isoforms was examined by MTS and BrdU / PI double-reference method at the time of 0,3,6,9d after be cultured. Observe the level of the gens expression of Col II,Aggrecan at the time of 0,3,6,9 d by means PT-PCR and expresion of SOX9 by means Immuno- histochemistry at the time of 2w to study the effects of TGF-β1, TGF-β2 and TGF-β3 on chondrogenic differentiation.

Results: After 3 d cultrued the activity of proliferation in group of TGF-β1 decreased significantly（P<0.05）but it dose not appear in the groups of TGF-β2 and TGF-β3 （P>0.05）, after 6 d the activity of proliferation in group of TGF-β1 decreased significantly comparing with the control group, but the group of TGF-β2 and TGF-β3show increasing effect on the proliferation of PSCs（P<0.05）. RT-PCR shows:With the extension of time, the gen exprssions of Col II in each group of TGF-β have the increasing inclinations, the gens exprssions ofAggrecan also appears increasing in the groups of TGF-β1 and TGF-β3, but these gens expression show no difference in TGF-β2 group. Immunohistochemistry shows the synthesis of SOX9 protein in groups of TGF-β1、TGF-β3 are higer than the control group（P<0.05）,while TGF-β2 show no difference comparing with the control group（P>0.05）.

Conclusions: TGF-β1 could inhibit the activity of proliferation in in PSCs and TGF-β2 and TGF-β3 can enhance the the activity of proliferation. Both TGF-β1andTGF-β3 could promote the differentiation of PSCs,while TGF-β2 do not show that inductive effect.

Keywords precartilaginous stem cells ( PSCs), Transforming growth factor-β isoforms, proliferation and differentiation

引言：软骨自我修复能力极为有限，尽管传统的手术治疗可以起到一定修复作用，但实际上髓腔及血液中的成软骨细胞无法到达损伤部位，进而增殖分化形成具有一定强度的软骨组织[1]，最终损伤部位将为纤维疤痕组织所替代，无法恢复关节正常的生理构造和功能。故软骨损伤的治疗一直困扰者临床工作者，而利用组织工程的手段治疗软骨及骨骺损伤也成为前研究的热点。前软骨干细胞（PSCs）来源于由于其具有定向增殖分化为成熟软骨细胞能力，能作为一种较为理想的组织工程学种子细胞的为越来越多的研究工作者所重视。转化生长因子-β (Transforming growth factor beta, TGF-β)是一种多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。TGF-β家族在调控胚胎源性干细胞增殖与分化中也起到极为重要的作用，它能通过提高Cox9基因转录上调骨髓间充质肝细胞软骨基因的表达，通过抑制Runx2基因转录从而阻止成骨细胞向分化[2-3]。, 转化生长因子-β包括5个亚型[4]，其中转化生长因子-β1，转化生长因子-β2和转化生长因子-β3存在于哺乳动物体内[5]。三种亚型均具有能介导不同来源的间充质细胞分化形成软骨细胞的能力，但在对于不同类型的细胞中其诱导效应存在很大的差异性[6-8]，而对于PScs细胞细胞的诱导效应也尚未见相关报道。本试验旨在观察不同三种TGF-β亚型细胞因子对于PScs细胞增值与分化的影响，并对三者的诱导能力加以比较，以寻找促进种子细胞分化增值的高效的细胞因子。

1.材料与方法

1.1 实验材料：

实验动物选用12h内新生纯系清洁级雌性SD大鼠，体重8g左右。由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验动物许可证号：syxk（鄂）2009-0028，乳鼠饲养在保持恒温23℃，恒湿（50%）的清洁动物饲养房内。

1.2 试剂与仪器：

重组TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 (Fitzgerald Industries, Concord, MA)DMEM培养基（Hyclone USA），Gibco优质胎牛血清（Gibco USA），MiniMACS磁珠细胞分选系统、羊抗兔IgG免疫磁珠（Miltenyi Ger），兔多克隆抗体FGFR-3（Santa Cruz USA），Trizol试剂盒（Invitrogen USA），反转录试剂盒（TOYOBO JPN），PCR引物由武汉Invitrogen公司代为合成，TaqMix DNA聚合酶（TOYOBO JPN），鼠抗人BrdU单克隆抗体（Sigma USA）, FITC荧光标记的二抗（Dako DEN）, 噻唑蓝（MTT）、二甲基亚枫(DMSO)（Sigma USA）流式细胞仪FACSort(Becton Dickson USA)，SABC试剂盒（上海富众生物公司）。

1.3 实验方法：

PSCs细胞的提取分离纯化与培养：

由于FGFR-３作为PSCs细胞特殊的表面标志物而被鉴定并故可通过免疫磁珠法进行分选纯化，具体方法：

1、新生SD 大鼠处死后，低倍显微镜视野下环行切取La Croix环，即新生动物骺板周

围骨膜环形组织结构，仔细分离该环,剪成小块( < 1 mm3 )。

2、Ⅰ型胶原酶消化1小时，密度梯度离心法去除死细胞，将收集到的细胞接种于含10%

胎牛血清的DMEM -F12培养基中，37.5℃，5%CO2培养箱中。

3、24h后使用缓冲液（PBS-0.5% BSA-2 mmol EDTA）将原代细胞悬浮后用30μm 孔径

过滤器去除聚集的细胞团制备成单细胞悬液。

4、用兔多克隆抗体FGFR-3室温孵育15 min，离心，缓冲液洗涤2 遍。

5、按每1×10７个细胞加入20ul羊抗兔IgG -免疫磁珠复合物，室温孵育15min。

6、缓冲液洗涤细胞2次，离心，按每1×107ml细胞加500μl缓冲液制备成细胞悬液，移

入细胞分离阳性选择柱，按照说明书操作得到FGFR-3阳性细胞，即PSCs细胞。

7、加入含10% 胎牛血清的DMEM-F12培养基中培养置于5% CO2细胞培养箱中，培

养，每三日换液一次，当贴壁生长细胞覆盖满瓶底时，0.5%的胰蛋白酶消化液传代，继续培养以进行下一步离体细胞试验。

MTT法及BrdU/PI 双参法测定细胞增殖活性测定TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3对于PScs 细胞分裂增值的影响：

取生长状态良好的第3代细胞PSCs细胞，0.5%的胰蛋白酶消化液37°C，消化2min，含10% 胎牛血清的DMEM-F12培养基终止消化，弯头吹打，将悬浮细胞分别种植于数块96孔板中，调整细胞密度约1，000个/孔，5% CO2细胞培养箱中，培养过夜，待细胞贴壁后，实验组A、B、C分别在96孔板中加入重组TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，调整每孔转化生长因子浓度为10 ng/ml，这一浓度被证实在对于其它干细胞能诱导其成软骨分化[9],空白对照组只使用含10% 胎牛血清的DMEM-F12培养基，每日换液一次，实验组各组按照上述浓度重新添加含有重组TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的，10% 胎牛血清的DMEM-F12培养基，空白对照组换液使用含10% 胎牛血清的DMEM-F12培养基。分别取培养后的第0、3、6、9天每组细胞，每孔加入MTT溶液（5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，脱色摇床振荡10min，使结晶物充分融解。在酶联免疫监测仪上测定各孔在波长620nm时光吸收值。

取培养后6天的两细胞，向目的细胞培养基内加入BRDU，浓度为5UL/ML,消化收集细胞，70%酒精固定，-20℃条件下过夜，取固定后的细胞，PBS洗涤2遍，再使用浓度为2mol／L盐酸作用30 min，PBS-T(成分为0．1％BSA, 0．2％Tween．20)洗3遍，加鼠抗Brdu一抗(1:100)，37℃条件下孵育2 h。PBS洗2遍，加入FITC标记的羊抗鼠二抗(1:20)，室温放置1 h，上流式细胞仪检测。

TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3对于PSCs细胞细胞外机制合成的影响及向成熟软骨细胞分化的检测:

Col-II、Aggrecan是软骨重要的细胞外基质，而SOX9由成熟软骨细胞分泌可以反映细胞的分化程度。取生长状态良好的第3代细胞PSCs细胞，0.5%的胰蛋白酶消化液37°C，消化2min，培养基终止消化，弯头吹打，将悬浮细胞种植于实验组A、B、C及空白对照组4组12孔板中，5% CO2细胞培养箱中，培养过夜，待细胞贴壁覆盖瓶底后。实验组A、B、C分别在12孔板中加入重组TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3细胞因子。浓度为10 ng/ml，空白对照组只使用含10% 胎牛血清的DMEM-F12培养基，每两日换液一次，实验组A、B、C按照上述浓度重新添加浓度为10 ng/ml 重组TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3的含10% 胎牛血清的DMEM-F12培养基，空白对照组换液使用含10% 胎牛血清的DMEM-F12培养基。为了较为清楚的观察PSCs细胞的分化过程，我们分别在0，3，6，9天收集细胞。采用RT-PCR法检测不同组PSCs细胞Col-II、Aggrecan及SOX9 MRNA表达情况：

具体方法

Trizol法提取RNA：

（1）弃培细胞培养液上清，PBS冲洗2遍每次2分钟后倒置滤干。按106/1mL浓度加入Trizol 试剂轻轻晃动培养瓶，移液枪将样品转至1.5mLEP管中。

（2）室温下放置5min，1mL Trizol 试剂加入0.2mL氯仿，振荡15s静置3min。

（3）4℃条件下，12000g/min离心15min。取上层水相移至另一EP管中。按每1mLTrizol 试剂加0.5mL异丙醇的比例沉淀RNA。室温下静置5-10min。

（4）4℃条件下，12000g/min离心15min，EP管下层凝胶样沉淀为RNA，弃上清。用1mL 浓度未75%的乙醇于旋振荡器上洗涤RNA沉淀一次。

（5）4℃条件下，7500g/min离心5min，弃上清真空机内真空干燥，然后用DEPC水重悬RNA沉淀。

（6）分光光度计检测提取RNA的浓度及纯度，置-70℃的低温冰箱保存。

逆转录反应：

（1）制备含有2ug RNA，以及oligo(dt)15 primer 1ul的DEPC水溶液11.5ul。。

（3）轻轻摇晃，使之充分混合。

（4）短暂离心，70℃条件下，静置5min，

（5）立即冰上冷却，短暂离心。加入5×Buffer4ul; 浓度未40U/μl的RNasin lul，10mM dNTP 2ul，浓度未200U/μl的M-MLV 2μl。

（6）混匀，短暂离心，42℃条件下放置60min。

（7）95℃条件下放置10min

（8）4℃保存。

PCR反应：

（1）PCR各引物序列的设计

F：5’- AGGGGTACCA GGTTCTCCA -3’

collagen-II（225bp）

R：5’- CTGCTCA TCGCCGCGGTCCTA -3’

F：5’- GGGTGAGGTCTTTTATGCCA -3’

aggrecan (276bp)

R：5’- GCTTTGCAGTGAGGATCACA -3’（2）反应体系构成(25ul/Sample)

MgC12 1 ul

10×PCR Buffer 2.5 ul

dNTP Mixture 2 ul

上游引物 1 ul

下游引物 1 ul

Tag酶0.5 ul

CDNA模板 4 ul

DEPC水13 ul

（3）按以下条件进行反转录反应

95℃预热 5 min

95℃变性30 sec

57℃退火30 sec

72℃扩增10 min

循环35 times

72℃延伸10 min

（4）反应结束后取5μl扩增产物在2% 琼脂糖凝胶上电泳。

反应结束后取5μl扩增产物在2% 琼脂糖凝胶上电泳，。PCR 产物经电泳、DNA 吸光度扫描检测; 显色条带图像分析系统检测(Alpha Imager 2000) 检测其积分吸光度值, 与内参β- actin 条带的比值为mRNA 表达水平参数。

免疫组化法测定SOX9的表达情况：

SOX9是由成熟软骨细胞合成的一种蛋白，可间接提示细胞的分化成熟程度。取培养9天后的各组细胞，使用SABC试剂盒检测各组细胞SOX9，即成熟软骨形成所表达的特异性蛋白的表达情况，按厂家说明书指示进行操作。具体步骤如下：

一、细胞爬片的制作

1、PSCs细胞用05%胰蛋白酶消化液消化后，DMEM培养基终止消化，制备成悬浮液，密度为1-5x106/ml；

2、在培养皿中平铺3块细胞爬片，片间不要重叠；

3、取细胞悬液分别滴至圆片上，放置30min左右；

4、30min后，在培养皿中补加含10%胎牛血清，培养液（轻微的加入，以免冲力将贴壁的细胞打下来）置于37°C，5%CO2培养箱中培养3h左右。

二、组化前处理

1、取出培养皿，PBS漂洗两次；

2、4%多聚甲醛处理（室温）20min；

3、PBS漂洗，2次；

4、0.5%Txiton X-100 处理（室温）20min；

5、PBS漂洗2次；

6、3%H2O2处理（室温）15min；

7、PBS漂洗，2次；

三、组化

1、爬片试剂盒中的血清封闭液，37°C，20min；

2、取出甩干（不漂洗）；加入一抗（1：200）（PBS稀释），37°C1-2h或4°C过夜；

3、PBS

漂洗，3次；

4、二抗孵育：试剂盒中的生物素化...37°C，20min；

5、PBS漂洗，3次；

6、SABC孵育：湿盒内37°C，20min；

7、PBS漂洗，3次；

8、DAB显色：DAB试剂盒中的A、B、C三种试剂，按照500ul蒸馏水中各加4ul，混匀。

在镜下观察显色情况，在没有背景色的条件下可继续显色。

9、自来水洗片；

10、苏木素复染，30s；

11、自来水洗片；

12、封片剂封片。

显微镜下观察结果。结果判定方法:P-gp阳性表现为细胞胞膜或者胞浆出现明确的棕黄色反应物,无胞膜或胞浆染色为阴性,每组选取细胞分布均匀的20个高倍镜视野作为观察区,两个观察者先后判断同一视野细胞P-gp蛋白的表达阳性、阴性的个数，求出20个视野内各种细胞的平均值，计算阳性细胞的百分比。

4. 统计学分析：

采用SPSS11.0软件进行统计学分析。计量资料均用均数x±标准方差表示，多组间均

数比较采用One-Way ANOV A检验。P ≤0.05为差异有统计学意义。

实验结果

1. TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3对于PSCs细胞增殖及DNA合成的影响：

MTT法检测细胞增殖活性结果见图1，图1显示使用TGF-β1培养3天后实验组A 细胞的增

殖活性明显下降，此结果与James AW实验研究结果相似[10]。与之相比较TGF-β2、TGF-β3

组与对照组相比较无明显增殖表现（P>0.05）。培养6天后，与对照组相比较实验组A细胞增

值活性明显降低（P<0.05），而实验组B、C则显示了相反的结果（P<0.05），TGF-β2、TGF-β3

组细胞的增殖活性较对照组明显增前且TGF-β3组高于TGF-β2组。

流式细胞结果见图2，其中R2区域内红点代表正进行DNA合成活动的细胞，培养6天后，

与空白对照组相比较，TGF-β1组PSCs细胞DNA合成下降，而TGF-β2、TGF-β3组细胞的DNA

合成显著增加。

图1 MTT检测各组细胞增殖活性

Figure 1 Proliferation of PSCs in each groups tested by MTT

2. TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3对于PSCs细胞合成软骨细胞外机制的影响：

通过real-time PCR检测0，3，6，9天各组细胞Col II,Aggrecan基因的表达情况随着时间的延长，如图3-7示与空白对照组相比实验组A、B、C的Col II基因表达均呈上升趋势，然而使用TGF-β1与TGF-β3干预的A组、C组Aggrecan的培养随时间延长而增加，但使用TGF-β2干预的B组Aggrecan的基因表达无明显增加，见图8。

免疫组化结果如图3-6显示,对照组阳性细胞率为10.5%（图12），实验组A为53.6%（图9），实验组B为11.4%（图11），实验组C为62.5%（图12）。与对照组相比实验组B差异无统计学意义（P>0.05）,而实验组A与实验组C差异具有统计学意义(P<0.01)。RT-pcr以及免疫组化的结果说明TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3均能上调Col II基因表达，然而TGF-β1 与TGF-β3同时可促进Aggrecan基因的表达，也可促进SOX9蛋白的合成，提示TGF-β1 与TGF-β3能的诱导PSCs细胞向成熟软骨细胞分化。

图7 各组Col II基因表达情况

Figure 7 the expressions of Col II gene in each groups

图8 各组Aggrecan基因表达情况

Figure 8 the expressions of Aggrecan gene in each groups

讨论

前软骨干细胞（PSCs）来源于哺乳动物骺板周围的La Croix环内的一种软骨母细胞，由于其具有定向增殖分化为成熟软骨细胞能力，而且PSCs细胞膜表面存在FGF-r3受体能作为其特异性表面标记物，故可被分离纯化，PSCs是一种理想的组织工程学种子细胞的，为越来越多的研究工作者所重视。

转化生长因子TGF是转化生长因子超家族的一员，主要包括有骨形态蛋白(BMP’s) ，生长分化因子(GDF’s)以及三种TGF亚型TGFb1,TGFb2, TGFb3[11]三种亚型在调控细胞增值分化和发育中起到十分重要的作用[12]。近年来TGF对于各种来源的间充质干细胞增值分化的影响作用为越来越多的学者所关注。Popova AP研究发现[13]来源于人类婴儿支气管的间充值干细胞能自分泌TGFb1，并通过TGFb1诱导细胞分化成为肌纤维母细胞。Park KH[14]的研究发现TGF beta-3能够显著促进兔间充质细胞增殖并诱导其相软骨细胞定向分化。Nahoko Shintani[15]比较骨形态蛋白2、7 和转化生长因子-β1对于滑膜来源的间充质细胞诱导分化能力的比较发现三种TGF-B超家族细胞因子均具有能诱导间充质细胞向软骨细胞分化的能，其程度呈时间依赖性，且TGFb1较其它两者的诱导能力最强。

James AW[10]观察TGFb1、TGFb3对于人类胚胎颅骨囟门处间充质细胞增值分化的影响，结果发现TGFb1能抑制间充质细胞增值但能促进其向成熟软骨细胞分化，并能促进细胞外基质的合成，而TGFb3对于间充质细胞的增殖则起到到抑制作用，且不具有诱导分化的能力。陈建国等[16]发现TGFα对于人表皮干细胞的增殖也有促进作用。

间充质细胞的聚集是软骨的形成先决条件，Tuli R等的研究发现TGF-β1能够上调间充质细胞钙粘素（cadherin）及聚糖蛋白（glycoproteins）的表达，而以上两种物质具有引发细胞聚集的作用[17]，并且能够影响细胞外基质成分Col II, Aggrecan的表达和成熟软骨细胞标志物Col X的表达。

以上研究表明TGF-β具有调控不同来源间充质细胞增殖分化的能力但其效应随细胞的种类不同存在很大的差异性，为寻找一种高效的细胞因子以促进增值并诱导其向成熟软骨细胞分化，本试验选用三种亚型TGFb比较其对于PSCs增殖分化的影响，结果发现TGFb1能抑

制PSCs的增殖，而TGFb2、3在作用6天后能促进细胞增殖。TGFb1、3具有诱导PSCs细胞分化的能力，而TGFb2无明显诱导作用。不同TGFb的亚型对于细胞软骨形成过程的诱导分化的作用主要通过与细胞膜表面TGFb1、2、3等不同受体（TGFbR1、2、3）结合，通过多种细胞内信号途径来传导。其一主要为依赖信号分子sMAD家族[18]传导，其二主要涉及活化蛋白激酶信号路径[19]。研究表明成软骨分化时通过TGF—B激活的信号级联放大和wnt路径在调控上存在交联关系[20]。TGF—B超家族生物活化的调控是通过和细胞外基质蛋白如B 一聚糖等相结合产生的相互作用来实现的[21],通过改变细胞因子和相应细胞表面受体的结合来调控细胞生物活性。

综上，TGF-β1、TGF-β2与TGF-β3相在对于体外培养的PSCs细胞的增殖和分化的影响具有显著的差异型，TGF-β3较另TGF-β两种亚型其对于增殖和分化的正向调节作用更为显著。为寻找一种有效的干预手段而促进种子工程学种子细胞PSCs细胞增殖分化打下了理论基础。

但由于细胞的增殖分化其作用极为复杂，且具有上述功能的细胞因子种类繁多，进一步探其寻作用机制，寻找并比较其它相关细胞因子作用效应还需要我们更加广泛深入的研究。

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附图

图2 BrdU/PI 双参法测定各组细胞DNA合成情况

Figure 2. DNA synthesis of each groups examined by BrdU / PI double-reference method

图3 对照组Col II 表达情况图4 实验组A Col II 表达情况

Figure 3. The expression of Col II in control group

Figure 4. The expression of Col II in study group A

图5 实验组B Col II 表达情况图6 实验组C Col II 表达情况

Figure 5. The expression of Col II in study group B

Figure 6. The expression of Col II in study group C

图9 实验组A （×200） 图10 实验组B （×200）图11 实验组C （×200）图12 对照组（×200） Figure 9 study group A （×200）

Figure 10 study group B （×200）

Figure 11 study group C （×200）

Figure 12 study group D （×200）

第一作者姓名：丁然医学博士

单位：广州军区武汉总医院

详细通信地址：湖北省武汉市武昌区武珞路627号骨科一病区邮政编码：430070 联系电话：单位电话：027******** 手机：133********

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