细胞培养基础篇
细胞培养基础篇
基础篇-无菌操作基本技术
1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70% ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Class II）。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目：
5.1. CO2钢瓶之CO2压力。
5.2. CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
5.3. 无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂（Zephrin 1:750），定期更换水槽的水。
基础篇-实验用品
1. 种类：
1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet外，其它均为塑料无菌制品。
1.2. TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依实验需要使用。
1.3. plastic sterile pipet: 1 ml, 2 ml,5 ml, 10 ml, 25 ml
1.4. 塑料离心管：15 ml, 50 ml，均有2 种不同材质，其中polypropylene (PP)为不透明材质，polystyrene (PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。
1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉废弃培养液等。
1.6. 玻璃血清瓶(Pyrex or Duran glassware)：100ml，250ml，500ml，1000ml。
2. 清洗：
2.1. 新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。
2.2. 用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。
3. 灭菌：
3.1. 实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven中烘干。
3.2. 实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170℃, 4 小时。
3.3. 液体或是固体废弃物可用10 % hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水) 或是蒸汽高压灭菌121 ℃, 15 lb, 20 分钟处理。
基础篇-培养基
1. 液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。
2. 液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。
3. 粉末培养基配制(以1 升为例)：
3.1. 细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。
3.2. 材料：
纯水（milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要），粉末培养基，NaHCO3，电磁搅拌器，无菌血清瓶，0.1或0.2 mm无菌过滤膜，pH计，真空泵，CO2气体
3.3. 步骤：
3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q水中，搅拌使其溶解。
3.3.2. 称取适量之NaHCO3粉末溶于200ml milli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5分钟。
3.3.3. 将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2。
3.3.
4. 以0.1或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤)
3.3.5. 配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。
附-配制培养基之生长测试
材料：
MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
6-well TC plate (or 35 mm TC dish)
methanol
glacial acetic acid
10 % Giemsa solution (GibcoBRL 10092-013)
步骤：
1. 以待测试培养基培养MDCK cell，接种MDCK 细胞于6-well plate (或35mm TC dish) 中，每个well 接种1 ×102 活细胞，同时作对照组实验。
2. 接种5～7 天后，在100 倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。
3. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇：冰醋酸﹦3:1)，室温下静置10 min。
4. 去除固定液，水洗二次。
5. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。
6. 去除染液，水洗二次。
7. 以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。
基础篇-抗生素
1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素
1.1. 培养自ATCC 引进之细胞株，培养基中不加抗生素。
1.2. 培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze前培养基须添加抗生素，待token freeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。
2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
3. 若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制mycoplasma生长。
4. 去除细菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml, streptomycin 250ug/ml, neomycin 250ug/ml, bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。
5. 抗生素使用种类与浓度：
工作浓度. 杀灭细菌
penicillin G(+) bacteria
streptomycin -20℃G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃yeast and molds
nystatin 50 ug/ml -20℃yeast and molds
fungizone 2.5ug/ml -20℃yeast and molds
基础篇-血清
1. 血清必须贮存于–20～–70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～
3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温
度与成分均一，
4. heat-inactivation 是指56℃, 30
理之目的是使血清中之补体成份(complement)
cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phagocytosis, chemotaxis and activation of lymphocytic and macrophage cell type。
5. 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。
6. 血清之沉淀物
6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沉淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沉淀物，可用离心3000rpm, 5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。
6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沉淀物的形成会显著的增多。有些沉淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沉淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。
附-血清之生长测试
材料：
MDCK cell (ATCC CCL-34 或CCRC 60004)
a-MEM (alpha modified minimal essential medium, GibcoBRL 12000-022 )
6-well TC plate (or 35mm TC dish)
methanol
glacial acetic acid
10 % Giemsa solution(GibcoBRL 10092-013)
步骤：
1. 以a-MEM with 10 % FBS (已测试过) 培养MDCK 细胞于T75 flask 至80% confluency。
2. 以trypsin-EDTA 处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM 制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM 稀释细胞浓度为1×102活细胞数/ ml。
3. 将1 ml 细胞悬浮液接种入6-well plate 中，并另加入1 ml 含不同浓度的血清(20 % , 10 % , 4 % , 2 % , 1 % , 0.4 %) 之a-MEM，使血清最终浓度为10% , 5 % , 2 % , 1 % , 0.5 % , 0.2 %。用已测试过之血清同时进行对照组试验。
4. 37 oC，5 % CO2 培养箱培养5-7 天，期间不需更换培养基，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。
5. 去除培养基，加入1 ml Carnoy’s 固定液(甲醇:冰醋酸﹦3:1)，室温下静置10 min。
6. 去除固定液，水洗二次。
7. 加入1 ml 10 % Giemsa solution，，室温下静置染色2-3 min。
8. 去除染液，水洗二次。
9. 以肉眼计数群落数
10. 计算SPE ( Serum Plating Efficiency )：
SPE = ( no. of colonies / well ) / 100 x 100 %
11. 计算RPE(Relative Plating Efficiency)：
SPE = [ total colonies of six well (test) / Total colonies of six well (control) ] x100 %
比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长的影响。订购多量同一批号的优良血清，置于–70℃保存之
基础篇-细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。
2. 材料：
2.1. 无菌磷酸生理缓冲液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)
2.2. trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062)：
以10ml 分装于15ml无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。
2.3. 新鲜培养基
2.4. 无菌吸管/离心管/培养瓶
3. 步骤：
3.1. 附着型细胞（adherent cell）
3.1.1. 吸掉旧培养液。
3.1.2. 用D-PBS洗涤细胞一至二次。
3.1.3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作
用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin。
3.1.
4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
3.2. 悬浮型细胞(suspension cell)
3.2.1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。
3.2.2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
3.3. 融合瘤(hybridoma)
3.3.1. 有些hybridoma cell 需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。
基础篇-细胞冷冻保存
1. 注意事项：
1.1. 欲冷冻保存之细胞应在生长良好（log phase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。
1.2. 冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。
1.3. 注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0.22micronFGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
1.4. 冷冻保存之细胞浓度：
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3*106 cells/ml
1.4.
2. hybridoma: 1~3 x 106cells/ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。
1.5. 冷冻保护剂浓度为5或10％DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。
1.6. 冷冻方法：
1.6.1. 传统方法: 4℃10分钟---> -20℃30分钟---> -80℃16-18小时(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 长期储存。
1.6.
2. 程序降温：利用等速降温机以–1～–3℃/分钟之速度由室温降至–120℃，放在液氮槽vapor phase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。
2. 材料：
2.1. 生长良好之培养细胞
2.2. 新鲜培养基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5. 0.4 ％w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6. 血球计数盘与盖玻片
2.7. 等速降温机(KRYO 10 Series II)
3. 步骤：
3.1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
3.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。
3.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液((约0.1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
3.4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 106 cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
3.5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃10 分钟→-20℃30分钟→-80℃16～18小时(或隔夜)→液氮槽vapor phase长期储存。
3.6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为: program 7: HB CELL
基础篇-冷冻细胞活化
1. 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2. 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)。
3. 材料：
37℃恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶，液氮或干冰容器
4. 步骤：
4.1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
4.2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
4.3 将新鲜培养基置于37 C水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
4.4 取出冷冻管，立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70% ethanol 擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。
4.5 取出0.9 ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例1:10～1:15)，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。另取0.1 ml 解冻细胞悬浮液作存活测试。
4.6 解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10 ml 培养基之离心管内，离心1,000 rpm, 5 分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2 培养箱培养。
4.7 若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。
基础篇-收到细胞的处理方式(一)
1. 收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于–70 C，隔夜后，移到液氮)。
2. 冷冻细胞解冻程序:
2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类，若因实验需要，必须有所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，方进行所需之实验。
2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。
2.3. 将培养基置于37 C 水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。取出冷冻管，立即放入37 C水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化后，以70% ethanol 擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台内。
2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10ml培养基加至T25或T75 flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25或T75 flask内之培养基，混合均匀，放入37 C，5 % CO2 培养箱培养。
2.5. 对绝大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO 者，则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，离心300 xg (约1000 rpm)，5分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，转移至培养瓶中，再放入37 °C，5 % CO2 培养箱培养。
基础篇-收到细胞的处理方式(二)
收到T25 flask 细胞时，处理方式为︰
1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。请检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。
2. 将原封之T25 flask 静置于37 °C，5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至37 °C，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出flask内之培养基，(取出之培养基可以再
使用)，仅留约5-10ml 培养基于flask 内，依一般培养方式再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，则将细胞做传代培养。
1. 原理：
1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter粒子计数器自动计数。
1.2. 血球计数盘一般有二个chambers，每个chamber中细刻9个1 mm2 大正方形，其中4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为0.1 mm。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104，即为每ml 中之细胞数目。
1.3. 存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
2. 材料：
0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip)，计数器(counter)，低倍倒立显微镜
粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics)
3. 步骤：
3.1. 取50ml细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
3.2. 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosinbluish)。
3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以104，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml
*每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml
3.4. 若不用血球计数盘，可用Coulter counter作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。
3.5. 范例：
T75 monolayer culture制成10ml细胞悬浮液，取0.1 ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。
活细胞数/方格：55, 62, 49, 59
死细胞数/方格：5, 3, 4, 6
细胞总数= 243
平均细胞数/方格= 60.75
稀释倍数= 2
细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
细胞数/flask：1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %
小胶质细胞培养及鉴定
2．1小胶质细胞的原代细胞培养 2．1．1混合胶质细胞培养自中山大学北校区动物中心购买刚出生1天内的SD乳鼠，用75％酒精消毒后固定四肢，剪开皮肤、颅骨，取出脑组织放入PBS液中洗涤一次，分离脑干取出，脑膜及血管尽量剥离，将组织放入盛有DMEM／F12无血清培养基的培养皿中，移至离心管中剪碎，加入浓度为0．125％的胰蛋白酶，37。C水浴箱中消化15分钟，血清终止消化，待组织沉淀后收集上液，余下组织可通过反复吹打进行再次消化，经过709m细胞滤网过滤，收集滤液，1500r ／min离心5分钟，去上清，加入完全培养基悬浮细胞后进行细胞计数，以1*106接种至预先用多聚．L．赖氨酸铺被的75cm2培养瓶中。24d'时后稍微轻摇下未贴壁及贴壁不稳的细胞碎片，全量更换培养基，随后4天／次换液，约至10天左右可见明显的细胞分层，上层为半贴壁，呈圆形，透光性较好，主要为小胶质细胞及少量的少突胶质细胞，下层细胞主要为星形胶质细胞、神经元。 第一章原代小胶质细胞的培养、纯化及鉴定 2．1．2小胶质细胞分离及纯化：机械振摇法：将铺满胶质细胞／神经元的培养瓶置于摇床振摇，180r／min，15rain，将培养基吸出，并用PBS冲洗1遍，收集脱落的细胞，1500r／s 5min离心，去除上清液，加入完全培养基，吹打混匀，计数，(34+39+30+33)／4×104／ml，以3×105／孔的浓度将细胞种入6#L板(已放置盖玻片)，37。C 5％C02温箱培养15．30分钟，更换培养基，即去除延迟贴壁的少突胶质细胞，贴壁细胞即为纯化的小胶质细胞。分离后的底层混
合细胞继续加入15％FBSDMEM／F12培养基，4．5天后可以再次收获小胶质细胞。 2．1．3免疫荧光鉴定步骤 1)小胶质细胞接种第2—3天后，待细胞在盖玻片上伸出伪足时，自培养箱中取出。 2)用预温的PBS洗3次，每次5分钟 3)4％多聚甲醛室温固定20分钟左右 4)PBS洗3次，每次5分钟 5) 5％BSA室温封闭30分钟 6)加抗Iba抗体(用1％BSA稀释)放在湿盒里，4V过夜 7)PBS洗3次，每次5分钟 8)DIIFITC．山羊抗小鼠IgG(用1％BSA稀释)避光孵育1小时 9)PBS洗3次，每次5分钟 10)DIIDAPI(用1％BSA稀释)避光孵育5分钟 11)1xPBS洗3次，每次5分钟 12)95％甘油封片
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结)
细胞培养集锦(一个培养300多种细胞人的经验总结) 一、消化与吹打 版上很多朋友讨论细胞培养问题，见到很多很好的经验总结，这里说一些我个人的经验，因为一些比较特殊的原因，我自己培养接触过近300种细胞，常用于做实验的，累积有百余种，可以说遇到过许多各式各样古怪的细胞。这里挑细胞消化开始做我的第一篇专题，并不是因为细胞消化最重要，而是近期看到大家频繁讨论这个话题，我就抛砖引玉，下面几点拙见，可能与其它朋友总结的一些经验有点出入，仅供大家参考。 许多同学对细胞消化做了许多研究，得出了很多有价值的经验，也见到很多人的困惑。其实细胞培养，尤其是细胞系的培养，就消化而言，不是太难，做得多了，善于总结经验，就能把细胞越养越好。一般的程序步骤，细节操作，我这里就不讲了，只讲一些基本操作背后的知识，如果不对之处，欢迎指正，一起讨论： 1，其实绝大部分细胞消化的时候是只要用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留的那些无法计算体积的附着在细胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，连续这样传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2，什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般你肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙壮移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，说明细胞与培养基质材料的附着已经消失了，细胞之间的附着也已经消失了，细胞已经独立分布了（虽然没有呈现很广的离散分布）。这个时候应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养
细胞培养标准流程
细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安 全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞 接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO2 放置40s-1min,，轻轻 拍打圆盘侧壁促使细胞脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10%FBS的完全培养基终止消
化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁， 呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例 传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml 全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合 时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及 生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后）细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。 以6 孔板为例，转染前细胞先换液，加4ml全培。 取1.5 ml 离心管，加入400 μL 无血清无双抗DMEM 培养液，加入质粒2 μg，混匀后静置5 min，再转染试剂4 μL，混匀（转染试剂是质粒的2倍），室温静置15－20 min。 (转染试剂需加在培养液中部，切忌勿贴壁;静置时间不可超过20 min）
细胞培养
1．观察培养基是否正常，细胞状态如何，细胞密度如何，决定是否传代。观察时拧紧盖子。 2．加热PBS、versene、培养基，(提前做好) 瓶子不要倒着放，不要让液体接触到瓶塞。 3．打开超净台（先开风机，后开照明），用75%乙醇清洁台面，点燃酒精灯。不要把废液缸拿出去倒，如果废液太多，可以用其他容器先装废液。取小离心管一个，置于架子上。 4．取尖吸管、吸量管各一支，放置在专用的架上。放置的方式，注意吸管、吸量管前端都不要与架子接触。5．取待传代的细胞。打开versene，用酒精灯外焰烧。烧吸管时距离酒精灯心远些，不要把渣滓带进去。把试剂拿入台子的时候，尽量平稳，不要让试剂碰到瓶口。 6．用吸量管吸取旧的培养基，置离心管中，吸量管加入versene，然后将versene瓶收起来。（加versene 主要是为了将旧培养基洗去）。在离心管中间部分将液体加入。吸液体和加液体时都不要对着细胞。7．打开胰酶，然后将versene弃掉。换新管，用尖吸管吸取适量胰酶加入。加胰酶后，尽快放平，使细胞消化时间一致。 8．将细胞放入37度孵箱。放孵箱2min, 收胰酶，打开PBS. 之后拿出来镜下随时观察。使用二次消化法，去除容器中残余的细胞。别忘了用旧培养基中和。 9．取细胞，镜下观察消化情况。消化程度合适之后（细胞变圆，但不漂起），用尖吸管弃去胰酶，取离心管中的培养基加入细胞，吹打，至所有细胞从培养皿底部脱落下来。用PBS洗细胞，versene对细胞有毒性，且不能被血清中和。然后吸取至离心管中，800 rpm离心5分钟。 10．吸量管吸取适量培养基加入新的培养皿中。 11．细胞离心毕，用吸新培养基的管弃去上清，先把泡沫吸走。换吸量管吸取培养皿中培养基适量，加入离心管，小体积混匀，将细胞重悬，尖吸管吹匀。 12．擦计数板，用枪吸10ul的液体，计数。不要把枪伸到离心管内。 13．吸量管吸取细胞悬液，加入新的培养皿中。镜下观察，摇匀，放入37度孵育。收超净台。 293T细胞 培养条件： 37℃，5% CO2，PH值~，无菌恒温培养。 细胞相关操作： 细胞复苏 1. 37°C水浴预热培养基（DMEM+10% FBS）； 2. 从液氮中取出细胞迅速放入37°C水浴快速解冻（解冻后不要继续暖细胞）； 3. 在超净台中加入5ml培养基重悬细胞，1000rpm离心5min； 4. 弃上清，加入5ml培养基重悬细胞后转入T25培养瓶中，轻轻晃匀； 5. 置于37°C，5% CO2培养箱中培养(培养瓶盖没有透气孔的话,瓶盖不要拧太紧)； 6.第二天，用新鲜的培养基给细胞换液后继续培养。 细胞传代 1. 当细胞融合度达到90%以上时，给细胞传代；
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血
树突状细胞培养与鉴定
树突状细胞的培养与鉴定 【摘要】目的研究利用磁珠分离方法获取单核细胞，用细胞因子gm-csf和il-4联合诱导使之分化为树突状细胞（dendritic cells, dcs）的方法，并对培养的细胞从形态，表型，功能等三个方面进行鉴定，从而探索出一套较成熟的dcs的培养方法。方法通过密度梯度离心的方法获取白细胞悬液中的白膜层，然后通过磁珠分离的方法，收集高纯度的单核细胞。在细胞因子gm-csf和il-4的刺激下，将细胞培养至7天左右，收集细胞进行流式分析，并进行淋巴细胞增殖实验，鉴定细胞是否为树突状细胞。结果在倒置显微镜下观察，细胞培养第7天，大部分细胞呈单个悬浮，并有明显的毛刺样突起。流式分析发现细胞高表达dc表面特异性抗原 cd80，cd86，hla-dr，并且不再表达单核细胞表面抗原cd14，细胞纯度约为93.12%。淋巴细胞增殖实验显示dcs可明显刺激初始型淋巴细胞增殖。结论通过磁珠分离的方法获得单核细胞并利用 gm-csf和il-4细胞因子诱导可成功培养出纯度高的树突状细胞。【关键词】树突状细胞；磁珠；流式 molecular and functional characteristics of dendritic cells differentiated from highly purified blood monocytes. 【abstract】 objectives：to develop a simple and efficient method to generate human dendritic cells (dcs) from highly purified cd14 + monocytes from human peripheral blood. methods：monocytes were purified by negatively sorting
贴壁细胞培养完整版
贴壁细胞培养 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
贴壁细胞培养 一、克隆形成抑制试验 原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在-1.0 mm之间。通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。 材料与方法 （一）用品： 含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养液PBS、%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。 （二）操作： ①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密度为 3×102个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。 PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出至另一小瓶，3ml 10%培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数 倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。Mix。） 吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。 重复。 直到需要的细胞数。12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。 种板：12孔板，加培液，加1ml细胞，不用摇。 ②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，，，，， ，饱和湿度条件培养箱内孵育μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO 2 7天。 计数： 满体积2000ul 其中药物浓度100ug/ml 100ul NS: 0 100 N=2 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = + NS N=2
细胞转染技术原理及应用
细胞转染技术原理及应用 常规转染技术可分为两大类，一类是瞬时转染，一类是稳定转染（永久转染）。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中，因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天，多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说，超螺旋质粒DNA转染效率较高，在转染后24-72小时内（依赖于各种不同的构建）分析结果，常常用到一些报告系统如荧光蛋白，β半乳糖苷酶等来帮助检测。后者也称稳定转染，外源DNA 既可以整合到宿主染色体中，也可能作为一种游离体（episome）存在。尽管线性DNA比超螺旋DNA转入量低但整合率高。外源DNA整合到染色体中概率很小，大约1/104转染细胞能整合，通常需要通过一些选择性标记，如来氨丙基转移酶（APH；新霉素抗性基因），潮霉素B磷酸转移酶（HPH），胸苷激酶（TK）等反复筛选，得到稳定转染的同源细胞系。 转染技术的选择对转染结果影响也很大，许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。一些传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿 孔法，脂质体法各有利弊 近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亚胺（Polyethylenimine，PEI）的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂 的基因载体时，PEI经常做为核心组成成分。 线型PEI（Line PEI,LPEI）与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI（Branched PEI,BPEI）要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI 的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性 低，但转染效率却较高。 GenEscort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有较高的正电性，因此易于高效地包裹各种DNA、RNA分子及质粒形成小的纳米颗粒，从而提高转染效率，当所形成复合物进入细胞以后，其中所含的生理条件下可降解的化学键在细胞内水解，使交联聚合物分解为无细胞毒性的小分子PEI，这样结构的转染试剂在体外应用可以获得高的转染效率和低的细胞毒性，其可降解性对体内应用也具有重要的意义。
细胞培养标准流程
精品文档 细胞间基本规定 每次操作结束后开启超净台紫外（30 min）和房间大紫外（30 min）。 显微镜开启使用后将光调暗，最后一个操作者将显微镜关闭。 超净台用完收拾干净，移液器、盒子等摆放整齐。 带走空盒子、细胞圆盘以及封口膜等任何因你而产生的垃圾。 细胞培养盘至少需备注：所属者，细胞系名称 细胞间冰箱内物品至少需备注：所属者，物品名称。基培需写上开启时间。 细胞培养标准流程 1、细胞换液、传代（以圆盘培养为例） Note：所有用于培养细胞的液体均需提取20-30分钟从冰箱取出恢复到室温或置于37℃的水浴箱内。所有物品（包括双手）进入安全柜之前要酒精消毒。 步骤：1.观察：高倍镜下观察细胞状态、密度以及是否染菌 2.弃旧：细胞生长融合达90%时，吸出培养基 3.漂洗：PBS（2mL）漂洗1-2次 4.消化：加入1ml 0.25%胰蛋白酶，轻轻晃动圆盘让所有细胞接触到胰酶，后吸去胰酶计时CO放置40s-1min,，轻轻拍打圆盘侧壁促使细胞2 脱壁。 5.终止：吸弃胰酶后加入2ml含10?S的完全培养基终止消化。 6.吹悬：轻轻吹打混匀，(倒置显微镜下观察细胞完全脱壁，呈卵圆形)，吹打成单细胞悬液后按1：2 或1：3 比例传代接种于新培养皿。再加入10ml全培。（大盘10ml全培，小盘6ml全培） （细胞生长快留30%，慢40%-50%；其余细胞可提取蛋白或RNA） 7.培养：每天或每两天更换一次培养基，直至细胞生长至融合时再次进行传代，每日在倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况。 PS:六孔板一般加培养基2300μL/孔。 . 精品文档 2、细胞转染 TurboFect 转染试剂转染（用于质粒的转染，说明书附后） 细胞接板24 h 后转染。转染时细胞密度需达到70-90%。
细胞培养与细胞生死状态的鉴别
姓名程开源系年级2010级临床医学八年制组别同组者孙琳 科目分子细胞生物学目细胞培养与细胞生死状态的鉴别学号201000232012 【实验目的】 1.学习并掌握动物细胞培养的无菌操作技术。 2.了解并掌握用组织块贴壁培养法和消化细胞培养法进行动物细胞原代培养的实验方法。 3.熟练掌握动物细胞传代培养的实验方法。 4.学习细胞生死状态鉴别的方法。 5.了解细胞生死状态鉴别的原理。 6.熟悉和掌握各种鉴别细胞生死状态方法的判定特征。 7.掌握细胞技术方法，计算细胞存货率。 【实验原理】 细胞培养指的是在无菌条件下，把动、植物细胞从组织中取出，在体外模拟体内的生理环境，使离体的细胞在体外生长和繁殖，并且维持其结构和功能的一种培养技术。动物细胞培养可分为原代培养和传代培养。从供体获得组织细胞，在无菌条件下，用胰蛋白酶消化或机械分散等方法，将动物组织分散成单个细胞开始首次培养长出单层细胞的方法称为细胞的原代培养。当培养的动物细胞生长增殖达到一定密度，形成致密的单层细胞时，用胰蛋白酶将细胞消化分散成单细胞，从一个容器中以1：2或其他比例转移到另一个容器中扩大培养的方法，称为细胞的传代培养。传代培养的累计次数就是细胞的培养代数。 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内的功能活动是十分困难的。但如果把活细胞拿到体外培养、增殖并进行观察和研究，则要方便和简单得多。被培养的动物细胞是非常好的实验对象和实验研究材料，对体外培养的活细胞进行研究可以帮助人类揭开生、老、病、死的规律，探索优生、抗衰老和防治各种疾病的途径和机制，也可以人为地诱导和改变细胞的遗传性状和特性，使其向有利于人类健康长寿的方向发展。因此动物细胞体外培养技术是研究细胞分子机制非常重要的实验手段，被广泛应用于医学、生物技术、基因工程等研究领域。 细胞生死状态的鉴别方法主要是化学染色法和荧光染色法。 活细胞和死亡细胞在生理技能和性质上主要存在一下差异：①细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜，对细胞起保护和屏障作用，只允许物质选择性地通过；而细胞死后，细胞膜受损，其通透性增加。基于此，发展出了以台盼蓝、伊红、苯胺黑、赤藓红、甲基蓝以及荧光染料碘化丙啶或溴化乙啶等为染料鉴别细胞生死状态的方法，上述染料能使死亡细胞着色，而活细胞不被着色。此外，应用植物质壁分离的性质也可鉴定植物细胞的生死状态。活细胞的原生质具有选择透过性，死细胞因其原生质的选择透过性已遭破坏，故与高渗透压溶液接触时不产生质壁分离。②代谢上的差异：活细胞中新陈代谢作用强，细胞内的酶具有较强的活性和还原能力。基于此，发展处了以荧光素二乙酸酯（FDA）、荧光素二丙酸酯、荧光素二丁酸酯或荧光素二苯甲酰酯等酯化的荧光素鉴别细胞生死状态的方法，上述酯化的荧光素亲脂性提高，容易被细胞吸收进入，活细胞内的酯酶具有较强的活性，可将酯化的荧光素分解而释放出能发荧光的荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积累在细胞内，荧光显微镜下显示有明亮的绿色或黄绿色荧光；而死亡细胞内的酯酶因失去活性，不能分解酯化的荧光素，荧光显微镜下显示不发光。另外，可用亚甲基蓝为染料鉴定酵母细胞的生死状态。亚甲基蓝是一无毒染料，氧化型为蓝色，还原型为无色。活细胞因具有较强的还原能力，能使亚甲蓝从蓝色的氧化型变成无色的还原型，故活的酵母细胞在用亚甲基蓝染色后显示无色；死亡酵母细胞或代谢缓慢的衰老酵母细胞，因无还原能力或还原能力极弱，使亚甲蓝仍处于氧化态，故呈现蓝色或淡蓝色。 【实验材料】 1.超净工作台、二氧化碳培养箱、离心机、眼科剪、眼科镊、培养皿、培养瓶、离心管、微量加样器、吸管、酒精灯；小鼠、培养基 2.血球计数板、盖玻片、滴管、显微镜；培养的小鼠脾脏细胞、台盼蓝、伊红 【实验步骤】
细胞传代标准操作规程版
细胞传代培养SOP（消化法） 具体步骤如下： 1. 传代前准备： 1.1预热培养用液：把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热。 1.2 用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 1.3 正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。 1.4 点燃酒精灯：注意火焰不能太小。 1.5 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶，放入微波炉内高火，8 分钟再次消毒。 1.6 取出预热好的培养用液：取出已经预热好的培养用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 1.7 从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。 1.8 打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶-EDTA消化： 2.1加入消化液：小心吸出旧培养液，用PBS清洗（冲洗），加入适量消化液（胰蛋白酶-EDTA液）,注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37T < 2.2 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。 2.3 吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞： 3.1 吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 3.2吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.3 平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中，以1000转/分钟离心6-8 分钟。 3.4弃上清液，加入新培养液：弃去上清液，加入2ml培养液，用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞： 4.1 分装：将细胞悬液吸出分装至2-3 个培养瓶中，加入适量培养基旋紧瓶盖。 4.1 显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察细胞量，必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长，传代细胞的密度应该不低于5X 105/ml。最后要做好标记。 5. 继续培养： 用酒精棉球擦拭培养瓶，适当旋松瓶盖，放入CO培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25％时
细胞转染的详细过程
细胞转染的详细过程 1、准备工作如下： 1)从pFastBacTM construct中纯化重组的bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中) 从相应的pFastBacTM construct对照中纯化bacmind DNA(500ng/μl溶于TE中)。 细胞培养在适合的培养基中。 细胞转染剂Cellfectin（4℃储存）无任何添加物（例如：FBS，抗生素等）的细胞培养基。用于细胞培养的完全生长培养基（例如：Sf-900ⅡSFM TNMFH 或其他适合的培养基）。2)在6孔板或是35毫米dish上，每孔培养9*105Sf9细胞，细胞培养于2ml含抗生素的生长培养基中。 3)细胞在27℃孵育至少一小时。 4)对于每一个转染的样品，准备bacmid DNA：与细胞转染剂在12*75mm消毒管中进行如下混合： 用100μl无血清培养基稀释1μl纯化的bacmid DNA。 用100μl无血清培养基稀释6μl 细胞转染剂。 将bacmind DNA与细胞转染剂进行混合，动作要轻柔，混合物在室温下孵育45分钟。 5)当DNA与脂质体进行孵育时，移去细胞原有的培养基并用2ml无血清培养基洗一次，移去用来清洗的无血清培养基。 6)在每一个含有DNA与脂质体混合物的管子中加入0.8ml无血清培养基，轻柔混合，分别把DNA与脂质体混合物加入含有细胞的孔中。 7)细胞在27℃孵育5小时。 8)从细胞中移去DNA与脂质体混合物加入2ml完全生长培养基。 9)将细胞在27℃进行孵育，实验人员必须每日观察，记录转染细胞的生长状态，细胞在转染后48小时长势应该比较良好，但72小时后直至可以看到明显的病毒感染的细胞病变。 2、第一代代病毒的收集与保存 1)当转染的细胞呈现出感染后期的形态时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml 压盖管中。 2)以500*g离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 3)将离心后的上清移到新的15ml压盖管中，用来保存第一代病毒，存放于4℃避光保存。 3、病毒的保存 1)病毒存放于4℃避光保存。 2)如果用的是无血清培养基，则加入终浓度为2%的FBS 。血清蛋白可以作为蛋白酶的底物。 3)长期保存时将一部分病毒储存在-80℃用于病毒的重新扩增。 4)病毒的常规储存不要低于4 ℃.病毒经过反复冻融会使其滴度下降10 到100倍。 4、杆状病毒的扩增 1)准备sf9细胞，2*106/孔，在室温孵育1小时。 2)在孵育1小时以后，用倒置显微镜观察昆虫细胞的贴壁情况。 3)在每孔中加入适量的P1代病毒。 4)在27℃进行孵育48小时。 5)在感染后48小时，收集每孔含有病毒的上清，转移到灭菌的15ml压盖管中。以1000*g 离心5分钟，从而移去上清中所含有的细胞及大的碎片。 5、病毒空斑分析 1)准备工作如下： 澄清的杆状病毒保存于4℃ 培养在适当培养基中的sf9细胞（30ml 5*105/ml对数生长期的细胞用于每一个滴度的杆状
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定
小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 发表时间：2012-05-24T09:50:06.677Z 来源：《医药前沿》2012年第1期供稿作者：林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 [导读] 分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。 林芸1 蔡鹏威2 陈为民1 孟春3 ( 1 福建医科大学省立医院临床学院血液科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 2 福建省立医院检验科福建福州 3 5 0 0 0 1 ) ( 3 福州大学生物工程学院福建福州 3 5 0 0 0 1 ) 【摘要】目的分离、培养符合实验要求的小鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定，为进一步的研究打基础。方法采用贴壁培养法培养小鼠骨髓间充质干细胞，观察细胞的形态及生长特性，并应用流式细胞仪对细胞表面抗原CD34、CD45、CD29、CD44进行表型鉴定。结果原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，培养第7天开始观察到细胞分裂，随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。流式细胞仪检测第4代及第8代MSCs细胞均不表达CD34、CD45，但表达CD29、CD44，纯度分别为73.8% 、91.65%。结论采用贴壁培养法可获得生长状态良好、增殖能力强的间充质干细胞，随传代数增加，其纯度增加，且该方法简单、实用。 【关键词】骨髓间充质干细胞细胞培养流式细胞术表型鉴定 【中图分类号】R392.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0082-02 间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）起源于中胚层，具有高度增殖和自我更新的能力，有向骨、软骨、脂肪、血管内皮细胞、神经星型胶质细胞等分化的潜能[1]，可分化成骨髓基质支持造血，并可分泌多种细胞因子促进造血干细胞增殖分化，同时它能抑制同种异体反应性T淋巴细胞，在同种异基因造血干细胞移植后的造血重建及免疫调节，预防移植物抗宿主病等方面有广阔的应用前景[2]，但骨髓间充质干细胞含量极低，仅占骨髓单个核细胞的0.001%-0.010%[3]，因此，培养出生长状态良好，足够数量的骨髓间充质干细胞是应用的前提。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物雄性，C57B L/6小鼠，清洁级，8周龄，体重18-20g，购于吴氏动物实验中心。 1.1.2 实验仪器与试剂低糖DMEM培养基（Gibco公司），特级胎牛血清（Hy c l o ne公司），胰蛋白酶（Si gma公司），青霉素钠（Si gma公司），链霉素（Si g m a公司），5%C O2培养箱（日本三洋公司），流式细胞仪(BD FA CSCalibur)，倒置显微镜（OLYMPUS），大鼠抗小鼠单克隆抗体：CD29-PE、CD44-FITC、CD34-PE、CD45-FITC（BD公司）。 1.2 方法 1.2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的分离及原代培养取8周龄雄性C57BL/6小鼠，颈椎脱臼法处死，75%酒精浸泡5分钟，取出双侧腿骨，置于装有P BS溶液的培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，移入装有预冷的含10%特级胎牛血清、青霉素钠100U/ml、链霉素0.1g/L 的低糖DMEM培养液的培养皿中，剪去腿骨两端，用1m l注射器抽取培养液反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，收集冲洗液，反复吹打使细胞打散，静置10分钟，小心将上清移至灭菌的10m l离心管中，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-D M EM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，4℃3000r p m离心3分钟，弃上清，再用含10%特级胎牛血清的L-DMEM培养液重悬细胞，反复吹打混匀，调整细胞密度为5×105个/ml接种于25cm2培养瓶中，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中培养4小时后，轻轻吸出上清，并加入新鲜培养液。培养24小时后轻轻吹打，使未贴壁的细胞悬浮，吸出上清，加入新鲜的培养液，继续培养。以后每天换液1次，并观察细胞形态。 1.2.2 小鼠骨髓间充质干细胞的传代培养原代细胞生长接近瓶底的80%时，吸去上清，加入0.125%胰蛋白酶，37℃条件下消化并观察细胞形态，待细胞呈球形、不在粘连时吸弃胰酶，加入新鲜培养液重悬细胞，4℃3000r pm离心3分钟，弃上清，再加入培养液重悬细胞，反复吹打混匀，按1:2比例接种到新的培养瓶，置于5%C02，37℃，饱和湿度95%的培养箱中继续培养，仍然每天换液，直至细胞贴壁融合成片，接近瓶底80%时，重复以上操作，再次传代。 1.2.3 小鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定收获第4代及第8代生长良好的细胞，胰酶消化后，4℃1000r p m离心5分钟，弃上清，PBS洗涤细胞2次，每代细胞分别设2管，调节每管细胞数为5×105,分别加入C D29和C D44、CD34和CD45单抗，室温孵育30分钟，PBS洗涤细胞3次，流式细胞仪检测分析，同时用PBS作为一抗设置阴性对照。 2 结果 2.1 小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养及扩增培养4小时后吸出上清，加入新鲜培养液后，大多数悬浮细胞被吸出，瓶中细胞数目明显减少，并且都呈现球转，折光率较强，原代分离的间充质干细胞在接种后培养24小时，细胞开始贴壁，胞体呈圆形或多边形，培养第3-5天，细胞开始较紧密贴附壁上并开始有细胞呈梭形，并不断长大、变长，但未观察到细胞分裂，培养第7天开始观察到细胞分裂（图1），随着细胞数的增加，细胞的生长速度变快，逐渐成漩涡状排列，培养第12天贴壁细胞长满瓶底的80%，并融合成片（图2）。传代后细胞生长迅速，培养7天左右即可长满瓶底的80%。传至10代仍具有良好的增殖活性。
细胞转染的操作步骤
细胞转染的操作步骤 转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。红外碳硫仪理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。 >需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。 一、细胞传代 1. 试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。 2. 弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。 3. 用Tip头加入1ml Trypsin液，消化1分钟。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。 4. 加入1ml的含血清培养基终止反应。 5. 用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。 6. 将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。 7. 用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。8. 将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。 9. 将培养皿转入培养箱中培养，第二天转染。 二、细胞转染 1. 转染试剂的准备 ①将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。 ②震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。 2. 选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。 3. 将混合液在室温放置10―15分钟。 4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。 5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。 6. 到时后，红外碳硫仪根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。三、第二次细胞传代1. 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。 2. 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X10 个细胞/35mm培养皿将细胞重新转入培养皿中。 3. 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
细胞培养技术
细胞培养技术 指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织（动物）。 定义 培养物是单个细胞或细胞群。细胞在培养时都要生活在人工环境中，由于环境的改变，细胞的移动或受一些其他因素的影响，培养时间加长，传代导致细胞出现单一化型。 在现代医学和生物科学研究中应用广泛 优点 1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究. 2.直接观察细胞的变化可便于摄影。 3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。 4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。 5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。 6.易于施用物理、化学生物的实验研究。 7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。 8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。 缺点 组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。 细胞类型 细胞类型根据是否附于支持物上生长的特性，分为: 贴附型悬浮型（一）贴附型 细胞贴附在支持物表面生长，只依赖贴附才能生长的细胞叫做贴附型细胞(Anchorrage-dependent cells)这种现象与细胞分化有关。 贴附型细胞的分型 1.成纤维型细胞：(fibroblast) 来自中胚层 特点：与体内成纤维细胞形态相似,胞体梭型或不规则三角形,中央有圆形核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞在生长时呈放射状,漩涡或火焰状走行。 起源：细胞来自中胚层间充质组织。 除真正的成纤维细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮细胞。
HSC-T6细胞培养及鉴定实验报告
HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告 前言 肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的名称有多种多样，如肝贮脂细胞（fat-storing cell，FSC）、脂细胞（1ipocyte）、维生素A贮存细胞（vitamin A-storing cell）、窦周细胞（perisinusoidal cell）、Ito细胞等。HSC位于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells, SEC）和肝细胞。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。此外，HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。HSC胞质内有1～14个直径约1.0～2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴，胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。胞核形态不规则，由于脂滴的挤压，常致细胞核有一个或多个凹陷，核内可见1～2个核仁。正常肝脏中HSC的数目很少，只占肝细胞总体数目的5%～8%及总体体积的1.4%，但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。 正常情况下HSC表现为富含Vitamin A脂滴的静止型，其功能主要有： （1）代谢和贮存Vitamin A：肝脏储存有体内80%左右的维生素A，对体内维生素A的代谢起着重要作用。视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合，然后转运到邻近的HSC储存。 （2）储存脂肪：正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯，为肝细胞提供能源。 （3）合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。目前的研究认为，HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的主要合成细胞。正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主，其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。HSC 还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。 （4）合成基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase, MMP）及其组织抑制剂（tissue inhibitor of metallo proteinase，TIMP）:正常情况下，HSC能分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-2等以降解各种细胞外基质，同时分泌组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1防止胶原过度降解，使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中。 （5）表达细胞因子及受体：正常情况下，HSC可以分泌肝细胞生长因子（HGF），参与肝细胞再生的调控。此外，HSC还能表达少量的转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生的生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）和胰岛素样生长因子（IGF）等，同时HSC能表达TGF-β1的II、III型受体和PDGF受体的α亚单位等。