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噬菌体效价

噬菌体效价
噬菌体效价

噬菌体的分离纯化及效价的测定

1 目的

1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。

1.2 学会检查噬菌体的方法。

1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。

2 原理

噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒,其个体形态极其微小,用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解,释放出

大量子代噬菌体,然后它们再扩散和侵染周围细胞,最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清,或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性,快速

检查、分离,并进行效价测定,对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。

检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等(至于无法采样而需检查的对象,可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品)。为了易于分离可先经增殖培养,使样品中的噬菌体

数量增加。

采用生物测定法进行噬菌体检查,约需12h左右,因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染,以采取必要的防治措施。根据正常发酵(培养)液离心后菌体沉淀,上清液蛋白含量很少,加热后仍然清亮;而侵染有噬菌体的发酵(培养)液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白,加热后发生蛋白质变性,因而在

光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速,对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断,对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往

不适用。

噬菌体的效价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼

脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上,一般一个噬菌体产生一个噬菌斑,故可

根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数,计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌

斑的形态、大小较一致,且清晰度高,故计数比较准确,因而被广泛应用。

3 材料

3.1 菌种

敏感指示菌(大肠杆菌)、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。

3.2 培养基

二倍肉膏蛋白胨培养液,上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基(含琼脂0.7%,试管分装,每管5mL),下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基(含琼脂2%),1%蛋白胨水培养基。

3.3 仪器和器具

无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管(1、5mL),恒温水浴锅,离心机等。

4 流程

4.1 噬菌体的分离纯化鉴定

4.2 噬菌体效价的测定

5 方法

5.1 噬菌体的检查

5.1.1 样品采集

将2~3g 土样或5mL 水样(如阴沟污水)放入灭菌三角瓶中,加入对数生长期的敏感指示菌(大肠杆菌)菌液3~5mL,再加20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。

5.1.2 增殖培养

30℃振荡培养12~18h, 使噬菌体增殖。

5.1.3

噬菌体的分离

(1)制备菌悬液取大肠杆菌斜面一支,加 4ml 无菌水洗下菌苔,制成菌悬液。

(2)增殖培养于 100ml 三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中,加入污水样品

200ml 与大肠杆菌悬液 2ml,37℃培养 12~24 小时。

(3)制备裂解液将以上混合培养液 2500r/min 离心 15 分钟。将以灭菌的蔡氏过滤器用

无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上,用橡皮管连接抽滤瓶与安全瓶,安全瓶再连接于真空泵(如图 2)。图上的真空表接或不接均可。

将离心上清夜倒入滤器,开动真空泵,过滤除菌。所得滤液倒入灭菌三角瓶内,37℃培养过夜,以作无菌检查。

(4)确证试验经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在。

(a)于肉膏蛋白胨琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液,再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均

匀的一薄层。

(b) 待平板菌液干后,分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面,里 37℃培养过夜。如果在滴

加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑,便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。

噬菌体的纯化

(1)如果已证明确有噬菌体的存在,便用接种环取菌液一环接种于液体培养基内,再加人0.1 毫升大肠杆菌悬液,使混合均匀。

( 2 )取上层琼脂培养基,溶化并冷至 48℃(可预先溶化、冷却,放 48℃水溶箱内备用), 加入以上噬菌体与细菌的混合液 0.2 毫升,立即混匀。

( 3 )并立即倒人底层培养基上,混匀。置 37℃培养 12 小时。

( 4 )此时长出的分离的单个噬菌斑,其形态、大小常不一致,再用接种针在单个噬菌斑中刺一下,小心采取噬菌体,接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于 37℃培养。

(5)等待管内菌液完全溶解后,过滤除菌,即得到纯化的噬菌体。

(以上(1 ) ( 2 ) ( 3 )三步骤,目的是在平板上得到单个噬菌斑,能否达到目的,决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量,最好在做无菌实验的同时,由教师先

做顶备试脸,若平板上的噬菌体连成一片,则需减少接种量(少于一环)或增加液体培养

基的量;若噬菌斑太少,则增加接种量。以免全班同学重做)。

5.1.4 生物测定法

5.1.4.1双层琼脂平板法

5.1.4.1.1 倒下层琼脂

融化下层培养基,倒平板(约10mL/皿)待用。

5.1.4.1.2倒上层琼脂

融化上层培养基,待融化的上层培养基冷却至50℃左右时,每管中加入敏感指示菌(大肠杆菌) 菌液0.2mL,待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2~0.5mL,混合后立即倒入上层平板铺平。

5.1.4.1.3恒温培养

30℃恒温培养6~12h观察结果。

5.1.4.1.4 观察结果

如有噬菌体,则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──????噬菌斑。

5.1.4.2 单层琼脂平板法

省略下层培养基,将上层培养基的琼脂量增加至2%,融化后冷却至45℃左右,如同上法加入指示菌和检样,混合后迅速倒平板。30℃恒温培养6~16h后观察结果。

5.1.5 离心分离加热法(快速检查)

取大肠杆菌正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌培养液,4000rpm离心20min,

分别取两组发酵液的上清液(A1),一部分于721 分光光度计上测定OD650 光密度值,另外各取5mL上清液于试管中,置水浴中煮沸2min(A2),检测A2 溶液OD650 光密度值,记录结果。

5.2 噬菌体效价的测定

5.2.1 倒平板

将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11 个无菌培养皿中,每皿约倾注10mL培养基,平放,待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。

5.2.2 稀释噬菌体

按10 倍稀释法,吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体,注入一支装有 4.5mL1%蛋白胨水的试管中,即稀释到10-1,依次稀释到10-6 稀释度。

5.3 噬菌体与菌液混合

将11 支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。分别从10-4、10-5和10-6 噬菌体稀释液中吸取0.1mL 于上述编号的无菌试管中,每个稀释度平行做三个管,在另外两支

对照管中加0.1mL 无菌水,并分别于各管中加入0.2mL 大肠杆菌菌悬液,振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀,置37℃水浴中保温5min,让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。5.4.4 接种上层平板

将11 支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL 分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中,迅速搓匀,立即倒入相应编号的底层培养基平板表面,边倒

入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置,凝固后置37℃培养。

5.5 观察并计数

观察平板中的噬菌斑,并将结果记录于实验报告表格内,选取每皿有30~300 个噬菌斑的平板计算噬菌体效价。

计算公式:N=Y/V?X

(N:效价值,Y:平均噬菌斑数/皿,V:取样量,X:稀释度)

例如:当稀释度为10-6 时,取样量为0.1 mL/皿,同一稀释度中3个平板上的噬菌斑的平均值为186 个,则该样品的效价为:N=186/0.1×10-6=1.86×109。

6 结果

6.1 噬菌体检查

6.1.1离心分离加热法

处理方法OD650 光密度值

正常发酵液(对照)异常发酵液(试验)

离心上清液(A1)

离心上清液加热煮沸后(A2)

A2/A1

6.1.2 绘出平板上的噬菌斑检测结果,指出噬菌斑和宿主细菌。

6.2 噬菌体效价测定

6.2.1 平板上噬菌斑数目

对照

噬菌体稀释度10-4 10-5

10-6

噬菌斑数(个)/皿

平均每皿噬菌斑数目

6.2.2 计算噬菌体效价(即噬菌斑形成单位pfu, plague-forming unit).

7 思考

1 有哪些方法可检查发酵液中确有噬菌体存在?比较其优缺点。

2 测定噬菌体效价的原理是什么?要提高测定的准确性应注意哪些操作?

P1噬菌体转导敲除基因的实验步骤

P1噬菌体转导基因敲除操作步骤 实验室常用大肠杆菌基因敲除方法为P1噬菌体转导敲除。 大肠杆菌利用噬菌体为媒介,将供体细胞DNA转移给受体细胞,从而使受体细胞的基因型 和表现型发生改变,这一过程称为转导。P1噬菌体的DNA分子量为5.8×107Da,在复制过程中, 头部包装时容易发生错误包装,可将其宿主菌(供体菌)的基因组DNA误包入蛋白质衣壳内。 当用这一噬菌体裂解液侵染新的宿主菌(受体菌)时,供体菌的DNA片段可随P1噬菌体进入受 体菌内,并可以与受体菌基因进行同源重组,从而永久性的存在于受体菌基因组上。P1转导的频 率一般很低,需要选择性标记进行转导子筛选,本实验中为卡那霉素抗性基因(KmR)。 准备材料 LB液体试管,LB半固体培养基,LB固体培养基,20%(w/v)葡萄糖溶液,1M CaCl2溶液,1M MgSO4溶液,氯仿,1M柠檬酸三钠溶液; 效价109-1010(pfu/mL) P1噬菌体储液,大肠杆菌溶源性供体菌,大肠杆菌受体菌; TM buffer:10mM Tris-HCl(pH7.4)buffer加入10mM MgSO4; P1盐溶液:10mM CaCl2与5mM MgSO4的混合溶液; 实验步骤 平板培养法 准备野生菌种子液 自保存甘油管或划线培养平板上,转接到3mL LB液体试管中,37℃,250rpm,培养过夜 (12hr)。 制备野生型P1噬菌体 1.将野生型菌株的过夜种子液,按1%(v/v)转接5mL LB液体试管,摇床培养至对数中期 (~2*108细胞/mL,OD600=0.2~0.3)。 2.加入5mM CaCl2,继续培养至菌体细胞OD600=1。 3.取出野生菌培养液,低温聚菌,加入2倍体积的TM buffer重悬菌体。 4.倒下层平板,LB固体培养基中加入5mM CaCl2。 5.取2.5mL半固体LB培养基,加入0.25mL重悬菌液,混合均匀后倒在下层平板上,轻柔 地倾斜平板使其均匀地覆盖在下层培养基表面。(注意培养基的温度不可过高,以手触摸时感觉温度舒适,建议先分别分装到15mM无菌离心管内,待凉到温度适宜后加入菌液,迅速混匀倒平 板。) 6.待琼脂凝固后,点10ul P1噬菌体储液在上层细胞琼脂表面。待噬菌体储液被上层琼脂吸 收后,将平板正置放置37℃培养过夜。对照板只有细胞,同样正置培养。(spot方法获得 的噬菌体效价虽然高,但量太少,可能无法满足后续实验需求,可在步骤5中与上层细胞琼脂同时 混合后倒平板,亦可获得高效价噬菌体) 7.计算效价,刮取噬菌体。 转导大肠杆菌供体菌(keio collection) 1.准备供体菌种子液,同野生型菌体。 2.接种100uL至5mL LB液体试管中,接种前在LB液体中加入0.1%(w/v)葡萄糖。需接 种两支试管,一支做对照用。振荡培养约1.5hr,至菌体达到对数生长期 (OD600=0.2~0.3)。

噬菌体效价及转导实验

噬菌体效价测定及转导 姓名 学号: 系别:生命科学学院生物科学专业 班号: 实验日期:4月26日、5月3日 同组同学: 实验目的 1.学习噬菌体效价测定的方法 2.了解转导原理、学习转导实验方法

实验材料 菌种:E. coli K12 F、E. coli K12S、噬菌体裂解液 培养基:牛肉膏蛋白胨液体培养基、 EMB培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基 实验原理 1.噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法,一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上,一个噬菌体产生一个噬菌斑 2.噬菌体的悬浮液是由双重溶源菌(内含一个λ及一个λdg两种噬菌体)裂解而来的,因此λ及λdg两种噬菌体是等量的。 3. λ噬菌体能够侵染大肠杆菌并能使其裂解,因此能够形成噬菌斑;λdg噬菌体能够侵染大肠杆菌但不能使其裂解,因此不能够形成噬菌斑 4.噬菌体效价/噬菌体数/ml=每皿平均噬菌斑数*稀释倍数/0.5ml*2 (λdg不能够形成噬菌斑且其数量与λ相等,因此计算时乘以2) 5. λdg是缺陷型噬菌体,其基因组上带有宿主菌的发酵半乳糖的基因。当λdg侵染S菌的时候,就能够使得S菌具有发酵半乳糖的能力,因此菌落也会显现出发酵半乳糖的特征(菌落有金属光泽)。 6.转导子数/ml=每皿平均转导子数*稀释倍数/0.1ml*2 (因为裂解液为0.5ml,所以要乘以2);转导频率=转导子/ml./噬菌体效价*100% 实验步骤 一、噬菌体效价的测定 1)熔化100mlEMB固体培养基、100ml牛肉膏蛋白胨固体培养基 2将熔化的EMB培养基中加入6.5ml的0.1%的美蓝和2ml的2%的伊红 3)用100ml熔化的EMB培养基倒六个平板。编号EMB1-EMB6 4)用100ml熔化的牛肉膏蛋白胨固体培养基倒4个平板。编号牛固1-牛固 5)水浴加热5管素琼脂,溶解后置于50摄氏度下保温。 6)稀释裂解液:取0.5ml裂解液,加入到4.5ml牛肉膏蛋白胨液体培养基,稀释成了10^-1的稀释液,以此方法,再稀释到10^-2、10^-3、10^-4.并做好标记。

噬菌体效价实验

中国典型培养物保存中心 China Center for Type Culture Collection (CCTCC) 噬菌体效价实验 实验材料: 菌株:CCTCC AB 2013329(λ噬菌体溶原株)Escherichia coli K12 WK 6 λCCTCC AB 2013330(λ噬菌体敏感株)Escherichia coli C600 CR34 培养基:肉汤培养基;软琼脂:肉汤培养基中加入0.5%琼脂10ml/管 培养条件:NA培养基或LB培养基,37℃ 实验步骤: 7.5ml 新鲜E.coliλ菌液(CCTCC AB 2013329)离心 菌沉淀用1ml无菌水悬浮 菌悬液加在无菌平皿中央,开皿盖,在安全柜的紫外灯下照射15秒 (0.15mJ/cm2) 加入NA培养液5ml 37℃暗培养3小时 吸取以上菌液-培养液混合物,加1 - 0.5ml氯仿震荡后离心12000rpm2分钟 上清十倍稀释至10-7 选择10-5、10-6、10-7上清稀释液100ul 与100ul受体菌(CCTCC AB 2013330) 混合 37℃温浴20分钟 混合菌液加入到NA软琼脂(不烫手)中震荡混匀倒NA平板 实验结果: 稀释度为10-4的平板:布满噬斑不可数 稀释度为10-5的平板:噬斑346个 稀释度为10-6的平板:噬斑37个 稀释度为10-7的平板:噬斑4个

图1. 上一排为平板背面照片,下一排为平板正面照片。 教学建议: 噬菌体液体放置在室温下两周会导致数量下降一个数量级。 宿主菌必须是噬菌体敏感菌株CCTCC AB 2013330,教学用普通大肠菌和噬 菌体溶原菌株不能产生噬菌斑。 琼脂的浓度(1.5%-2.0%),过高或过低的琼脂含量均不能达到好的效果。 噬菌体与细胞的比例,测定噬菌体效价应采用低感染复数。 指示菌密度是在平板上获得清晰噬菌斑效果的重要因素之一,其细胞密度不 宜过高。一般控制在1ⅹ107个细胞/ml为宜。 实验教材: 沈萍,陈向东《微生物学实验》4版. 高等教育出版社.2007, 35-39. 王建波,方呈祥《遗传学实验教程》武汉大学出版社. 2004, 111-114.

实验十二 噬菌体效价的测定

实验十二噬菌体效价的测定 一、实验目的 1、学习并掌握噬菌体效价的测定原理。 2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。 二、实验原理 噬菌体属于细菌病毒,它不具备完整的细胞结构,只能通过寄主细胞完成自我复制。因此人类只有通过电子显微镜才可观察到它们的形态结构。但由于噬菌体侵染细菌细胞后,可导致寄主细胞裂解死亡,并在琼脂培养基表面形成是菌斑,所以人们可以此来判断噬菌体的存在。 当烈性噬菌体侵染敏感细菌后,会迅速引起敏感细菌裂解,释放出大量子代噬菌体,然后它们再扩散和侵染周围细胞,结果就会在菌苔上形成一个具有一定形状、大小、边缘和透明度的肉眼可见噬菌斑(plague)。 噬菌体的效价:1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。其测定常用双层琼脂平板法。由此得到的噬菌斑形态、大小较一致且清晰度高,计算准确。根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目,即可算出原液噬菌体的效价。 双层琼脂平板的配制:底层平板(1.5~2%琼脂的LB培养基10ml),将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合,保温吸附,加入45°左右的半固体琼脂糖,迅速混匀铺平板作为上层。 计算公式:噬菌体效价(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10;(这里的10为换算单位,即实验中用到100μl噬菌体原液,换算成1000μl,即1ml时,要乘以10) 三、操作步骤 流程图 流程步骤目的 1、制备9套LB 固体培养基底层平板将融化并冷却至45℃左右的LB培养基倒入 无菌培养皿,每皿约10~12ml.水平放置,凝 固后做好稀释度标记。 1、提供细菌生长营养物质 2、提供更加平整的平面 2、制备噬菌体稀释液取0.5mL噬菌体原液于4.5mL无菌水中得到 10-1稀释液。再取0.5ml10-1稀释液于4.5ml 缓冲液中得到10-2稀释液。同理再制备10-3 稀释液,并在试管上标记备用。(稀释过程应 充分混匀) 通过连续稀释使单个噬菌 体吸附一个大肠杆菌细 胞。 3、制备受体菌细胞将感受态大肠杆菌接种于50ml LB培养液,经 过夜培养,离心收集菌体细胞,悬浮于20ml 10mM MgSO4中备用。 由实验员制备。 4、吸附用取样器分别取100μl 10-1、10-2、10-3噬菌 体稀释液和100μl受体菌细胞液,充分混合 后置于37℃恒温箱保温25min.并在离心管上 做好标记。 —— 5、制备上层平板用枪分别取350μL受体菌菌悬液和噬菌体稀 释液,加入到冷却至45℃左右的0.7%琼脂糖 中,迅速混匀,倒在有相应标记的底层平板, 边倒边摇匀。 防止琼脂糖凝固结块儿。 6、培养37℃倒置培养15~18h,检查结果。——

2012浙江工商大学研究生入试微生物学真题

浙江工商大学2011年硕士研究生入学考试试 卷(B)卷 招生专业:食品科学与工程、生物化工、环境工程、工程硕士 考试科目:827微生物学总分: 150分考试时间:3小时1、 判断题(每小题1分,共15分,答案写在答题纸 上。) 1. 真菌在进行准性生殖时,通过有丝分裂进行基因。 2. 一切好氧微生物都含有超氧化物歧化酶(SOD)。 3. 低剂量照射紫外线,对微生物几乎没有影响,但以超过某一阈 值剂量的紫外线照射,则会导致微生物的基因突变。 4. 溶源性细菌在一定条件诱发下,可变为烈性噬菌体裂解寄主细胞。 5. 吸器和假根都是营专性寄生吸收营养的菌丝的特殊形态。 6. 链霉菌是霉菌,其有性繁殖形成接合孢子。 7. 共生固N菌的防氧保护靠根瘤细胞中的豆血红蛋白,而自生固N 菌的防氧保护靠菌体的呼吸保护,蓝细菌固N靠异型胞两端的特殊构造控制氧气的进入。 8. 微生物分解蛋白质,核酸和其它含氮有机物为NH3的过程称为氨化作用。 9. 地衣是藻类和真菌的共生体是微生物之间典型的互惠共生关系。 10. 大多数嗜热菌的G-C含量高于中温菌。 11. 酒精的浓度越高,杀菌能力越强。 12. 在10 分钟内杀死某微生物的最低温度称为该微生物的致死温度。 13. 一分子葡萄糖经正型乳酸发酵可产2个ATP, 经异型乳酸发酵可产1个ATP。 14. 一种细菌只能被一种噬菌体感染。 15. 与单独处理相比,诱变剂的复合处理虽然不能使微生物的总突

A. 孢囊 B. 芽孢 C. 伴孢晶体 D. 子实体 5.苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的化学成分是:( ) A. 脂多糖 B. 磷脂 C. 蛋白质 D.核糖 6. Staphylococcus aureus是下列那种微生物的学名:( ) A. 金黄色葡萄球菌 B. 黑曲霉 C. D. 酿酒酵母 7. ) A.青霉 B.曲霉 C.根霉 D.毛霉 8. 新陈代谢研究中的核心问题是( )。 A.分解代谢 B.合成代谢 C.能量代谢 D.物质代谢 9. 艾姆氏试验的原理是利用鼠伤寒沙门氏菌的( )缺陷型的回复突变。 D.his 10. 现发现一种只含不具侵染性RNA成分的分子病原体,它属于( )。 A.病毒 B.类病毒 C.拟病毒 D.朊病毒 11. 参与沼气发酵的微生物有:( ) A. 产酸细菌 B. 产甲烷细菌 C. 好氧菌 D. A. B 二者皆是 12. 人类最先发现的抗生素产生菌是:( ) A. 点青霉 B. 产黄青霉 C. 灰色链霉菌 D.降红小单孢菌 13. 细菌对抗生素的抗性决定于细菌细胞中的( ) A. F质粒 B. R质粒 C. col 因子 D. 染色体 14. 硝酸盐在反硝化细菌的作用下能被还原为:( ) A. NO2- B. NH3 C. N2 D. A,B,C 15 1克种植多年的菜园土中的微生物数量可以达到:( ) 3 B. 10 4 C. 10 5 D. 106 A. 10 16. 空气并不是微生物良好的栖息繁殖场所因为:( ) A. 缺乏营养 B. 高pH C. 夏季高温 D. 无固

噬菌体效价

噬菌体的分离纯化及效价的测定 1 目的 1.1 了解噬菌体效价的含义及其测定原理。 1.2 学会检查噬菌体的方法。 1.3 掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。 2 原理 噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒,其个体形态极其微小,用常规 微生物计数法无法测得其数量。 当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解, 释放出 大量子代噬菌体,然后它们再扩散和侵染周围细胞, 最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变 清,或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性,快速 检查、分离,并进行效价测定,对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。 检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等(至于无法采样而需检查的对象,可以用无菌 水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品)。为了易于分离可先经增殖培养,使样品中的噬菌体 数量增加。 因而不能及时判断是否有噬菌体污染。 采用生物测定法进行噬菌体检查, 约需 12h左右, 通过快速检查可大致确定是否有噬菌体污染, 以采取必要的防治措施。 根据正常发酵 (培养) 液离心后菌体沉淀,上清液蛋白含量很少,加热后仍然清亮; 而侵染有噬菌体的发酵 (培养) 液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白,加热后发生蛋白质变性,因而在 光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速,对发酵液污染噬菌体的判断亦较准 确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断,对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往 不适用。 噬菌体的效价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼 脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上,一般一个噬菌体产生一个噬菌斑,故可 根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数, 计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌 斑的形态、大小较一致,且清晰度高,故计数比较准确,因而被广泛应用。 3 材料 3.1 菌种 敏感指示菌(大肠杆菌)、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离)。 3.2 培养基 二倍肉膏蛋白胨培养液,上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基(含琼脂0.7%,试管分装, 每管5mL),下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基(含琼脂 2%),1%蛋白胨水培养基。 3.3 仪器和器具 无菌的试管、培养皿、三角瓶、移液管(1、5mL),恒温水浴锅,离心机等。 4 流程 4.1 噬菌体的分离纯化鉴定 4.2 噬菌体效价的测定 5 方法 5.1 噬菌体的检查 5.1.1 样品采集 将 2~3g 土样或 5mL 水样(如阴沟污水)放入灭菌三角瓶中,加入对数生长期的敏感 指示菌(大肠杆菌)菌液 3~5mL,再加 20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。 5.1.2 增殖培养 30℃振荡培养 12~18h, 使噬菌体增殖。

实验七 噬菌体效价的测定

实验七噬菌体效价的测定 杨明轩生物111 1102040128 一、实验目的 1、学习并掌握噬菌体效价的含义及其测定原理。 2、学习并掌握双层琼脂平板法测定噬菌体效价。 二、实验原理 噬菌体属于细菌病毒,侵染细菌细胞后,可导致寄主细胞溶解死亡,并在琼脂培养基表面形成空斑,即为噬菌斑。人们可以根据噬菌斑来判断噬菌体的存在。 噬菌体的效价指的是每毫升培养液中含有的具感染性的噬菌体的数量。其测定常用双层琼脂平板法。由此法得到的噬菌斑形态、大小较为一致,且清晰度高,计算准确。该方法首先在无菌培养皿内倒入营养琼脂作为底层,然后将适当稀释的噬菌体与培养至对数期的受体菌混合,保温吸附后,加入冷却至45℃左右的半固体琼脂糖,迅速混匀后铺平板,作为上层,最后倒置培养。只要噬菌体具有感染力就可形成噬菌斑。根据不同稀释度平板上出现的噬菌斑数目,即可算出原液噬菌体的效价。 公式为:噬菌斑形成单位(pfu/ml)=噬菌斑数×稀释倍数×10 (注:需要说明的是,“×10”表示换算单位,根据本实验步骤,因为加入的是100ul 噬菌体原液,换算成1000ul,即1ml,因此“×10”,如有变动更改则需另行计算)本实验选择的是λ噬菌体EA94,它是一种被改造过的烈性噬菌体。 三、实验材料 1、菌种:大肠杆菌(Escherichia coli)LE392; 2、噬菌体:λ噬菌体EA94; 3、培养基:300ml三角瓶中分装100ml LB培养基,15×150mm试管分装4ml 0.7%琼脂糖; 4、灭菌物品:20%麦芽糖,1mol/L MgSO4,10mmol/L MgSO4,18×180mm试管分装4.5ml 和20ml噬菌体缓冲液,100ml离心管,500μl枪头,200μl枪头,微离心管,培养皿; 5、仪器:取样器,恒温水浴锅,恒温培养箱,台式离心机。 四、实验方法 1、感受态的大肠杆菌菌悬液的制备:将活化的大肠杆菌接种于50ml牛肉膏蛋白冻培养液(内含0.5ml20% 8磅灭菌麦芽糖和500ul1mol/L灭菌MgSO4·7H20)中,经37℃过夜培养后,4000转/分,15min离心收集菌体细胞,然后悬于20ml10mmol/L MgSO4中,备用。使用前分装至灭菌离心管中,1.2ml菌液/组,保存条件为4℃冰箱保存。 2、噬菌体悬浮液的制备:4℃冰箱保存在缓冲液中的噬菌体0.6ml与活化的处于感受态的E. coli菌体0.6ml混匀,在37 ℃条件下保温25min,使噬菌体吸附到E. coli上。取10块LB平板,每板加入0.1ml混合液并涂抹均匀。在37℃下培养10h。每个平板加入10ml噬菌体缓冲液,将菌及噬菌体洗下。离心后取上清液。进行效价测定预实验。达到所需要求后加1-2滴氯仿,分装为550ul/每组,并置于4℃保藏。 3、制备底层平板:将在50℃左右的LB固体培养基倒入无菌培养皿,每皿约10~12ml,共9皿(每个稀释度做3个重复)。水平放置,凝固后,做好稀释度标记备用。(作用:1、

厦门大学 微生物 考研真题(02-07)

厦门大学微生物历年考研真题02-07 厦门大学2002年微生物考研试题 一、填空题:(第8题 3分,其余1分/题) 1.用____和____糖等成分可以制成培养真菌的半组合培养基。 2.细菌产生抗药性的3种途径分别为:染色体组上发生基因突变、____的转移和____的适应性。 3.病毒的核酸类型是及其多样的,总的来说,动物病毒以____和____居多,植物病毒以____居多,而噬菌体以____居多。 4.在实验中培养化能异养型细菌时,通常以____为碳源,____为氮源,____为生长因子,以____提供矿质元素。 5.F因子是大肠杆菌等细菌中决定____的质粒,其大小为____kb,约等于____%染色体DNA,其中1/3基因(tra区)与____有关。 6.病毒大小的单位是____,多数病毒粒子的直径在____上下。 7.电子显微镜观察表明:放线菌无性孢子的形成,只有____方式,而无____方式。 8.放线菌的形态特征,以链霉菌最典型:细胞形态呈____,营养生长期菌丝内____隔,一般呈____细胞,细胞内具有为数众多的____体:根据菌丝的结构和功能把菌丝分为____、____和____3类。其中____能分化产生成串的分生孢子。 二、名次解释:(2分/题) 1.光能自养型(photoautotroph) 2.微体(microbody) 3.连续培养(continuous cultivation) 4.感受态因子(competence factor) 5.共同抗原(common antigen) 6.单细胞蛋白(single cell protein) 7.紫膜(purple menbrane) 8.活性污泥(activated sludge) 9.类毒素(toxoid) 10.Park 核苷酸( park nucleotide ) 11.膜边体( lomasome) 12.细菌沥滤(bacterial leaching) 三、问答题(没标注的3分/题,) 1.龋齿的形成与某些产荚膜细菌有关吗?解释你的答案。 2.为什么说病毒是一类非细胞结构的大分子生物?

厦门大学2004年微生物

04厦大微生物 1.前噬菌体 2.S tickland 3,古生菌4.微体5.磷壁酸6.基因位移7大肠杆菌8紫膜9.cfu 10.连续培养11兼性好氧菌12.MIC 1 3.子实体1 4.抗生素15附加体16.艾姆氏试验17.转导子18.ATCC 19.BOD 20.暗修复 二实验题(40) 1. 如何鉴别一固体平板上生长的灰白色圆形菌落是细菌还是酵母菌?(3分) 2. 试述淋巴细胞杂交瘤技术的主要原理与制备方法.(5分) 3. 在没有加压蒸汽灭菌设备的情况下如何有效杀灭细菌芽孢?为什么?(4分) 4. 试述利用双层平板法测定噬菌体效价的主要步骤及其优点.(5分) 5. 简述双向免疫扩散法的主要实验步骤,并对可能出现的沉淀线形状进行解释。(5分) 6. 由于实验需要,欲诱变获得一株大肠杆菌组氨酸营养缺陷型(His-)的菌株,请设计出基本的试验方案.(7分) 7. 简述高压蒸气灭菌锅的工作原理、使用操作步骤及注意事项.(6分) 8. 欲从土壤中筛选一株抗大肠杆菌的芽孢杆菌菌株,请拟出试验方案.(5) 三.问答题(70分) 1.比较革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁成分及结构的异同点.(4分) 2.真菌有哪几种有性孢子,各举一种真菌代表加以说明.(4分) 3.亚病毒主要有几种类型,简述各类型的主要特点.(5分) 4.EMB培养基的哪些成分在鉴别大肠杆菌中起主要作用?请加以说明(4分) 5.试比较细菌酒精发酵和酵母酒精发酵的异同点.(5分) 6.硝化细菌有哪几类?为什么硝化产能较少?(4分) 7.微生物主要有哪几种次生代谢途径,简述之.(5分) 8.简述厌氧袋的工作原理.(5分) 9. 转化和转染的主要区别是什么?(4分) 10. 普遍转导与局限转导有何不同?(4分) 11. 活性污泥法处理污水是利用了微生物的哪些特性?(5分) 12. 巨噬细胞在免疫反应中起哪些作用?(5分) 13. 抗体有哪些特点?简述其形成过程.(7分) 14. 再次免疫应答有哪些特点>简述其形成过程.(7分) 15. Ainsworth系统(1983年)把真菌分成哪些门,依据是什么?(5分)

细菌噬菌体应该如何检测

细菌噬菌体应该如何检测 噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒,其个体形态极其微小,用常规微生物计数法无法测得其数量。当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解,释放出大量子代噬菌体,然后它们再扩散和侵染周围细胞,最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变清,或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。了解噬菌体的特性,快速检查、分离,并进行效价测定,对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。 检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等(至于无法采样而需检查的对象,可以用无菌水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品)。为了易于分离可先经增殖培养,使样品中的噬菌体数量增加。 采用微生物测定法进行噬菌体检测,约需12h左右,因而不能及时判断是否有噬菌体污染。通过快速检测可大致确定是否有噬菌体污染,以采取必要的防治措施。根据正常发酵(培养)液离心后菌体沉淀,上清液蛋白含量很少,加热后仍然清亮;而侵染有噬菌体的发酵(培养)液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白,加热后发生蛋白质变性,因而在光线照射下出现丁达尔效应而不清亮。此法简单、快速,对发酵液污染噬菌体的判断亦较准确。但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断,对侵染噬菌体较少的一级种子培养液也往往不适用。 噬菌体的效价即1mL样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼脂平板法。由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上,一般一个噬菌体产生一个噬菌斑,故可根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数,计算出噬菌体的效价。此法所形成的噬菌斑的形态、大小较一致,且清晰度高,故计数比较准确,因而被广泛应用。 检测材料 1.菌种 敏感指示菌(大肠杆菌)、大肠杆菌噬菌体(从阴沟或粪池污水中分离) 2.培养基 两倍肉膏蛋白胨培养液,上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基(含琼脂0.7%,试管分装,每管mL),下层肉膏蛋白胨固体琼脂培养基(含琼脂2%),1%蛋白胨水培养基。 3.仪器耗材

3温和噬菌体诱导和噬菌斑观察

温和噬菌体诱导和噬菌斑观察 一、教学目标及基本要求: 1. 了解温和噬菌体的性质,学习溶源菌的检查方法。 2. 掌握噬菌体效价测定方法 3. 了解噬菌斑的形成过程。 二、实验原理 温和噬菌体侵染宿主细胞后将其基因组整合到宿主细胞的染色体组中,使宿主细菌成为溶源性细菌。溶源性细菌一般在生长繁殖过程中可自发的发生极低频率的裂解,释放出具有感染力的噬菌体。可以用物理或化学的方法诱导,使其大部分或全部裂解。检测时需要有对此温和噬菌体敏感的宿主细胞,即溶源性细菌释放的噬菌体对于该细胞而言是烈性噬菌体,该细胞被称为敏感株。敏感株可以从待检的溶源株相近的种或变种中找到。 实验中选用携带λ/dλ噬菌体的大肠杆菌,称为双重溶源性菌株。该菌株同时被λ完整噬菌体和λ缺陷噬菌体(dλ)侵染。该菌株一般用于高频转导,两种噬菌体中只有完整的λ噬菌体才能在侵染敏感株后于固体平板上形成噬菌斑。每毫升噬菌体裂解液中所含的噬菌体数量被称为噬菌体效价,一般以每毫升噬菌体裂解液在含有敏感菌的固体平板上形成的噬菌斑的数量来表示。裂解量则是表示一个细胞被裂解后所释放出的噬菌体数量,可以根据每毫升裂解的溶源性菌株数量和效价进行计算。 三、实验材料 1. 菌种:带有噬菌体λ和缺陷噬菌体(λdgal+)的双重溶源菌(E.coli K12F2gal-/λdgal+/λ) 敏感菌大肠杆菌(E.coli K12Sgal-) 2. 培养基:肉汤固体培养基,肉汤液体培养基,肉汤半固体培养基(0.6%琼脂),加倍肉汤培养基(成分与肉汤培养基相同,但浓度加倍)(见附录II-1.1)。 3. 含镁磷酸缓冲液:磷酸二氢钾2g,磷酸氢二钾0.7g,硫酸镁0.025g,蒸馏水1000ml。 4. 生理盐水,氯仿。 5. 其它:培养皿(Φ7.5cm),磁棒,磁力搅拌器,紫外照射箱,无菌移管,水浴锅等。 四、实验内容 1. 噬菌体的诱导和裂解液的制备 (1)菌体培养 1) 从供体菌E.coli K12F2gal-/λdgal+/λ菌株斜面挑取1环接种于3ml肉汤培养基中,37℃振荡培养18h。 2) 取1ml培养液接种于装有9ml肉汤液的150ml三角瓶中,37℃振荡培养4~6h。 (2)噬菌体的诱导和裂解液的制备 1) 取10ml培养液,离心(3500r/min,15min)收集菌体。菌体用10ml加镁磷酸缓冲液离心洗涤1~2次,最后将菌体悬浮于3.1ml加镁磷酸缓冲液中,制成细胞悬浮液。取0.1ml 菌悬液用生理盐水稀释,参照细菌菌落总数测定方法检测菌悬液中的溶源菌数量(N1)。 2) 将其余3ml菌悬浮液放入φ75mm培养皿中,在诱变箱内以紫外线照射10s,然后加入3ml加倍肉汤培养液, 于37℃避光培养2~3h。

细菌转导大学生物学

实验五细菌转导 一实验目的 通过大肠杆菌噬菌体专一性转导半乳糖发酵基因学习掌握局限性转导的原理,掌握转导实验的基本方法。 二实验原理 转导(transduction)是由噬菌体将一个细胞的基因传递给另一细胞的过程。在这一过程中,细菌的一段染色体被错误地包装在噬菌体的蛋白质外壳内,并通过感染而转移到另一个受体细菌内。它是细菌之间传递遗传物质的方式之一。 转导可以分为普遍性转导和局限性转导。普遍性转导指噬菌体能转导供体细菌的任何基因,局限性转导指噬菌体只能转导供体菌染色体DNA上的某些特定基因。 转导实验中常用的是λ噬菌体,本实验中选用了溶源性的E.coli K12(λ)gal+为供体菌。在此供体菌中λ噬菌体与gal基因紧密连锁,当此供体菌受紫外线照射后产生裂解反应,噬菌体被诱发释放,以一定的比例形成带有gal基因的转导噬菌体。当这种转导噬菌体与受体菌E.coli K12S gal-混合接触时,带有供体菌gal基因的转导噬菌体能以一定的频率整合到受体菌的染色体DNA,使不能利用半乳糖的gal-受体菌转变成了能利用半乳糖的gal+细菌。gal+细菌在以半乳糖为唯一的碳源、并含有伊红美蓝的培养基上,可发酵半乳糖产酸从而形成有金属光泽、黑褐色的菌落。流程示意图如下:

E.coli k12(λ)gal+(供体) UV 照射 (λ)gal+噬菌体 感染 E.coli k12S gal-(受体) E.coli k12S gal-/(λ)gal+(转导子) 三实验材料 1、菌株 E.coli k12(λ)gal+ E.coli k12S gal- 2、用具 Eppondoff离心管(1.5ml/4.5ml)、离心机、培养皿等 3、培养基、缓冲液 a、肉汤培养基:牛肉膏5g,蛋白胨10g,NaCl 5g,去离子水定容至1L,pH 7.0-7.2,固体培养基加琼脂2%,半固体培养基加琼脂0.7-1%。 b、加倍肉汤培养基:加倍浓度的肉汤培养基 c、半乳糖伊红美蓝(EMB)培养基:伊红0.4g,美蓝0.06g,半乳糖10g,蛋白胨10g,K2HPO42g,琼脂20g,去离子水定容至1L,pH 7.0-7.2。

噬菌体的分离与纯化(整理优化版)

噬菌体的分离与纯化 实验用具及材料 1.菌种:大肠杆菌 2.试剂:氯仿 3.培养基: 1)液体牛肉膏培养基:胰蛋白胨2g,牛肉膏0.6 g,NaCl 1g,加H2O至200mL,pH7.4,121 ℃20min高压灭菌; 2)3×牛肉膏培养液:胰蛋白陈3g,牛肉膏0.9g,NaCl 1.5g,加H2O至100mL,pH7.4,121 ℃20min高压灭菌; 3)固体牛肉膏培养基:每100mL液体牛肉膏培养基加入 1.5g琼脂粉,121 ℃20min高压灭菌; 4)半固体牛肉膏培养基:每100mL液体牛肉膏培养基加入 0.7g琼脂粉,121℃20min高压灭菌 4.仪器及其他用品:灭菌试管、灭菌吸管、玻璃涂布器、无菌 细菌过滤器(孔径0.22um),培养皿,蓝盖试剂瓶,恒温水 浴锅,离心机等 实验步骤 1.噬菌体的分离 (1)制备菌悬液:用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔 接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液1)的试管中,混合均匀后 置37℃培养过夜。/取大肠杆菌斜面一支,加4ml 无菌水洗 下菌苔,制成菌悬液。

(2)增殖培养:在盛有10mL 3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基2) 大的试剂瓶中加入噬菌体原液20mL和大肠杆菌悬液0.3mL,混合后置37℃振荡培养12~24h。 (3)制备裂解液:将上述混合培养物分别倒入五支10mL无菌 离心管中,经4000r/min离心15min;将上清液小心的转入 另一无菌离心管中。 (4)确证试验所得裂解液经37℃培养过夜,经无菌检查没 有细菌生长的滤液作进一步证明噬菌体的存在;还可加入几 滴氯仿,稍作混合,备用。 (5)噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL(1 滴)大肠杆菌菌液,用灭菌玻璃涂布器将菌液均匀地涂布在 培养基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其 上,置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的 透明或浑浊噬菌斑,便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体。 2.噬菌体的纯化 (1)取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中,再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌悬液,混合均匀; (2)取上层琼脂培养基溶化并冷却至45℃(可预先溶化后置45~55℃水浴锅内保温备用),加入0.2mL上述噬菌体与细 菌的混合物,混匀后快速倒入底层培养基上,铺匀,置37℃培养12~24h; (3)取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征(如噬菌斑形状、大小、清亮程度等)。此过程制备的裂解液中往 往有多种噬菌体,需进一步纯化; (4)纯化时,通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下,蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中,置37℃振荡

(完整版)厦门大学遗传与分子生物学实验课程试卷

厦门大学《遗传与分子生物学实验》课程试卷 生命科学学院生物学系2002年级各专业 主考教师:章军试卷类型:(A卷/B卷) 一、填空题(每题2分,共50分) 1.果蝇具有丰富的外表型态差异,包括______、_____、_____,_______与______。 2.FISH技术的全称是____________________________。 3.细菌转导实验中所用的菌株分别是:____________和_____________ ,用的培养基是 __________培养基。 4.转座子引起的插入突变实验中所用的菌株分别是:_________ 和_________。 5.在提基因组DNA时,为保证DNA的完整性应该采取的步骤 有,,。 6.DNA凝胶电泳可以以和为凝胶介质,当DNA为> bp时, 用作为介质,当DNA为< bp时,用作为介质。 7.抽提DNA纯化时,一般采用抽提,采用体积;沉淀DNA用, 体积;洗涤沉淀时用。 8.DNA纯度一般用比值来衡量,当比值在表示DNA很纯,当表示 不干净,当表示含过多。 9.衡量DNA得率或浓度时应该用值来进行计算,公式表示为。 10.进行电泳加样时,要将DNA样品与混合,其主要成分为,如要加样 10μlDNA要加μl混合。 11.在提取DNA时,酚∕氯仿的作用是,其比例应为,可选择使用酚︰ 氯仿︰异戊醇,酚的饱和是用,在使用酚时应注意,一般用的酚需要酚,要用瓶子来装。 12.酚是蛋白变性剂,用酚抽提细胞 DNA时,具有两方面的作用:(1) (2) 。 13.提质粒DNA时,加入STE的作用是;加入溶液Ⅰ的作用是,现 象;加入溶液Ⅱ作用,现象,成分主要为,提供环境;加入溶液Ⅲ作用是,现象,成分主要是,目的是。 14.质粒DNA有以下状态、、、,进行电泳时 跑的最快在最前面,其次为、,最后为。 15.实验过程中常用的枪头有以下几种:μl用色枪头,μl用 色枪头,μl用__色枪头。 16.转化时用的感受态细菌需要用处理,转化细菌时需要进行,时间为 秒,目的是。 17.胶回收DNA时需注意,,应尽量将足够小彻底,

噬菌体

第七节噬菌体phage 非细胞生物 真病毒euvirus:至少含有核酸和蛋白质两种组分 亚病毒subvirus 类病毒viroid:只含具单独侵染性的RNA组分 拟病毒virusoid:只含不具单独侵染性的RNA组分 朊病毒prion:只含蛋白质一种组分 真病毒的定义 一类超显微的非细胞生物,每种病毒只含有一种核酸;它们只能在活细胞内营专性寄生,靠寄主代谢系统的协助来复制核酸、合成蛋白质等组分,然后进行装配而得以增殖;在离体条件下,它们能以无生命的化学大分子状态长期存在并保持其侵染活性。 病毒的分类 依据宿主范围——植物病毒、动物病毒、微生物病毒 噬菌体是感染细菌和放线菌的病毒。 病毒的化学组成与构造 化学组成——核酸( DNA 或RNA)、蛋白质 构造 基本构造——核衣壳:核酸、衣壳 非基本构造——包膜、刺突 第六节噬菌体Bacteriophage, phage噬菌体是一类感染细菌或放线菌的病毒。 一、噬菌体的特点1、无细胞结构,仅含一种核酸;2、不能进行独立的代谢作用;3、严格的活细胞寄生;4、个体极小,能通过细菌滤器 二、噬菌体的形态与构造 1、形态噬菌体的基本形态有蝌蚪形、微球形和丝状三种。 噬菌体的类型 2、构造 E. coli T4构造:头部(正二十面体);颈环;尾鞘、尾髓;基片、刺突、尾丝

3、大小 T4:头部65 ×95nm,尾部20 ×95nm f2:f20~25nm 4、化学组成:蛋白质;核酸:dsDNA, dsRNA, ssDNA, ssRNA 三、噬菌体的生长和繁殖 1、吸附adsorption 噬菌体的吸附器官与受体细胞的特殊位点的接触与结合 吸附的专一性: 寄主专一性;位点专一性:T3、T4、T7----脂多糖;T2、T6----脂蛋白;雄性专一噬菌体----性纤毛。 过程:尾丝散开,刺突固着于特异性位点 T4吸附 对于T类噬菌体的吸附器官是尾丝和刺突,尾丝首先触及寄主细胞表面,然后刺突固定。 2、侵入penetration ——噬菌体核酸物质进入受体细胞 ?T4:尾部的酶水解细菌细胞壁肽聚糖层产生一小孔,尾鞘收缩,尾髓伸入细胞中,头部的核酸被压进细菌细胞,蛋白质外壳留在细胞外。 ?M13, f1, fd:其DNA自性纤毛中空管侵入寄主细胞。 3、增殖replication——噬菌体核酸物质及蛋白质在寄主细胞内的合成 早期及次早期的转录与转译作用 细菌DNA被DNase破坏 噬菌体核酸的复制 后期的转录与转译作用 T4 DNA复制的特点:一是由于T4DNA中的胞嘧啶被羟甲基 胞嘧啶取代,所以在其DNA复制之前,必须由噬菌体编码的酶合成羟甲基胞嘧啶,并且在T4DNA合成后,羟甲基胞嘧啶被葡萄糖基化,以保护T4DNA免遭E.coli核酸酶破坏。 二是在T4DNA复制过程中,由6—8个拷贝结合形成非常长的DNA链。(多连体) 4.成熟maturity/(装配)(assembly 在增殖期合成的噬菌体的核酸和蛋白质按一定的顺序装配成噬菌体颗粒 5.释放release:子代噬菌体脱离寄主细胞而得以释放 四、噬菌体一步生长曲线 One Step Growth Curve ?潜伏期latent phase

2012年攻读硕士学位研究生微生物学入学考试试题.

天津科技大学 二〇一二年攻读硕士学位研究生入学考试试题 考试科目804 微生物学(试题附在考卷内交回) (请将答案全部写在答题纸上,写在试卷上无效,不必抄题,但必须写清题号) 一、名词解释(每小题2分,10个小题,共计20分) 1.选择培养基 2.PHB 3.石炭酸系数 4.有氧呼吸 5.Hfr菌株 6.异形胞 7.干扰素8.菌落9.噬菌体效价 10.普遍转导 二、填空(每空1分,50个空,共计50分) 1.用溶菌酶处理可将革兰氏阳性菌的细胞壁全部去掉,剩下的部分称作(1) ,用同样的方法处理革兰氏阴性菌的细胞壁,剩下的部分称作(2) 。 2.革兰氏阴性致病菌可借助(3) 使自已牢固粘附在宿主的呼吸道、消化道等粘膜上。 3.放线菌中的(4) 属是产生抗生素种类最多的属,拉丁名为(5) ,其菌体由(6) 、(7) 和孢子丝构成,且孢子丝的形状可作为分类鉴定的依据。 4.通常情况下,根霉菌的无性孢子是(8) ,成簇的无性孢子梗由特化了的菌丝—— (9) 处生出;曲霉的无性孢子是(10) ,无性孢子梗从特化了的菌丝细胞——(11) 生出。 5.酵母的繁殖方式分为有性和无性两类,无性繁殖又可分为(12) 、(13) 和产无性孢子三种形式,有性繁殖时形成子囊孢子。 6.原核微生物基因重组的方式主要包括转化、转导、(14) 和(15) ,其中转化所需的受休菌细胞必须为(16) 细胞,而转导的发生需要(17) 作为媒介。 7.微生物需要载体蛋白参与吸收和运输营养物质的方式有(18) 、(19) 和(20) 三种。 8. DNA序列通过非同源重组的方式,从染色体某部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象,称为(21) 。凡具有这种作用的段DNA序列,称为(22) 。 9.质粒是独立于染色体外,能进行自我复制的遗传因子,实验中可采用(23) 的方法进行分离提取,并常利用(24) 电泳进行分析和鉴定。 10.基因突变的不对应性和自发性是通过(25) 、(26) 和(27) 三个经典实验证明的。 11.微生物生长不可缺少的微量有机物质称为(28) ,可将其分为(29) 、(30) 及嘌呤、嘧啶等。 12.微生物生长的测定方法主要有计数法、(31) 和(32) 等,计数法又可分为直接计数和(33) 计数,其中酵母菌和霉菌的孢子可利用(34) 在显微镜下直接进行计数,个体较小的细菌常采用(35) 计数的方法计数,用cfu来表示菌体的数量,细菌还可利用测培养液的(36) 来绘制单细胞的生长曲线;而呈丝状生长的放线菌和霉菌常通过(37) 法来绘制生长曲线。

厦门大学微生物专业考研真题01、02、03试题.doc

06年我报了厦门大学,资料差不多都是从网上免费获得,谢谢无偿提供资料的朋友们,祝你们新年快乐!现在我也把我得到的资料传上来,方便大家! 2004.微生物 %1.名词解释(木大题共20题,每题2分,总共40分) ⑴前噬菌体(2)Stickland反应(3)古生菌(4)微体(5)磷壁酸(6)基团移位(7)大肠n(8)紫膜(9)cfu (10)连续培养(11)兼性好氧菌(12)MIC (13)了实体 (14)抗生素(15)附加体(16)艾姆氏实验(17)转导了(18)ATCC(19)BOD(20)暗修复 %1.实验题(木大题共8题,总共40分) 1.如何鉴别一固体平板上生长的灰白色圆形菌落是细菌还是酵母菌?(3分) 2.试述淋巳细胞杂交瘤的主要原理与制备方法.(5分) 3.在没有加压蒸气灭菌设备的情况下如何有效杀灭细菌芽饱?为什么?(4分) 4.试述用双层平板法测定噬菌体效价的主要步骤及其优点.(5分) 5.试述双向免疫扩散法的主要实验步骤,并对可能出现的沉淀线性状进行解释.(5分) 6.由于实验需要,欲诱变获得一株大肠杆菌氛基酸营养缺陷型(His)的噬菌体,请设计出基木的实验方案.(7分) 7.简述高压蒸气灭菌锅的工作原理,使用操作步骤及注意事项.(6分) 8.欲从土壤中筛选一株抗大肠杆菌高活性的芽泡杆菌菌株,请拟用实验方案.(5分) %1.问答题(本大题共15题,总共70分) 1.比较革兰氏阳性菌和阴性菌细胞壁成分及结构的异同点.(4分) 2.真菌有哪几神有性抱了,各举一种真菌代表加以说明.(4分) 3.亚病毒主要有几种类型,简述各种类型的主要特点.(5分) 4.EMB培养基的哪些成分在鉴别大肠杆菌中起主要作用?请加以说明.(4分) 5.试比较细菌.酒精发酵和酵母菌酒精发酵的异同点.(5分) 6.硝化细菌有哪几类?为什么硝化作用产能较少?(4分) 7.微生物主要有哪几条次生代谢途径,简述之.(5分) 8.简述厌氧袋的工作原理.(5分) 9.转化和转染的主要区别是什么?(4分) 10.普遍转导和局限转导有何不同?(4分) 11.活性污泥法处理污水是利用了微生物的哪些特性?(5分) 12.巨噬细胞在免疫反应中起哪些作用?(5分) 13.抗体有哪些特点?简述其形成过程.(7分) 14.再次免疫应答有哪些特点,其原因是什么?(4分) 15.Ainsworth系统(1983年)把真菌分成哪些门?依据是什么?(5分) 2003.微生物 %1.名词解释(木大题共13小题,总共61分)

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