第22二章 淋巴细胞转化试验技术
第二十二章淋巴细胞转化试验技术
(Lymphocyte transformation test technique)
一、基本原理
当机体受到抗原（包括特异性的如结核菌素或非特异性的如植物学凝素，PHA 等）的刺激时，T淋巴细胞就可以转化为淋巴母细胞，进一步转化为致敏淋巴细胞。这种转化在一定的程度上代表着机体的细胞免疫功能状态。这种转化也可在体外的
T细胞的培养过程中加入适当的刺激原而出现，并表现出形态上的变化。目前常采
用PHA诱发的淋巴细胞转化试验作为检查机体细胞免疫的功能状态。具体方法主
要有两种：一是形态学检查法，即在加有PHA的培养基中，培养淋巴细胞后涂片、染色、镜检以观察形态学变化，计算淋巴细胞的转化率；另一种是同位素标记物掺
入转化法，即当淋巴细胞受分裂原刺激发生转化时，必然伴有DNA的大量合成，
此时若将具有放射性的3H-TdR(胸腺嘧啶核苷)加到培养液内，则被DNA的原料摄
入转化中的细胞内，测定细胞内放射性物质的相对数量（以脉冲数表示），就能客
观地测定淋巴细胞的转化程度。后者方法更为准确，且重复性好。
二、形态学检查法
（一）材料与试剂
1．小牛血清取新生的小牛，无菌采血，分离血清。于56℃灭活后分装小瓶，放入低温冰箱保存。
2．双抗配成每毫升含青霉素1.00×104U，链霉素1.00×104U的混合液。存
放于-20℃。
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3．6%NaHCO3水溶液
4．肝素以灭菌生理盐水配成500U/ml，115℃灭菌30min，4℃保存备用。
5．PHA 以灭菌生理盐水配成1 000μg/ml，经G-5漏斗过滤，分装小瓶，保
存于-20℃备用。
6．姬姆萨染液、瑞氏染液。
7．pH6.4磷酸盐缓冲液：
KH2PO4 6.62g
Na2HPO4 2.56g
H2O 1 000.00ml
8．营养液采用199营养液或RPMI－1640营养液，配法如下：
199营养液79.00ml
小牛血清20.00ml
“双抗” 1.00ml
依次加入后，再用高压灭菌的6% NaHCO3液调pH至7.2～7.3，分装小瓶，每
瓶0.2ml。
（二）操作方法
1．于培养瓶内加0.2ml马血，对照组与试验组各做2瓶，试验组均加PHA
30μg；
2．37℃培养72h，每天轻摇1~2次；
3．取出培养瓶，摇散血块，倒入离心管，3 000r/min离心10min，去上清液；
4．用血球泥制备推片，晾干；
5．以瑞氏染液染2min~3min，加等量缓冲液，混匀继续染3min，蒸馏水冲洗
后再用姬姆萨染液染2min~3min。加等量缓冲染液感作7min~8min，馏水冲洗，晾干；
6．镜检，观察，计数。
（三）结果判定
在油镜下，观察淋巴细胞的形态变化（见表21-1），以头、体、尾三部分计算，至少计数100个或200个淋巴细胞，然后按公式计算出淋巴细胞形态转化率。
成年马的淋巴细胞转化率，根据原兽医大学20例检查，平均为35.58%。
不加PHA的对照组一般不转化或转化率只在1%左右。
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表21-1 淋巴细胞转化前后形态学特点
项目未转化型转化型过渡型
大小（μm）核与胞浆比例核位置核仁染色体核周围透明区胞浆内空泡
胞浆呈碱性
7~10
大
几乎占全部胞浆
少或无
致密
不明显
不明显
不明显
20~35
小
中央或稍偏
一个或数个
疏松有分裂相
明显
明显
明显
12~16
稍大
偏一侧
有或无
疏松
有
有或无
有
转化淋巴细胞的形态特征：①体积增大，约大于原成熟的淋巴细胞的2~3倍；
②细胞核膜清晰,核内染色质疏松呈网状结构，可见1~3个核仁,有的核呈分裂相；
③胞浆丰富，有嗜碱性染色，核周围的胞浆有一些淡染的透明带，细胞呈伪足状突起。
（四）注意事项
1．培养液最适pH为7.2~7.4，过酸过碱都会影响细胞的生长而降低转化率。
培养液的类型与动物的白细胞有关，如小鼠的淋转试验，用RPMI-1640最好，用199液则不成功。
2．培养时间以72h~120h转化率最高，超过这个时间，则转化率反而下降。
3．吞噬细胞有时在形态上易与“过渡型”混淆。但巨噬细胞有其固有的特点，核占细胞比较小且偏一边，核染色质浓集，细胞浆呈蓝灰色或红褐色，胞浆内有大
小不等的颗粒或吞噬物，且含有大小不等的气泡。
4．涂片要少蘸些细胞，推出尾部来，因淋巴细胞较大，易集中在尾部及边缘。
5．观察淋巴细胞转化，染色不要太浓，以便观察核仁。
6．严格的无菌操作，是淋巴细胞转化试验成功的关键。
三、H-胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）掺入法
（一）材料及试剂
1．培养基RPMI-1640或TC199培养液
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2．PHA 同形态学方法
3．小牛血清
4．3H-TdR 选用比活性为2Mci~10Mci/mg分子的制品，将1 Mci/ml溶液以
生理盐水稀释成100μci/ml，于4℃保存备用。临用时再用培养液稀释成10μci/ml
溶液。
5．3%冰醋酸
6．浓甲醛
7．30%H2O2液
8．闪烁液
PPO（2，5二苯基噁唑） 5.00g
POPOP[1,4-双(5-苯基噁唑基-2苯)] 0.30g
无水乙醇200.00ml
甲苯800.00ml
混合即可
（二）操作方法
1．培养液中按1%的体积加双抗（含青霉素1万U/ml，链霉素0.01g/ml）及
肝素液（含肝素100U/ml）。用3.5%NaHCO3液调pH值为7.2~7.4，然后加灭活的
小牛血清，使浓度为20%。再加PHA（50U~75U/ml），无菌分装于培养瓶内，每
瓶1ml。
2．无菌操作采血，并以肝素抗凝，同时进行白细胞计数及分类计数。
3．取0.1ml抗凝血，加入到含1ml培养液的培养瓶中，每个血样接2~3个培
养瓶。如果以血浆或分离的淋巴细胞代替全血，加入培养瓶中更好。
4．37℃培养72h，在培养结束前16h～24h，每瓶加入3H-TdR 1μci。
5．培养结束后，将培养物移到离心管内，用3%冰醋酸6ml，分两次冲洗培养瓶，并将冲洗液也装入离心瓶中，2 000r/min离心10min，去上清。沉淀再用3%
冰醋酸洗涤一次，同样离心去上清。
6．在沉淀中加30%H2O2液一滴，85℃水浴15min，待溶液呈无色时，再加甲
酸0.5ml，继续加热（85℃）30min，使沉淀物完全消化溶解。
7．将消化溶解的液体移入测样杯内，用红外灯或80℃热空气烘烤至液体体积
少于0.1ml，加闪烁液5ml，用液体闪烁液计数器测其脉冲数。
8．第5~7步骤制备闪烁液样品也可以采用滤膜法制备。即：培养结束后，将
培养液移入离心管，2 000r/min离心10min，弃上清，沉淀用生理盐水洗涤一次、
再离心。将沉淀移至滤膜上（注意将沉淀全部移入），减压抽滤，并依次以10ml
生理盐水、5ml 5%三氯醋酸（若有带色物质，用30%H2O2液脱色）和3ml无水乙
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醇抽滤。取出滤膜，60℃~80℃烘干，然后将滤膜放入装有5ml的闪烁液中（贴细
胞的面朝上），用液体闪烁液计数器检测。
（三）结果判定
以液体闪烁计数器测定每分的脉冲数cpm。取各管测定读数的平均值，即为0.1ml血样的脉冲数。全血检测的脉冲数，再按血样淋巴细胞计数结果，校正成每
百万淋巴细胞的脉冲数（cpm/106淋巴细胞）。也可以刺激指数（SI）表示试验结果。为此须在培养时，设同样数量的不加PHA的对照培养瓶，试验管脉冲数与对照管
脉冲数之比，即为刺激指数。
（四）注意事项
1．血样与培养基比例一般在1:10~1:30为宜。
2．培养细胞时，可放入CO2培养箱中培养，也可在普通温箱进行培养，但一
定要把盖子拧紧，否则结果差别较大。
3．以SI表示结果时，一定要设置相同数量培养管的对照（即不加PHA）。而
以cpm绝对值表示（cpm/106淋巴细胞）则可以不用设对照管。因为对照的cpm与
本底比较接近，不同样品之间的少许差别也不易确定其意义。
4．闪烁液的容水量很低，所以在加入闪烁液之前必须烘干。但加入一定量的
醇类（如无水乙醇），则可容纳少量的处理后所残留的水分，但也仍需烘至接近干
燥的程度，否则将发生浑浊而无法测定。据报道，如果闪烁液中加入1/3的异辛基
苯氧聚乙氧乙醇（TritonX-100），其容水量可达15%，消化溶解后的样品，不必烘干，即可添加闪烁液测定。
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MTT方法测定脾淋巴细胞转化(20070727)
MTT方法测定脾淋巴细胞转化实验 1.实验步骤： 1.1.调整淋巴细胞浓度： a)小鼠断颈椎处死后，放入75%酒精液浸泡5min； b)用无菌镊子取出小鼠，手术剪剪开腹腔，取脾脏，以1ml无菌注射器将 脾在研钵中磨碎，用3.5ml预冷的Hank’s液悬浮，过筛入无菌平皿，研 钵中再次加入3.5ml Hank’s液，过筛入平皿，将7ml细胞悬液移入塑料 离心管； c)离心1500rpm, 5min； d)用Hank’s液洗2次； e)以2ml完全培养液悬浮细胞，转0.1ml细胞入3.9ml 1.5%冰醋酸，混匀 后计数；其余细胞均放于4℃冰箱预冷，防止细胞死亡； f)根据细胞计数，调整细胞浓度到1*107/ml。（假定4个大方格内总数为N，则 该细胞悬液的浓度为n=105*N） 1.2.刺激物的配备用细胞培养液将各种培养刺激物按2*终浓度稀释，混匀。以 100μl/孔加入96孔细胞培养板中。（PHA和ConA主要刺激T淋巴细胞增殖，LPS主要刺激B细胞增殖。）ConA 的常用浓度为0.1-15μg/ml，LPS的常用浓度为0.1-10μg/ml , 具体情况要根据细胞浓度和反应时间而定。不同品种的动物也有一定的不同。 1.3.加样在以上各孔中加入工作浓度的淋巴细胞悬液100μl/孔（边加边摇匀，防 止滴加过程中淋巴细胞发生沉淀。细胞培养板具体设计根据具体试验而定，设培养液对照孔。 1.4.培养将96孔细胞培养板放入细胞培养箱，培养72小时。每过24小时需取 出细胞培养板，在倒置显微镜中查看培养孔中是否出现细菌污染。 1.5.MTT培养结束前4小时，以50ul/孔添加MTT稀释液，继续培养至72小时。 1.6.处理停止细胞培养，离心（1500rpm，10min）使淋巴细胞沉淀，轻轻倾去 细胞培养液，纸巾吸干。加入DMSO，150ul/孔。充分振荡后，避光放置10-15min（直至蓝色颗粒充分溶解） 1.7.检测充分振荡后，570nm单波长酶标仪检测。
淋巴细胞转化试验(MTT)
一、淋巴细胞转化试验（MTT） （一）原理： 四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。 （二）材料： MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原 （三）方法： 1、脾细胞制备： （1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上； （2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏； （3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。放入盛有5ml Hanks液的培养皿中； （4）制备脾细胞悬液 ①钢网研磨法：无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min 5-10min， (或1500rpm，4-7min)。取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色(0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀)，计算细胞存活率(应在95％以上)。调整细胞浓度为 5 105/ml。 ②梳刮法：脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入
T淋巴细胞转化试验步骤及注意事项
淋巴增殖实验: 第一种，取外周血和脾脏分离淋巴细胞用于淋巴增殖实验,具体步骤如下 ⑴雏鸡翅下釆血2mL,加入1mL抗凝血和1mLPBS的混合液,混合均匀后,缓缓加入装有2mL淋巴细胞分离液的无菌透明的大离心管中,不要摇晃,注意血液与淋巴细胞分离液不要混合,2000rpm,离心20min,可以看见中间有层白色雾状白细胞,吸取白细胞至2inL离心管中,2000rpm离心5min取沉淀; (2)向离心管中加入1mL 1640清洗2遍,2000rpm离心5min取沉淀; ⑶将沉淀悬于1mL DMEM,细胞计数板计数,取 1 xlO7个细胞悬于ImLPBS中,置于37°C培养箱中用CFSE (终浓度2gM)避光染色lOmin,每隔2-3min上下颠倒一次; (4)DMEM洗漆细胞2次,每次1mL,2000rpm离心6-7min; (5)悬于1mL DMEM 中; (6)取5xl05个细胞置于96孔板,同时加入20μ30μg/m的Con A,DMEM补齐至200μL,4℃二氧化碳培养箱诱导3d; (7)流式专用buffer洗涤2次,2000r离心5min,200μbuffer悬起,流式细胞仪检测。 取1小块脾脏加入1mL 1640研磨,脾脏细胞先用200μL红细胞裂解液作用5min,2000rpm离心5min,计数,之后重复上述步骤。
第三种，外周血液 T、B 淋巴细胞增殖功能测定——MTT 测定法 1. 外周血液淋巴细胞悬液的制备无菌采取外周血液，以淋巴细胞分离液密度梯度离心法(2000r/min，20min)分离淋巴细胞，再用 RPMI1640 培养液离心洗涤(1500r/min，10min)淋巴细胞 3 次，用台盼兰拒染法检测细胞活率＞95％，同时进行细胞计数，用 RPMI-l640 完全培养液调细胞浓度至1×107/ml。 2. 外周血液 T 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板每孔加入50μl含20μg/m1 ConA 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液。向每孔中加入淋巴细胞悬液50μl，培养物总体积为100μl，细胞终浓度为 0.5×107/m1，Con A 终浓度为10μg/m1，设 3 重复孔。细胞置 40℃、％CO2、饱和湿度条件下培养 21h。每孔加 5mg/m1MTT 溶液10μl，继续培养3h 后，加入100μl DMSO溶液，置于37℃培养箱恒温作用 15min，取出后用酶联免疫检测仪检测，以空白对照孔调零，检测 590nm 波长下的吸光度值（A590nm），结果以 3 重复孔平均值表示。 3. 外周血液 B 淋巴细胞增殖功能测定于 96 孔微量培养板中每孔加入50μl 含10μg/m1LPS 的 RPMI1640 培养液，对照孔只加 RPMI1640 培养液50μl，设 3 重复孔。每孔中
人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案
实验方案 实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析 一、实验目的 1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。 3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。初步掌握人类染色体G带的特征及其 识别。 二、实验原理 所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。 染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。 在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。 正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。 染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。根据这些特征，可以准确地识别每条染色体，检出染色体数目或结构畸变。 表1 人染色体组型及其特征
淋转试验
淋巴细胞转化试验 （一）原理： 四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。 （二）材料：MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。丝裂原：PHA、ConA、PWM或其他丝裂原 （三）方法： 2、淋巴细胞增殖反应：将5×105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装3n个孔，3（n-1）孔加ConA(5ug/mL)，另3个孔不加ConA作为对照。置5％CO2，37℃培养48-72h，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10ul/孔。37℃培养4-6小时。 4. 1000g 离心10分钟弃上清，各孔内加入150μl DMSO，溶解10min，30分钟内（或加2%SDS 100ul/孔，过夜。，或干燥后，各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇100ul）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。 实验结果将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。 注意事项（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果
猪淋巴细胞转化实验
猪淋巴细胞转化实验 1.采集抗凝血每个10ml注射器吸入100ul肝素钠抗凝剂（20mg/ml），每个样品无菌采血5-8ml。（保存在4°环境，从猪场回来最好放在冰盒中） 2、淋巴细胞分离，采集的肝素抗凝外周血液（肝素用量20U/mL），可采用以下方法进行分离。 （1）Ficoll-Comray （聚蔗糖——泛影钠）分离淋巴细胞法： 用10毫升的试管，加入4毫升淋巴细胞分离液（比重介于1.0-1.090之间），在这种分层液的界面上，轻轻加入4毫升左右肝素化的血液，千万不要打乱两液间的液面。然后用1500rpm，离心15分钟。此时即可见到液体分为四层。最下层是红细胞和粒细胞，分层液在它的上层，最上层是血浆层。淋巴细胞在血浆层和分层液之间，淋巴细胞多时，可呈现一层乳白层。用移液器直接插入淋巴细胞分层液吸取淋巴细胞1.5mlEP管中，充分混匀，2000rpm离心10分钟，弃去上清，即获得纯淋巴细胞，可加入适量HanK’S液进行计数，应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。 （2）红细胞裂解法 用10毫升的试管加入8ml的Tris-MH4C1红细胞裂解液，然后加入2-4ml抗凝血，室温放置20min（每各5min上下缓慢摇匀一次），后1500rpm离心10min，弃掉上清，用HanK’S液混悬细胞进行计数（如果红细胞很多，可以再用5ml裂解液裂解一次）。应用浓度为1-2×106/mL，每份需用1毫升。 3.流式细胞仪检测CD3/CD4/CD8步骤 待血液样品和灌注液样品都计数完毕后，吸取一定体积含有106的细胞悬液，1500rmp离心 3min，弃掉上清液，加入用PBS混匀的含有CD3/CD4/CD8混合抗体的反应液80ul，混匀后4℃反应30min。 待反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入0.5ml含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。 加入0.5ml含有4%多聚甲醛的PBS，4℃反应30min。 反应过后，1500rmp离心3min，用100ul移液器吸弃上清，然后加入0.5ml含有1-2%胎牛血清的PBS液，混合均匀，1500rmp离心3min，后用100ul移液器吸弃上清。 （最多4℃再用不含胎牛血清的PBS液洗涤一次，最后用200ulPBS液重悬细胞进行上机检测。 放置过夜） 4.MTT实验步骤 1）接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔100000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul. 2:培养细胞：每个样品设置10个重复孔，其中5个孔加入10ul ConA(孔中终浓度5ug/ml),另外5个孔加入10ul培养液，同一般培养条件，培养68h，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS
淋巴细胞功能测定
免疫学技术原理与应用 PAIT-12 淋巴细胞功能测定 孙汭 中国科技大学生命科学学院 免疫学研究所
PMIT-12 淋巴细胞功能测定 一、常用的淋巴细胞功能测定 二、T淋巴细胞功能测定 三、B淋巴细胞功能测定 四、NK细胞细胞毒试验 一、常用的淋巴细胞功能测定 1、淋巴细胞增殖试验 ① 3H-TdR掺入法 原理：淋巴细胞在丝裂原或特异性抗原刺激下转化为淋巴母细胞，发生转化过程中，细胞DNA合成大量增多。此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-Thymidine riboside, 3H-TdR), 使3H-TdR掺入新合成的DNA中，经β-液体闪烁仪检测淋巴细胞DNA 的3H-TdR掺入量，根据掺入细胞内的核素的量可判断淋巴细胞增殖的程度。 ② MTT比色法 原理：MTT（（3-4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑）是一种黄色可溶性噻唑盐，掺入细胞后，在细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢过程，MTT代谢形成蓝色的甲攒（Formazan)沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。甲攒经异丙醇溶解后呈紫蓝色，借助酶标仪测定OD值，可反映细胞增殖水平。 2、细胞毒试验 ①51Cr释放法 原理：用放射性核素51Cr（Na251-CrO4，鉻酸钠）标记靶细胞，51Cr即可进入靶细胞，与胞浆蛋白结合。然后将51Cr标记的靶细胞与待检细胞（效应细胞）共同孵育一定时间后，若待检细胞能够杀伤靶细胞，则51Cr从靶细胞释放出来。51Cr的释放量与效应细胞的活性成正相关。即靶细胞被杀伤的越多，释放到上清中的游离51Cr越多，用γ计数仪测定上清中51Cr的放射活性（cpm）值，以计算待检细胞的细胞毒活性。 （一）、用51Cr铬酸钠标记靶细胞 1．用RPMI-1640培养液洗涤107靶细胞，去上清液。用0.5ml不含碳酸氢钠的完全培养液悬浮细胞。加入100μCi（3.7MBq）51Cr铬酸钠，37℃水浴中标记1小时，每5～10分钟摇晃一次，混匀细胞。 2．用RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次400×g 10分钟。用50ml RPMI-1640培养液悬浮细胞，置37℃水浴30分钟，以减少非特异的自然释放。 3．离心200×g 10分钟，去上清液。小心用RPMI-1640培养液悬浮细胞，尽量减少振荡引起的细胞损伤以降低靶细胞的自然释放率，将细胞浓度调整为0.5×105或1×105/ml备用。 （二）、4小时51Cr释放实验 1．在96孔圆底细胞培养板中加入51Cr标记的靶细胞，每孔加100μl。
混合淋巴细胞培养试验
混合淋巴细胞培养试验 文章目录*一、混合淋巴细胞培养试验的基本信息1. 定义2. 专科分类3. 检查分类4. 适用性别5. 是否空腹*二、混合淋巴细胞培养试验的正常值和临床意义1. 正常值2. 临床意义*三、混合淋巴细胞培养试验的检查过程及注意事项1. 检查过程2. 注意事项*四、混合淋巴细胞培养试验的相关疾病和症状1. 相关疾病2. 相关症状*五、混合淋巴细胞培养试验的不适宜人群和不良反应1. 不适宜人群2. 不良反应 混合淋巴细胞培养试验的基本信息 1、定义混合淋巴细胞培养试验(mixedlymphocyteculture,MLC)是一种测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容程度的试验方法,常用于器官移植前的组织配型。混合淋巴细胞培养将供者与受者的淋巴细胞做双向混合培养,或者灭活供者的淋巴细胞做向混合培养,细胞反应的程度与供-受者相容的程度呈负相关的试验。 2、专科分类生长发育检查 3、检查分类免疫检查 4、适用性别男女均适用
5、是否空腹非空腹 混合淋巴细胞培养试验的正常值和临床意义 1、正常值形态计数法: 转化率10%;同位素计数法:比较cpm 得出P0.05。 2、临床意义混合淋巴细胞培养试验为与供-受者相容的程度呈负相关的试验。异常结果:肾移植时,活体供肾者的转化率应10%;尸体供肾者的转化率应为10%。只能在同一批实验中选用低反应配组。淋巴细胞转化率10%者为不同两个体间的组织是相容的。淋巴细胞混合培养试验用以检测患者的免疫状态。T淋巴细胞数减少时,转化率也降低。可作为器官和骨髓移植的配型方法之一,用来选择合适的供体。如转化率高为供受者分歧用。转化率低,移植后的成功率高。 混合淋巴细胞培养试验的检查过程及注意事项 1、检查过程供体淋巴细胞的制备: 新鲜外周静脉血按1∶1比例加在装有比重为1.077的淋巴细胞分离液的离心管中,轻稳加在液面上。 2000 r/min离心20 min,吸取中间雾状淋巴细胞层。生理盐水洗涤2次。台盼蓝染色,计数板计数。调整细胞密度为2×109/L,分成3管,各自离
T淋巴细胞转化试验
T淋巴细胞转化试验 （T lynrphocyte transformation test） 正常机体的T淋巴细胞在体外培养过程中，受到特异性抗原或有丝分裂原（植物血凝素或刀豆素等）刺激，细胞的代谢和形态可发生一系列变化。主要表现为电荷的改变，细胞内蛋白质和核酸合成增加，及以细胞形态可转化为淋巴母细胞。为此，在体外利用各种刺激剂激发淋巴细胞，根据其转化程度可测定T淋巴细胞的应答功能。这类方法称为淋巴细胞转化试验（lymphocyte leansformstoin test）简称淋转试验，在临床上现已作为测定人体细胞免疫功能的指标之一。细胞免疫缺陷时，这种转化功能也降低。目前最常用植物血凝素（PHA）作为分裂原来检测淋巴细胞转化功能，称PHA刺激淋巴细胞转化试验。 体外引起T淋巴细胞转化的刺激物种类颇多，大致有以下几类： （1）非特异抗原刺激物，如从豆类中提了的植物血凝素（PHA）和刀豆素A（ConA）等，通称为促有丝分裂素（mitogen）。 （2）特异性抗原刺激物，如结核菌纯化蛋白衍生物（purifeg protein derivative 简称PPD）等。 （3）组织抗原和抗血清，如同种白细胞，抗淋巴细胞血清等。 上述各种刺激物中以PHA应用最广，在体外淋巴细胞培养中，可使正常人外周血液中T淋巴细胞几乎均起转化，其所引起的淋巴细胞转化率大大超过特异性抗原的作用。但这种反应与机体是否致敏无关，因此是属于非特异性的淋转试验。特异性抗原仅能使相应抗原致敏的淋巴细胞发生转化，转化率一般在5-30%左右。虽然T淋巴细胞对非特异性和特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，所发生的分裂和增殖反应却是相同的。因此根据PHA激活T淋巴细胞分列增殖反应的程度，可以推测T淋巴细胞识别特特异性抗原后的增植反应。从而利用PHA 刺激淋巴细胞转化试验一项非常特异性体外免疫学检测指标，在一定程度上可作为刺激原，因此一般称为PHA 淋巴细胞转化试验。 PHA淋转试验有形态计数法和同位素计数法两种，前者测定转化的淋巴母细胞百分率，后者测定放射性同位素标记的DNA前身掺入细胞合成DNA的量。 形态计数法的优点是不需要特殊设备，便于一般实验室采用，但判读结果主观因素影响较大，而且有相当数量的中等大小的淋巴细胞难于分类。此外，在培养过程中单核细胞相对增大，形成似转化的淋巴细胞，容易造成误计。加上此法的测定效率低，重现性较差，有被同位素掺入法取代的趋向，但要了解被激活淋巴细胞的比例和形态改变，则仍需应用形态观察法。 淋巴细胞转化试验的操作方法主要有两种： 1、形态学方法：加分裂原共同培养后，观察形态学变化，计算转化为母细胞的百分数； 2、3H—胸腺嘧啶核苷掺入法：加分裂原共同培养结束前一定时间，加3H标记的胸腺嘧啶核苷，培养后测定镊入细胞内的放射性物质的相对数量，以间接了发转化程度。 形态学方法比较简单易行，不需特殊设备，但重复性和客观性较差；3H掺入法结果客观，准确性好，重复性好，但需要一定设备条件。 PHA淋转试验形态学检查法 一、目的： 1、了解本技术的原理。 2、掌握操作方法。 3、学会分辨几类细胞形态学上的特点。 二、原理： 将人外周血液或分离的白细胞和PHA混合进行体外培养数日后取培养细胞作涂片染色镜检，可见大部分淋巴细胞转化为体积较大的淋巴母细胞，细胞核内生成核仁，并有部分细胞发生分裂现象。由于PHA只激发T淋巴细胞转化，为此计数200个淋巴细胞，可计算出转化细胞的百分离，即得淋巴细胞转化率（简称转化率）。 在正常情况下，PHA淋巴细胞转化率为60-80%，50-60%则偏低，50%下则降低。 三、试验材料： 1、PHA溶液：PHA有粗制品两种。粗制品是含多糖的蛋白质成分，各为PHA-M。精制品为纯蛋白成分，名为PHA—P。国内虽有少数精制的PHA产品，但仍有待试剂标准化。 目前国内在临床检验中作淋转试验所用PHA一般均为粗制品，没有质量标准。原料来源不同，制备条件差异均可影响产品的活力。即使属于同一单位供应，各批产品的活力亦不相同。虽可参照说明书而决定其用量，按下述正式试验方法检测同一标本。如PHA加入量过多，对细胞有毒性；加入量少，不足以刺激淋巴细胞转化，一般最适浓度为50-200Ug/mL。 PHA粗制品亦可按下法自制：将广东红花云豆（Phaseolus Vulgaris）研磨成粉末，取10g粉末加生理盐水100ml，放置4℃冰箱浸泡48小时，每隔数小时稍加搅拌。取出后用滤纸过滤或在4℃离心（2，500转/分）30