探针工作原理

探针定义

探针是坐标测量机的一部分，主要用来触测工件表面，使得测头的机械装置移位，产生信号触发并采集一个测量数据。一般的探针都是由一个杆和红宝石球组成。

通过需要测量的特征，您可以判断应当使用探针的类型和尺寸。在测量过程中，要求探针的刚性和测尖的形状都达到尽可能最佳的程度。

选择探针的原则：

为保证一定的测量精度，在对探针的使用上，您需要：

- 探针长度尽可能短：探针弯曲或偏斜越大，精度将越低。因此在测量时，尽可能采用短探针。

- 连接点最少：每次将探针与加长杆连接在一起时，您就额外引入了新的潜在弯曲和变形点。因此在应用过程中，尽可能减少连接的数目。

- 使测球尽可能大

主要原因有两个：

使得球/杆的空隙最大，这样减少了由于“晃动”而误触发的可能

测球直径较大可削弱被测表面未抛光对精度造成的影响

RENISHAW探针系列介绍

测尖的材料-----

红宝石：

最常见的测球的材料是红宝石，因为红宝石是目前已知的最坚硬的材料之一。红宝石球具有良好的表面光洁度，并具有优异的耐压强度和抗碰撞性。

只有极少的情况不适宜采用红宝石球，如下两种情况下，推荐采用其他材料制成的测尖：

第一种是在高强度下对铝材料制成的工件进行扫描。主要原因在于材料吸引，基于一个称为“胶着磨损”的现象会在触测过程中发生。在这种情况下，一个较好的选择是氮化硅。

第二种情况是对铸铁材料工件进行高强度扫描，这时会在红宝石表面产生“磨损”。在这种情况下，推荐使用氧化锆球。

氮化硅：

氮化硅拥有许多与红宝石同样的特性。它是一种非常坚硬并可抗磨损的瓷，并可加工成高精度的球，并进行高度表面抛光。氮化硅与铝材料不吸引，因此不会产生红宝石球上出现的磨损。但是，氮化硅在扫描钢表面时呈现较多的磨损，因此其应用最好定义为测量铝。

氧化锆：

氧化锆球是一种特别坚韧的陶瓷材料，其硬度和耐磨性接近红宝石，基于其表面属性，使其是扫描钢工件表面的理想选择。

杆材料：

钢

探针的杆一般是由无磁性的不锈钢制成，大多具有2mm或更多的测球直径，杆长度可达到30mm。在这种情况下，不锈钢杆具有良好的刚性质量比。

碳化钨

碳化钨杆是在测量采用1mm测球的细杆情况下，或者是超长达到50 mm杆情况下具有最好的刚性。在这种情况下，重量会成为影响因素，因为弯曲会造成刚性损失。

陶瓷

在测球直径大于3 mm的情况下，或者是长度大于30 mm，陶瓷杆相对钢具有更好的硬度。较碳化钨，重量更轻，同时由于在碰撞过程中易碎，而为测头提供更好的保护。

碳纤维 (RENISHAW GF)

有许多等级的碳纤维材料，RENISAHW GF具备良好的硬度指标，在纵向和扭矩方面，同时具有特别轻的重量。

RENISHAW GF对于长度在50mm以上的探针来说，具有最佳的刚性质量比。探针的形状

直探针

结构最简单的探针系统包括球度非常好的工业红宝石球，杆材料可以选择。

红宝石是非常硬的材料，做成的探针的磨损量最小。它的密度也非常低，这样针尖质量最小，从而可以避免由于机器运动或振动而造成的探针误触发。

使用的杆可以有多种材料可供选择–不锈钢，碳化钨，陶瓷和各种特殊的碳纤维材料“Renishaw GF”。–这些结构简单的红宝石探针更适合于多种检测应用场合。

探针的有效的工作长度（EWL）是杆在触测被测元素之前红宝石球的变动范围。

如何来选择球的尺寸和探针的EWL是由待检测的元素的尺寸决定的。尽可能选择大的红宝石探针球和尽可能短的杆，可以保证最大的球/杆距离，这样可提供更有效的EWL。使用更大一些的红宝石球可以降低待测组件表面粗糙度的影响。

当使用长的探针和加长杆组合来测量时，不推荐使用标准的动态触测测头，由于这种情况下使用时探针容易弯曲变形，刚性会降低，精度也会损失。这和使用其他类型的测头如允许有弹性变形的测头，它们的触测力非常低，允许使用长的探针和加长杆组合，而不会带来明显的精度损失。

星型探针

这些探针组合在一起允许你使用多探针测头来测量复杂的元素和孔。四个或五个红宝石探针安装在刚性的不锈钢中心上。可提供标准尺寸探针，也可以选择不同的探针，你可以使用五方向探针和任一个RENISHAW提供的探针来组合星型测头。

星型探针可用于检测多种不同的元素。使用多探针测头可以有效降低检测时间。减少在测量诸如边缘或凹槽等内部特征时移动测头到极限点的需要。可以使用星型测头在Z方向进行有效的检查，这是由于探针可以探测到探针体的直径范围外侧。星型探针上的每个探针都要求校准，这和单探针校准方式一样。

圆盘探针

这些探针用于测量钻孔的切口和凹槽，通常用星型测头是探测不到的。可以将它们想象成球度非常好的球“截面”，有多种直径选择和厚度选项。所有的旋转调整和增加中心探针的能力都是RENISHAW圆盘探针的触测范围，使其具有柔性和易于使用。

用简单圆盘的“球型边缘”来探测和使用相当的大探针球是同样有效的。然而，使用球型探争时，球表面的小区域接触工件，而薄的圆盘却要求精细的角度校正，以便保证正确地触测待测工件。

简单圆盘仅仅要求一个直径的验证数据（通常在环行量规中），但只限制在X 和 Y 两个方向中。

考虑探测深的钻孔底部会带来的额外的柔性变形，圆盘也允许有带螺纹的中心以便可以固定中心测杆（接近圆盘也是有限的）。

特殊应用的探针

多种专用探针可以用来测量多类元素诸如：螺纹体，薄截面材料，工具箱以及其他专业应用。

圆柱探针

用于探测薄壁材料的孔。此外，各种带螺纹的元素可以被探测，螺纹中心被定位。球端圆柱探针允许多角度采集数据和在X，Y，Z三个方向探测，这样可以进行表面检测。

尖探针和陶瓷中空球状探针

设计尖状探针是为了检测螺纹体，特殊的点和划线。圆端尖探针允许更精确的测量和特征元素的探测。可以用于更小的孔的检测。

陶瓷材料的中空球状探针对于探测X，Y和Z三个方向比较深的元素和钻孔都是理想的。仅需要一个探测杆。在这个范围有两型号是直径18 mm和30 mm。这些探针通常被设计与TP2/TP20/TP200和TP6来配合使用。大直径球的探测可减小粗糙表面的影响。

两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则

两种定量分析方法的比较及Taqman 探针、引物设计原则 遗传物质DNA 首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA （mRNA ）,携带遗传信息的mRNA 从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA 携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA 完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA 的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA 含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 定量PCR 仪是在普通PCR 仪的基础上加装了荧光激发装臵和荧光检测装臵，PCR 扩增和检测同时进行；在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 定量PCR 常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct 值 扩增曲线：反映PCR 循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR 仪每次轮PCR 扩增都会自动记录 荧光强度的变化 荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设臵的原则要大于样本的荧光背 景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保 证回归系数大于0.99。 CT 值： PCR 扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 扩增曲线 阈值及CT 值 荧光定量PCR 的数学原理 理想的PCR 反应： X=X0*2n 非理想的PCR 反应： X=X0* (1+Ex)n （n ：扩增反应的循环次数；X ：第n 次循环后的产物量；X0：初始模板量；Ex ：扩增效率） 在扩增产物达到阈值线时 : C(t) value

两种定量分析方法的比较及Taqman探针引物设计原则

两种定量分析方法的比较及Taqman探针、引物设计原则 遗传物质DNA首先要把所携带的遗传信息转录成为信使RNA（mRNA）,携带遗传信息的mRNA从细胞核进入到细胞质中与核糖体结合，在核糖体中mRNA携带的遗传信息被翻译成为多肽，多肽经过进一步加工后变成蛋白质，至此遗传物质DNA完成了表达过程。期间的转录过程是基因表达中非常重要的调节步骤，所转录的mRNA的多少直接影响着相关最终蛋白质的多少，所以通过对细胞内某条基因mRNA含量多少的分析，就能大致判断出该条基因的表达是否活跃。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测同时进行；在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。该技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 定量PCR常用的三个常用概念 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动记录荧光强度的变化 荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保 证回归系数大于0.99。 CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。 C(t) value 扩增曲线阈值及CT值 荧光定量PCR 的数学原理

实时荧光定量 原理 taqman 探针简介

实时荧光定量 PCR技术原理与应用 聚合酶链式反应 ( PCR) 可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析。无论定性还是定量分析，分析的都是 PCR 终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量 PCR 技术应运而生。所谓的实时荧光定量 PCR 就是通过对 PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 ( 如图 1) 。 图 1 实时荧光扩增曲线图 一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段 , 荧 光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光 背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再

呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段， PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量 PCR 技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和 CT 值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值（ threshold value ）（如图 2 所示）。

Taqman设计总结

一、单重Taqman引物探针设计：（为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast中核实一次） 1、探针：探针的设计应该在引物的设计之前 ①长度：18~35（18~30之间最好、最常见），最长37；太长淬灭效果不好。 ② TM值：Primer Express软件计算出来的Tm值在66~72℃之间（最常见68~70℃）， 最好为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5~10℃，GC含量在30~80%（最好40%~70%），因此探针最好是富含GC的保守片段；（Primer Express：Do not expand the Tm range by more than 2 °C from the default range）。 ③探针位置：尽可能地靠近上游引物,上游引物的3' 端离探针的5' 端为1-20bp（一 般10个以内），最好是探针的5'端离上游引物的3' 有1个碱基。 ④5'端应避免使用碱基G，5' G会有淬灭作用，即使被切割下来这种淬灭作用也还 会存在；如果选择FAM-dye在5'端第二个序列也不能为G（G in the second position on the 5' end in FAM dye-labeled probes can reduce fluorescent normalized reporter signal）。 ⑤可选：整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，G的含量多于C会降 低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针。要同时考虑在正反两条链上设计引物与探针。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段，且这个不同的碱基最好在探针的中间，且最好为A或T。 ⑥Repeating oligonucleotides：a. 避免探针中同一碱基重复过多，尤其是要避免4 个或超过4个的G碱基出现，即≦3（Avoid runs of identical nucleotides. If repeats are present, there must be fewer than four consecutive G residues.）；b. 避免连续的6个A出现（Consecutive A residues：Avoid six consecutive A residues anywhere in the probe. Consecutive A residues can cause a high No Template Control (NTC) signal）；c. 避免探针的中间区域含有2个或以上的CC dinucleotides（Avoid two or more CC dinucleotides in the

TaqMan探针法实时荧光定量PCR的应用和研究进展

TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 的应用和研究进展 姜文灿，岳素文，江洪，王成彬 姜文灿，温州医科大学检验医学院、生命科学学院2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术。 [摘要] TaqMan 探针法实时荧光定量PCR 因其重复性好、特异性强、线性范围宽等特点在各个领域有着广泛的应用，内标系统的引入进一步提升了该方法的灵敏度，增加了其可靠性和实用性。然而，这一技术也因为假阴性和假阳性问题存在着改进的空间。本文从TaqMan 探针法的简介、研究进展以及应用前景展开综述。 [关键词] 实时荧光定量PCR ；TaqMan 探针；引物二聚体；内标系统 [中图分类号] R446.6-3 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 2095-2775（2015）01-0797-09 Application and research progress of TaqMan probe real time PCR [Abstract] TaqMan real-time PCR has been widely used in various fields because of its good repeatability, strong specificity, wide linear range, etc. Import of the internal control (IC) system further improved the sensitivity of this method, consequently increased its reliability and practicability. However, there are still some improve rooms for this technique because of the false negative and false positive problem. Here we proceed a review for TaqMan real-time PCR cover its introduction, research progress and applicative prospect. [Key words] Real-time fluorescent quantitative PCR; TaqMan; primer dimer; IC [作者简介] 姜文灿，2014级硕士研究生。主要研究方向为分子生物学技术 [作者单位] 325000 浙江温州 温州医科大学检验医学院、生命科学学院（姜文灿，王成彬）；100085 北京 北京泰格瑞分子检验有限公司（岳素文，江洪） [通讯作者] 王成彬，E-mail ：wangcb301@https://www.wendangku.net/doc/6218723280.html, 聚合酶链式反应 ( Polymerase Chain Reaction, PCR ) 是在体外模拟体内核酸复制从而获取大量目的基因拷贝的技术，最早由Mullis [1]发明。其几何级数的放大模式，相比于普通信号叠加的检测方法灵敏度提升了上百万倍，同时又因操作简便，成为核心技术之一。实时荧光定量 PCR 是在传统 PCR 基础上加入信号系统达到实时监测 PCR 扩增的目的，继承了传统 PCR 高灵敏度和操作简便的特点，同时实现了对样本的定量检测。根据信号基团的不同，实时荧光定量 PCR 可以分为染料法和探针法。非特异的染料法成本较低，但面临着类似于普通 PCR 非特异性扩增产物干扰的假阳性问题[2]。探针法中使用的探针多是 TaqMan 探针，与染料法相比，在一定程度上避免了假阳性问题的出现。现阶段， TaqMan 探针技术在医药卫生、农业科学、生物科学、政治法律等方面得到了广泛的应用[3-6]。 1 TaqMan 探针法简介 1.1 原理 TaqMan 探针的基本原理是利用扩增过程中Taq 酶的5’核酸外切酶活性切割与靶序列结合的寡核苷酸探针，该探针5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团并被磷酸化以防止探针在PCR 过程中延伸[7]，当引物延伸至寡核苷酸结合位置时，Taq 酶可以将其切割成小片段，使报告基团和淬灭基团分开并发出荧光（图1），经过检测伴随扩增产物增加过程中荧光强度的增长对样本进行定量分析。现阶段使用的荧光报告基团有HEX 、FAM 、ROX 、JOE 、VIC 等[8]，荧光淬灭基团主要有TAMRA 、BHQ 等。研究发现，BHQ 本身具有非常低的荧光背景，实用性

荧光定量PCR的原理及使用

荧光定量PCR的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法： 1、双链DNA内插染料 某些染料如SYBR GreenⅠ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR GreenⅠ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green 染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法 是一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC 等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR 的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步

TaqMan探针技术原理

TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′?5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其3′?5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号(图4)。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。 图4 TaqMan探针的荧光信号产生机制 TaqMan探针根据其3′端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:普通的TaqMan 探针和TaqMan MGB探针。MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-

Fluorescent Quencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB (Minor Groove Binder)修饰基团(图5)，可以将探针的Tm值提高10?C左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。 图5 TaqMan MGB探针