防脱片处理步骤

防脱片处理步骤

《一》载玻片和盖玻片的处理

将载玻片或培养用的小盖片浸泡在重铬酸钾浓硫酸清洁液中24小时，然后流水充分冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍以上，而后置95％乙醇中12小时。取出擦干或烤干，贮放于玻片盒内备用。盖玻片很薄，以上处理程序必须缩短时间，清洁液浸泡只需2小时，流水冲洗注意勿损伤玻片。

《二》黏附剂的使用

1．多聚左旋赖氨酸(poly-1—lysine) 首先配制0．1％(ω/υ)多聚左旋赖氨酸浓缩液，室温下(18～26℃)可保存1年。使用时．将试剂10倍稀释成工作液，浓度为0．01％(ω/υ)，2—8℃冰箱保存，有效期3个月。使用方法是将充分洗净和预先干燥的玻片浸泡于稀释后的多聚左旋赖氨酸溶液数十秒或提拉十次，沥干．于室温下晾干12—24小时或在45℃以下烤箱内烘干。处理后的玻片避光干燥可长期保存。

2．3—氨丙基—乙氧基甲硅烷(3—amino propyltriethoxy silane，APES) APES必须现用现配。用此方法黏合的玻片应垂直烤片而不能水平烤片，否则，组织片中易出现气泡。APES的使用方法：用丙酮50倍稀释(APESl份、丙酮49份混合)，将洗净的玻片放人稀释好的APES中，停留20～30秒，取出稍停，再人纯丙酮或蒸馏水中涮去未结合的APES。置通风橱中晾干即可。注意用APES防脱片处理的载玻片捞片时组织应一步到位．并尽量减少气泡存在，以免影响染色结果。注意不要将APES与其他防脱片剂混合使用。

多聚左旋赖氨酸为目前免疫组织化学染色中最常用的防脱片剂，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如效果不佳，可用双重处理(APES和poly-l-lysine)的切片。在以上两种方法均无效的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前放在APES l：50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干后即可进行下一步骤。

《三》免疫组织化学染色中常见脱片原因

1．组织固定、脱水、透明不充分。

2．组织切片过厚。

3．组织切片有折叠。

4．过度的热抗原修复(高压、微波、水煮)处理或抗原修复液的pH偏高。

5．操作过程中，冲洗方法不正确等。

组织化学技术的基本要求

在应用组织化学技术显示组织和细胞内化学物质及其定位和定量以及代谢状态时，必须满足以下要求：

1．保持良好的组织和细胞的形态结构，保持组织和细胞生前的化学成分和酶的活性，防止组织自溶，使反应的产物不易位、不弥散，保证反应产物定位精确。

2．反应产物具有可视性，即反应产物必须呈现颜色，而且必须是颗粒微细的有色沉淀，不被溶解，定位于原位。反应产物具有定量的可能性，即反应物沉淀的颜色深度与相应物质含量或酶的活性具有一定的量效关系。

3．所用组织化学方法必须具备一定的特异性．即仅与某种化学成分发生反应，以便获取正确的实验结果。倘若组织化学试剂同时能与两种以上物质反应，则必须有进一步的分析方法。此外还要具备一定的灵敏性，以便含量极微的物质也能被显示出来。

4．所用方法稳定并能重复，以利于重复观察和验证。

5．设置必要的对照实验，否则难以判断其结果的可靠性。

组织化学与免疫组织化学染色的细胞标本取材

(一)培养细胞

1．贴壁生长的细胞在细胞培养接种前，把涂有黏附剂的小盖片放人培养板中，接种后的细胞自然爬在小盖片上生长。取材时，把小盖片用预热的磷酸盐缓冲液(PBS)轻轻冲洗、沥干后即可加入固定液。

2．悬浮生长的细胞制备细胞浓度为2×105-6细胞／ml悬液，取50～100ul，加入离心涂片机内，1000r ／min离心2分钟，细胞即可均匀分布于已涂黏附剂的载玻片上。

3．印片法主要应用于活组织标本检查和剖检标本取材。新鲜标本做一剖面，充分暴露病变区，将载玻片轻轻压于病变区，脱落的细胞便黏附在玻片上。随后立即将载玻片浸入细胞固定液内5～lo分钟，取出后自然干燥，低温保存备用。其优点是简便省时，细胞抗原保存较好；缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞有重叠，影响观察效果。

(二)涂片法

临床穿刺获取含有细胞的液体(腹水，胸水和心包液)或气管、宫颈等分泌物可直接涂片，如果液体太多，可加入l一2ml Hanks液(或细胞培养液)轻轻混匀，500r／min离心5～10分钟，弃上清液，制成细胞悬液(2×106细胞／m1)，使用细胞离心涂片机或吸一滴于载玻片上，轻涂，干燥后固定。

组织化学与免疫组织化学染色的组织标本取材

在组织细胞材料准备过程中，要求尽可能保持生活状态下组织细胞形态结构的完整性，尽量保持其化学成分和酶的活性，更要保持组织细胞的抗原性不受损。如果抗原性被破坏或组织坏死自溶，被检物质已经丢失，即使用高超的技术也很难检出，而且往往由于组织的坏死或制片时的刀痕挤压，出现假阳性结果。取材应尽可能迅速，所用的刀应锐利，不可反复切拉组织．以免造成组织的挤压。标本离体后应

立即用固定剂进行固定，或立即速冻进行冷冻切片，或保存于一80℃冰箱备用。组织块大小要适中，一般为2．5cm× 2．5cm× 0．2cm，切记取材时组织块宁可面积大，不能厚的原则，保证固定液快速渗透到组织内部，使组织蛋白迅速凝固，从而完好地保存被检物质和组织细胞形态。对于病理标本，取材部位应包括主要病变区和病灶与正常组织交界区，必要时取远离病灶区的正常组织作对照。

动物取材时应先将动物麻醉再处死，其方法如下：

1．乙醚吸入麻醉法将动物放入有浸透乙醚棉花的玻璃缸内．盖上盖子，待动物麻醉后再取材。该法常用于大白鼠和豚鼠的取材，但易引起内脏淤血。

2．戊巴比妥钠和乌拉坦麻醉法对较大的动物如兔、猫、狗和猴，乙醚吸人麻醉效果不好，一般用3％戊巴比妥钠水溶液或用20％乌拉坦，腹腔或静脉注射进行麻醉，注射剂量约为1～2m1／kg。麻醉后再放血，以免内脏淤血。

3．空气栓塞法用注射器回抽空气于管内，将空气注入动物静脉内，可立即使动物死亡，但因此法使血液内产生空气栓塞，致使血管和内脏易产生淤血，故应尽快切断主动脉放血，再行取材。