ICAM-1在家兔视网膜缺血再灌注损伤中的重要运用
山西医科大学
硕士学位论文
ICAM-1在家兔视网膜缺血再灌注损伤中的重要作用
姓名：张莉
申请学位级别：硕士
专业：眼科学
指导教师：成霄黎
20050515
学位论文独创性声明
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摘要
目的：研究家兔发生视网膜缺血再灌注损伤后不同时间点细胞间粘附分子一１（ＩＣＡＭ一１）的表达及视网膜结构、功能损伤情况。
方法：选取正常无眼疾家兔５０只，随机分为１０组，即正常对照组（Ａ）、单纯灌注组（Ｂ）、再灌注后０小时组、３小时组、６小时组、１２小时组、２４小时组、４８小时组、４天组、７天组，每组Ｎ＝５只家兔（眼只数ｒｌ＝ｉ０只）。采用前房灌注至高眼压的方法制作视网膜缺血再灌注损伤模型；造模完成后在预定时间点给各组实验动物作Ｆ－ＥＲＧ检查，观察网膜功能状态；在预定时间点处死动物，摘取眼球标本，进行ＨＥ染色及免疫组化ＳＡＢＣ染色，光镜下观察网膜结构损伤及ＩＣＡＭ—ｌ表达情况，并应用图像分析对后者进行量化；选取正常组、再灌注３小时组和再灌注２４小时组作电镜，观察网膜超微结构的改变；应用ＳＰＳＳ软件对数据进行统计学分析。
结果：１．Ｆ－ＥＲＧ检查：Ａ、Ｂ两组ｂ波振幅差别无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５），再灌注０小时组ｂ波振幅降至８７１．１２０９ｕｖ，至再灌注后３小时，ｂ波振幅部分恢复，其后ｂ波振幅呈持续性、进行性下降；２．光镜观察：神经纤维层及内丛状层水肿逐渐加重，神经节细胞数量递减，内核层排列疏松；再灌注６小时视网膜中开始出现浸润的自细胞，再灌注２４小时达高峰，４８小时后逐渐减少，但网膜结构损伤日趋严重；３．电镜观察：再灌注３小时后家兔视网膜视细胞外节盘膜形态变化尚不明显，仅见内节线粒体轻度肿胀，再灌注７天后视网膜外节盘膜疏松变形，内节结构紊乱，内外核层明显水肿，可见核固缩、核溶解，神经节细胞严重变性；４．视网膜ＩＣＡＭ～ｌ的表达：ＩＣＡＭ一１免疫反应产物定位于血管内皮细胞膜。Ａ组及Ｂ组视网膜血管仅有少量淡黄色着染，经６０分钟的缺血后，随再灌注时间的延长，阳性反应的血管数增多，且着色加深，至再灌注后２４小时反应达高峰。
结论：本实验通过对缺血再灌注后视网膜的结构、功能和ＩＣＡＭ—Ｉ表达的动态研究，说明在视网膜缺血再灌注早期损伤过程中，ＩＣＡＭ一１对白细胞从血流中浸润到网膜，发挥其损伤作用有关键性促进作用。
关键词：缺血再灌注损伤；视网膜；细胞间粘附分子一１；家兔
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Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｐｕｒｐｏｓｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｕｌｅ－－１（ＩＣＡＭ－?１）ａｆｔｅｒｒｅｔｉｎａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｒａｂｂｉｔａｎｄｔｈｅｉｎｊｕｒｙｏｆｒｅｔｉｎａｌｆｏｒｍａｔｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉＯｉｌ．
Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓｅｌｅｃｔ５０ｔｗｏｍｏｎｔｈｓｏｌｄｈｅａｌｔｈｙｒａｂｂｉｔｗｉｔｈｏｕｔｄｉｓｅａｓｅｏｆｔｈｅｅｙｅｓ，ｗｈｉｃｈａｒｅｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｅｎｇｒｏｕｐｓｗｉｔｈｒａｎｄｏｍ，ｔｈａｔｉｓｔｈｅｎｏｒｍａｌｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｇｒｏｕｐｗｉｔｈｏｕｔｈｉ曲ｐｒｅｓｓｕｒｅ，ｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ０，３，６，１２，２４，４８ｈｏｕｒｓ，４ａｎｄ７ｄａｙｓｇｒｏｕｐ．Ｅｖｅｒｙｇｒｏｕｐｈａｖｅｆｉｖｅｒａｂｂｉｔｓ（ｔｅｎｅｙｅｓ）．Ｒａｔｉｎａｌｉｓｃｈｅｍｉａｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｔｈｅｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒｐｒｅｓｓｕｒｅ（ｉｏＰ）．Ａｆｔｅｒｍａｄｄｉｎｇｒａｂｂｉｔｍｏｄｅｌｓ，ａｎｉｍａｌｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂｙＦ－ＥＲＧ，ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙｋｉｌｌｔｈｅｒａｂｂｉｔａｎｄｇｅｔｔｈｅｅｙｅｓａｔｏｎｃｅ，ａｎｄｍａｄｅｔｈｅｓａｍｐｌｅＨＥｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｉｒｎｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ（ＳＡＢＣ）ｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｓｅｌｅｃｔｔｈｅｒａｂｂｉｔｏｆ
ｎｏｒｍａｌｇｒｏｕｐ，ＩＲＩ３ｈｏｕｒｓａｎｄ７ｄａｙｓｇｒｏｕｐｔｏｄｏｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆＳＡＢＣｓｔａｉｎｉｎｇｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄｂｙｃｏｍｐｕｔｅｐｉｃｔｕｒｅ
ａｎａｌｙｔｉｃｓｙｓｔｅｍ．
Ｒｅｓｕｌｔ：１．Ｆ．ＥＲＧ：ＴｈｅｒｅｗａｓｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｇｒｏｕｐＡａｎｄＢ，ｔｈｅｂ．ｗａｖｅａｌｍｏｓｔｖａｎｉｓｈｅｄａｔＩＲｌ０ｈｏｕｒａｎｄｉｎｃｒｅａｓｅｐａｒｔｉａｌｌｙａｔ３ｈｏｕｒｓ，ａｆｔｅｒｔｈａｔｂ－ｗａｖｅｆａｌｌｄｏｗｎｐｅｒｓｉｓｔｌｙａｎｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ．２．Ｌｉｇｈｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ｔｈｅｒｅｗａｓｅｄｅｍａｉｎｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｌａｙｅｒ，ａｎｄｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｄｅｃｒｅａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ．Ａｆｅｗｏｆ
ｔｉｍｅｐａｓｓｉｎｇ，ｔｈｅｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄｉｎｒｅｔｉｎａａｔ６ｈｏｕｒｓａｆｌｅｒｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ａｓ
ｎｕｍｂｅｒｏｆｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄａｌｏｔｏｆｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄａｔ２４ａｎｄ４８ｈｏｕｒｓ，ｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｌｙ．３．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｔｈｅｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：Ａｆｔｅｒｉｓｃｈｅｒｅｐｅｒｆａｓｉｏｎ，ｔｈｅｇａｎｇｌｉｏｎｃｅｌｌｓｏｆｒｅｔｉｎａｓｈｏｗｔｈａｔ
ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｆｉｏｎｗａｓｖａｃｕｏｃａｔｅｄａｎｄｍｅｍｂｒａｎｏｕｓｄｉｓｃｏｆｏｕｔｅｒｓｅｇｍｅｎｔｗａｓ
ｄａｍａｇｅｄ．Ｔｈｅｌｏｎｇｅｒｈａｄｉｓｃｈｅｍｉａｃｏｎｔｉｎｕｅｄ，ｔｈｅｍｏｒｅｓｅｒｉｏｕｓｗａｓｔｈｅｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ．４．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＣＡＭ一１：ＴｈｅｍｉｎｕｔｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＩＣＡＭ一１ｃｏｕｌｄｂｅｓｅｅｎｉｎｔｈｅＡａｎｄＢｇｒｏｕｐ，ＩＣＡＭ－１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｅｇａｎｔｏｉｎｃｒｅａｓｅａｆｔｅｒｒｅｔｉｎａｌｉｓｃｈｅｍｉａｆｏｒ６０ｍｉｎｕｔｅｓ，ｐｅａｋｅｄａｔ２４ｈｏｕｒｓａｆｔｅｒ
Ｉｈ西医科大学碗±学位论文
ｒｅｐｅｒｆａｓｉｏｎ，ａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｒｅａｆｔｅｒ．
Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：１ＣＡＭ一１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｒｅｔｉｎａｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｉｎｇｏｆｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓｉｎｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｏｆｒｅｔｉｎａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｄｔｏｒｅｔｉｏｎａｌｉｓｃｈｅｍｉａｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｉｓｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ，ｒｅｔｉｎａ，ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ－Ｉ（ＩＣＡＭ—１），ｒａｂｂｉｔ
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再ｌＪ舌
视网膜缺血再灌注损伤（ｉｓｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎｉｎｊｕｒｙ，ＩＲＩ）模型通常可用来研究导致视网膜微循环障碍的一系列眼病的机制及治疗，例如，糖尿病视网膜病变、青光眼、视网膜中央（分支）动静脉阻塞、缺血性视神经病变、早产儿视网膜病变等“、２‘“。一般上认为挽救视网膜缺血的措施是恢复视网膜的血液再灌注，并且也有大量的实验证明早期实现再灌注对视网膜功能的恢复是非常有益的，但是随着研究的不断深入，很多研究者观察到在经过一定时间缺血的视网膜并未出现明显的功能障碍，但是在实现再灌注后，却出现了明显的功能障碍，甚至可发生不可逆的结构和功能损伤。、“。…。缺血发生后视网膜已经发生损伤，但实现血液再灌注并未使得损伤减轻，反而加重了细胞的死亡、视网膜功能的障碍，这就是视网膜缺血一再灌注损伤“１。
本实验中缺血再灌注损伤模型采用前房灌注高眼压至缺血的方法，使眼内压维持在一个恒定值，持续时间易于控制，且避免了激光热凝视网膜血管，切断、结扎视神经阻断中央动脉等方法造成的眼内损伤大、稳定性差、难以重复等缺点，此模型以其可行性、准确性、可复性好，且对眼内组织损伤小等优点在研究视网膜缺血性疾病的机制及治疗中应用甚广“。“。
炎症反应在视网膜缺血再灌注损伤的发病机制中起着十分重要的作用”。１。视网膜缺血后，外周血液循环中的白细胞被刺激活化，从血管迁移、浸润到视网膜组织中，血一视网膜屏障的破坏直接导致了网膜的血管性水肿，而白细胞的浸润及炎症反应的发生则导致了视网膜的继发性结构损伤及功能障碍。白细胞要从血液循环中迁移到网膜组织中需要一系列有次序相继产生的粘附分子的介导““。只有通过这些粘附分子白细胞才能得以活化，才能与血管内皮细胞发生相互作用，从而完成其外渗、迁移、浸润的全过程。
白细胞外渗、迁移的过程可以分为三步：滚动、活化、紧密粘附与迁移““”、…。正常条件下，血液中的白细胞能够克服血流的切力在血管中迅速移动而不会发生贴壁现象，但在一定的病理条件下，血管内皮细胞表面的Ｐ一选择紊（Ｐ～ｓｅｌｅｃｔｉｎ）表达上调，促进白细胞疏松地贴附于血管壁上
（主要是毛细血管后微静脉），在血流动力学的影响下，白细胞沿血管壁发生滚动。而接下来由白细胞表达的Ｂ。整合素（Ｂ：一ｉｎｔｅｇｒｉｎ）及血管内皮细胞表达的细胞问粘附分子一ｌ（ＩＣＡＭ—１）则共同介导了白细胞的活化，导致了紧密粘附现象的大范围迅速发生。自细胞最终通过内度细胞的连接处游走出血管，迁移积聚到炎症区域在很大程度上有赖于整合素和Ｉｇ超家族的相互作用，其中包括ＩＣＡＭ—ｌ、ＰＥＣＡＭ一１（０）３１）等等。当白细胞游走出血管后，它通过整合素与基质蛋白相互作用，在趋化剂的诱导下向炎症部位积聚。细胞间粘附分子ＩＣＡＭ一１在缺血再灌注损伤过程中起着十分关键的作用。本课题以动物实验的方法建立视网膜缺血再灌注损伤模型，利用免疫组化方法研究ＩＣＡＭ一１在视网膜缺血再灌注过程中的促进白细胞浸润网膜组织发挥炎性损伤作用的重要作用。
１．材料和方法
１．１实验动物与试剂：
实验动物为健康无眼疾正常家兔５０只，２月龄，雌雄不限，体重在２—２．５千克，由山西医科大学实验动物中心提供。
药品与试剂：
即用型ＳＡＢＣ免疫组化染色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司
ＩＣＡＭ一１一抗：武汉博士德生物工程有限公司
ＤＡＢ显色剂：武汉博士德生物工程有限公司
１２方法
ｌ＿２．１分组：
选取健康无眼疾正常家兔５０只，采用随机数字表对家兔随机分组，分ｌＯ组，即正常对照组（Ａ组）、单纯灌注组（Ｂ组）、再灌注后０小时组、３小时组、６小时组、１２小时组、２４小时组、４８小时组、４天组、７天组，每组Ｎ＝５只家兔（眼只数ｎ＝ｉ０只）。
１．２．２缺血再灌注损伤模型的制备：
Ｂ、Ｃ两组动物称重后采用氯胺酮３０ｍｇ／ｋｇ联合氯丙嗪５ｍｇ／ｋｇ肌肉注射全身麻醉，用爱尔卡因作双眼表面麻醉。输液瓶输出管置三通管分别与血压表及７号头皮针连接，麻妥后将７号头皮针沿家兔颞侧角膜缘刺入前房。
Ｓ
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单纯灌注组只作前房穿刺，不加压，６０分钟后拔除针头，实验组则要缓慢提高生理盐水瓶高度使血压表读数升至１６ＫＰａ，根据帕斯卡定理，液体中压力的改变可等值地向各方向传递，与管径大小无关，所以此时动物眼内压与此压力相等，且因接近家兔体循环收缩压。３，能完全造成视网膜血流阻断，直接检眼镜下可见网膜苍白，血流被阻断。维持６０分钟后缓慢降低生理盐水瓶至与家兔在同一水平，使视网膜恢复血液供应，留针一分钟，拔除穿刺针，结膜囊涂红霉素眼膏，分笼饲养。期间每日双眼点氯霉素眼药水两次以防止感染。实验动物及实验使用条件符合国家科学技术委员会的《实验动物管理条例》。
１．２．３闪光视网膜电图（ｆｌａｓｈ—ｅｌｅｃｔｒｏｒｅｔｉｎｏｇｒａｐｈｙ，Ｆ—ＥＲＧ）检查：用重庆泰克医电设备公司生产的ＴＥＣ一３５０一Ｖ型视觉电生理仪检测ＥＲＧ—ｂ波的变化。在预定时间将视网膜血液再灌注后的实验动物置于兔盒内固定，将前额正中、双外眦处的毛剪净，露出皮肤，前额处置地极，双外眦处置正极，用爱尔卡因滴眼液作眼表麻醉，放置角膜电极，角膜平面距离白色刺激光３０ｃｍ，闪光强度为２．７２ｎｔ．Ｓ，适应光强度为２８．８ｎｔ，叠加３０次，刺激频率为ｉＨｚ，时值０．２秒，放大倍数为５０００，微机打印ａ、ｂ波幅、峰值及ＥＲＧ图形。分别观察各组ＥＲＧ的改变，每次每眼至少作３次，取ＥＲＧ—ｂ波平均值，应用ＳＰＳＳ统计软件对结果作单因素方差分析。１．２．４制备光镜标本：
在预定时间采用耳缘静脉空气栓塞的方法处死实验动物，立即摘取眼球，保留２—３ｍｍ的视神经，甲醛固定、去前节后待制片。用锋利的刀片以视神经为准将标本一分为二，此过程中要注意标本网膜组织的完整性及其与葡萄膜和巩膜的正常位置关系。一半眼球组织梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸腊包埋，作连续５ｕｍ厚切片，行ＨＥ染色，封片，光镜（ＯｌｙｍｐｕｓＶＡＮＵＸ—Ｔ）下观察各组网膜组织学改变并进行拍片记录。另一半眼球组织留作免疫组化染色。
１．２．５制备电镜标本：
选取正常组、再灌注３小时组及７天组家兔眼球制作电镜标本，观察网膜超微结构改变。采用耳缘静脉空气栓塞的方法处死实验动物，立即经
¨西医科太学硕士学位论文
扁平部将适量的２％戊二醛液注入玻璃体腔，迅速摘取眼球，保留２ｍｍ的视神经，置于２％戊二醛固定液中固定ｌ小时，去除前节继续固定ｌ小时，然后放入缓冲液（２％二甲胂酸钠）中，环氧树酯包埋、切片，透射电镜（日本，电子公司ＪＥＭ一１００ＣＸ）观察拍片。一１．２．６ＩＣＡＭ一１免疫组化染色（ＳＡＢＣ法）：
家兔眼球半径较大，直接进行包埋后切片容易造成染色过程中网膜组织大量脱片，故本实验在标本常规脱水、透明、浸腊过程完成后，用锋利的刀片经视乳头作两条放射状切口，将标本等分为三份，并用红汞在距离乳头１．５∞处作标记，常规石腊包埋组织。修整腊块，自红汞标记处开始作连续３ｐｍ切片，捞片于多聚赖氨酸挂片的防脱玻片上，６０。Ｃ恒温箱过夜，使标本与玻片紧密粘附后即可进行染色。具体步骤如下：
１）切片常规脱腊至水；
２）３％Ｈ。０：ｌ份＋无水甲醇４份混合，室温下５－１０分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗３次；
３）热修复抗原：将切片浸入０．０１Ｍ的枸橼酸盐缓冲液（ＰＨ＝６．０），微波炉加热至沸腾后断电，间隔５一１０分钟后，反复卜２两次，冷却后ＰＢＳ（ＰＨ＝７．２—７．６）洗涤卜２次；
４）抗原修复液Ｉ进一步暴露抗原，滴加在切片上５分钟后ＰＢＳ（ＰＨ＝７．２—７，６）洗涤２—３次；
５）滴加５％ＢＳＡ封闭液，室温下２０分钟，甩去多余液体，不洗；
６）滴加１：１００稀释的ＩｃＡＭ一１一抗，４。ｃ冰箱过夜后，ＰＢＳ（ＰＨ＝７．２—７．６）洗２分钟×３次；
７）滴加生物素化ＩｇＧ，３７。Ｃ温箱２０分钟，ＰＢＳ（ＰＨ＝７．２－７．６）洗２分钟×３次；
８）滴加试剂ＳＡＢＣ，３７。Ｃ温箱２０分钟，ＰＢＳ（ｐＨ＝７．２—７．６）洗５分钟×４次；
９）ＤＡＢ显色：使用ＤＡＢ显色试剂盒（ＡＲｌ０２２）。取ｌｍｌ蒸馏水，加试剂盒中Ａ、Ｂ、ｃ试剂各一滴，混匀后加至切片，室温下约１分钟终止显色，蒸馏水洗涤；
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１０）稀释苏木素轻度复染。脱水、透明、封片，光镜（ＯｌｙｍｐｕｓＶＡＮＵＸ—Ｔ）下观察并拍片记录。
１１）数据分析：每个眼球取ＩＣＡＭ一１免疫组化染色切片一张应用Ｍｉａｓ一２０００图像分析系统（四ＪＩＩ）ｌｌ大智胜软件股份有限公司）测定视网膜血管内皮细胞ＩＣＡＭ一１免疫反应强度，即灰度，所得数据应用ＳＰＳＳ软件作单因素方差分析。
图１．实验方法具体流程
２结果
２．１Ｆ－ＥＲＧ检查（图２）
２．１．１正常对照组（Ａ组）与单纯灌注组（Ｂ组）ＥＲＧ的ｂ波振幅Ａ组ｂ波振幅为２０５２５＋１２２０“ｖ，Ｂ组ｂ波振幅为２００７２＋１２２２ｕＶ，两组ｂ波振幅差别无统计学意义（Ｐ＞Ｏ．０５）。
８
心肌缺血再灌注
大鼠心肌缺血/再灌注损伤 【实验目的】 1.复制大鼠在体与离体心肌缺血/再灌注损伤模型； 2.观察缺血/再灌注过程中心功能的变化 【实验动物】成年Wistar 大鼠（体重200－300g） 【仪器药品】 电子天平，肾形盘，动物呼吸机，BL-420F记录装置，眼科开睑器，微血管钳，组织镊，眼科镊，组织剪，眼科剪，眼科止血钳，止血钳，动脉夹，眼科缝合针，1号及00缝合线。Langedroff灌流装置。 20%乌拉坦，1ml注射器，5ml 注射器，纱布块 实验1 在体模型 【实验步骤】 1.实验采用体重200-300ｇ健康雄性Wistar大鼠，20%乌拉坦腹腔注射麻醉（0.5ml/100g）； 2.颈胸部备皮及手术，分离气管及右侧颈总动脉 3.气管插管连接呼吸机（呼吸肌参数：潮气量9ml，呼吸比=3:2，呼吸频率55~60） 4.经右侧颈总动脉逆行插管至左心室, 再经BL-420F软件输入计算机,（一通道描记心 电，（右上黄、右下黑、左下红）二通道描记心室内压，三通道描记微分）持续监测心脏左心室内压力及心电的变化情况 5. 沿胸骨左侧剪开2，3肋骨，开睑器开胸暴露心脏；寻找冠状动脉左前降支，穿线备 用; 6.采用结扎5min后再放开5min两次,造成缺血预处置；采用结扎30mim再放开30min 复制缺血/再灌注模型； 思考题： 1.如何判定缺血模型复制成功 2.如何判定有再灌注损伤发生
实验2 离体模型 【实验步骤】 (1) 大鼠称重，腹腔注射20%乌拉坦（0.5ml/100g）麻醉，仰卧固定于鼠板，上腹部及前胸部剪毛。 (2) 舌下/阴茎背静脉注入1%肝素（0.05ml/100g）后，切开胸腹部皮肤，用剪刀横行剪开腹腔，向上剪断隔膜，沿两侧肋骨向上平行剪开，翻起前胸壁，把心脏及胸膈周围的结缔组织拨到一侧，充分暴露心脏。 (3) 用镊子提起心脏根部，暴露出主动脉和肺动脉，在距主动脉起始部0.5cm处用手术剪切断血管，迅速取出心脏至于4℃生理盐水平皿中使之停搏。 (4) 经主动脉将心脏悬挂在灌流装置上，用丝线结扎固定，打开灌流液行逆向灌流，待心脏恢复自主跳动，小心减去心脏周围附着组织。 (5)用眼科剪剪去左心耳，通过左心耳经房室瓣插入左心室一乳胶球囊，球囊连接一个内充生理盐水的导管，导管经三通管和换能器与BL-420F连接。 (6) 在BL-420F仪的监测下，通过向球囊内注入一定量的生理盐水是左心室的舒张末压调整在0~10mmHg之间。 (7)连接心电导线，心尖、右心耳和地线，一通道设置记录， (8) 预灌流10~20分钟，观察心率，二通道记录心室内压、三通道取微分记录±dp/dtmax 等心动指标，同时描记ECG，待上述各指标平衡后开始以下实验。 心肌缺血-再灌注损伤 (1) 心脏用正常灌流液预灌流15分钟后完全停灌40分钟，然后恢复灌流20分钟，观察心脏在正常，停灌初期和再灌期的心功能变化。 (2) 分别收集正常灌流时，再灌流后3分钟时的心脏冠脉流出液1ml，测定其中乳酸脱氢酶的活性。 思考题： 1.如何判定缺血模型复制成功 2.如何判定有再灌注损伤发生
不同温度对小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤的影响
不同温度对小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤的 影响 作者：张晓丽夏世金严震文肖婧张振兴叶志斌 【摘要】目的探讨不同温度对小鼠肾脏急性缺血再灌注损伤（IRI）的影响及其机制。方法雄性C57BL/6N小鼠随机分为假手术组（sham组）、轻度低温IRI组（LTI）、常温IRI组（NTI）和高温IRI 组（HTI）。采用夹闭双侧肾蒂35 min再灌注48 h制成IRI模型。观察IRI小鼠肾脏组织病理学改变，检测肾功能、肾组织丙二醛（MDA）含量和肾小管上皮细胞凋亡数目。结果与Sham组相比，常温IRI组小鼠发生中等程度肾损伤，其Scr升高〔（237.0±41.2）μmol/L〕，肾组织形态学改变，肾组织中MDA含量升高〔（1.54±0.37）μmol·L-1·mg-1〕，肾小管上皮细胞凋亡数目增加。高温明显加重小鼠的IRI损伤（P＜0.05），轻度低温对小鼠IRI具有保护作用。结论缺血阶段体温的高低明显影响小鼠肾IRI的程度，轻度低温可能通过抑制脂质过氧化反应和细胞凋亡对小鼠发挥保护作用；高温则可能通过促进脂质过氧化反应和细胞凋亡加重肾IRI。 【关键词】高温；肾脏；缺血再灌注；凋亡 肾脏是一高灌注器官，对缺血再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury，IRI）异常敏感，故IRI成为急性
肾损伤的重要损伤环节〔1〕，也是影响肾移植中移植肾早期功能恢复及长期存活的主要因素〔2〕。鉴于肾IRI病理生理学机制复杂〔3〕，涉及此方面的研究一直走在移植学研究的前沿。肾IRI动物模型为急性缺血性肾损伤的发生机制和防治策略研究奠定了基础。制作肾IRI 动物模型的方法包括双侧肾蒂夹闭、双侧肾动脉夹闭、单侧肾切除+对侧肾动脉夹闭等。手术方法不同、血管夹闭的时间长短、手术操作过程中温度的控制均对实验结果有着重要影响，尤其是术中温度在此过程中起着不可忽视的作用。本文通过调控肾缺血过程中小鼠体温，观察不同温度对小鼠肾IRI的影响，以期为临床上辅助治疗IRI的新途径提供实验依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物与分组 雄性C57BL/6N小鼠24只，22～26 g（SPF级，中科院上海实验动物中心），随机分假手术（Sham）组、轻度低温IRI组（LTI）、常温IRI组（NTI）和高温IRI组（HTI），每组6只。 1.2 模型制作 2%戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉小鼠，取腹正中切
兔急性肠道缺血再灌注损伤模型的建立
兔急性肠道缺血再灌注损伤模型的建立 【摘要】目的建立小肠急性缺血再灌注损伤模型，确定合适的肠系膜上动脉阻断时间。方法将70只新西兰兔按不同的肠系膜缺血时间（0、15、30、45、60 min）分为A、B、C、D、E共5组，每组14只。每组取8只于恢复血供2 h后留取兔下腔静脉血标本及肠组织，检测血清中丙二醛（MDA）含量的变化，光镜下观察小肠组织形态学变化并对小肠黏膜损伤程度进行评分。另6只兔用于术后24、48、72 h 生存率的观察。结果 A、B、C组的术后生存率均>83.3%。C、D、E 组的MDA含量及肠黏膜损伤评分与A组比较，差异均有显著性（F=12.13、280.24,P<0.01）。结论肠系膜缺血30 min再灌注2 h 是建立兔小肠急性缺血再灌注损伤的合适时间。 【关键词】肠；缺血；再灌注损伤；模型,动物 ［ABSTRACT］Objective To create a model of acute intestinal ischemia reperfusion injury in rabbits so as to determine suitable blocking duration of superior mesenteric arteries (SMA). Methods Seventy rabbits were divided into five groups as groups A, B, C, D, and E, based on the different blocking durations of SMA for 0, 15, 30, 45 and 60 minutes, respectively, with 14 rabbits in each group. Eight of the rabbits in each group were detected for serum levels of MDA 2 h after recovery of blood supply, the changes of histomorphology of small intestine observed light microscopically. The other six
脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展
脑缺血再灌注损伤机制及治疗进展 西安交通大学医学院第二附属医院麻醉科710004 薛荣亮 脑缺血一定时间恢复血液供应后，其功能不但未能恢复，却出现了更加严重的脑机能障碍，称之为脑缺血再灌注损伤（cerebral ischemia reperfusion injury,CIR）。 脑缺血再灌注损伤与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、白细胞高度聚集和高能磷酸化合物的缺乏等有关。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主，目前认识的比较清楚，即脑缺血后5-7分钟内，细胞能量耗竭，K+通道受阻，膜电位降低，神经末梢释放谷氨酸，通过兴奋谷氨酸受体（包括NMDA 、AMPA和KA 受体）致使细胞膜上的Ca2+通道开放，引起Ca2+超载，高Ca2+可激活NOS，使NO和氧自由基的形成增加，引发脂质过氧化，引起膜结构和DNA的损伤；Ca2+还可活化各种酶类，加剧细胞损伤和能量障碍，引发缺血级联反应，结果细胞水肿、细胞膜破裂，细胞内酶和炎性介质释放，引起细胞坏死。 近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡(DND)，DND常出现在缺血再灌注后2-4日，主要发生在海马、纹状体及皮质区域，DND需要数日时间、有新蛋白质合成的、需要消耗能量的、为无水肿的细胞自杀过程，称之为细胞凋亡(PCD)。脑缺血再灌注损伤既包括急性细胞坏死也包括细胞凋亡，对于DND的确切机制目前仍不清楚，尚需进一步深入研究。 现对脑缺血再灌注损伤机制的研究进展及保护措施简述如下：1．基因活化 脑缺血再灌注损伤后可出现大量基因表达，大约有374种基因出现
变化，绝大多数基因与凋亡有关，其中57种基因的蛋白表达是缺血前的 1.7倍，而34种基因的表达量出现下降，均发生在4小时到72小时, 包括蛋白质合成，基因突变，促凋亡基因，抑凋亡基因和损伤反应基因变化等，这些基因的相互作用最终决定了DND的发生。 2．兴奋性氨基酸毒性 兴奋性氨基酸毒性是指EAA受体活化而引起的神经元死亡，是脑缺血性损伤的重要触发物和介导物。EAA可活化胞内信号转导通路，触发缺血后致炎基因表达。CA1区神经细胞分布着大量的EAA受体，而抑制性氨基酸受体分布很小，这就为缺血后的兴奋性毒性提供了基础。另外，CA1区较CA3区对缺血损伤敏感是由于其兴奋性氨基酸受体的类型不同，CA1区以NMDA受体为主，CA3区以KA受体为主，而KA 受体对缺血敏感性较差，可能是造成DND发生的重要原因。 3．自由基及脂质过氧化 脑缺血再灌注期间产生大量自由基。其有害作用可概括为：①作用于多价不饱和脂肪酸，发生脂质过氧化。②诱导DNA、RNA、多糖和氨基酸等大分子物质交联，交联后的大分子则失去原来的活性或功能降低。③促使多糖分子聚合和降解。自由基可广泛攻击富含不饱和脂肪酸的神经膜与血管，引发脂质过氧化瀑布效应(oxygen burst)，蛋白质变性，多核苷酸链断裂，碱基重新修饰，细胞结构的完整性破坏，膜的通透性、离子转运、膜屏障功能均受到严重影响，从而导致细胞死亡。自由基还能导致EAA释放增加，促使脑缺血后DND发生。 4．热休克蛋白表达紊乱 热休克蛋白是在多种应激原的作用下生成的分子量为7-200KD的
小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型
小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型 缺血再灌注损伤(IRI)是器官移植、休克、动脉搭桥术后等普遍存在的问题。肾脏是发生IRI极为常见的器官之一，尤其肾移植，不可避免的要经历一定程度的IRI,肾脏缺血再灌损伤是急性肾衰的常见原因。对麻醉动物的肾动脉进行阻断和再通后，可引起肾脏缺血再灌注损伤。在缺血再灌注过程中，钙超载、线粒体能量合成障碍、氧自由基的增多等因素导致肾小管内皮细胞脱落，肾脏组织结构的破坏进而使肾脏功能发生障碍。 1.实验动物 SPF级Balb/C小鼠，雄性，周龄为4w~6w，体重为20g~22g。 2.实验分组： 实验分组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组，每组15只动物。 3.模型周期 24h、72h 4.建模方法 1. 选取20-22g左右小鼠，术前禁食12h，自由饮水。 2. 3％戊巴比妥钠(80mg／kg)腹腔注射麻醉,小鼠背部去毛，消毒备皮。 3. 在背部脊椎旁0.5cm、肋骨下缘0.5cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏,小心分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。 4. 缺血45min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。 5. 分两层缝合开口,待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录。 6. 对照组不做缺血处理，其他操作相同。 7. 分别取再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h六个时间点取材。麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时取左肾组织留作病理标本，右肾组织分生标本。 5.模型的评价 1 血清生化指标检测： 取各时间点（0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h)血清，检测血清BUN（尿素氮）和Scr（血肌酐）水平,评估肾功能。
第二十三讲缺血再灌注损伤概论修订版
第二十三讲缺血再灌注 损伤概论 Document number：PBGCG-0857-BTDO-0089-PTT1998
第二十三章缺血－再灌注损伤 一、基本要求 1. 掌握自由基、活性氧、缺血－再灌注损伤、氧反常、钙反常、pH反常、钙超载、无复流现象和呼吸爆发的概念, 重点掌握缺血－再灌注损伤的发生机制。 2. 熟悉缺血－再灌注损伤的原因和条件, 熟悉缺血－再灌注损伤时机体的功能和代谢变化。 3. 了解防治缺血－再灌注损伤的病理生理基础。 二、知识点纲要 （一）缺血－再灌注损伤的概念 各种原因造成组织血液灌流量减少，可使细胞发生缺血性损伤。再灌注具有两重性，多数情况使缺血组织和器官的功能结构得以修复，患者病情得到控制。但是，部分患者或动物缺血后再灌注，不仅没使组织器官功能恢复，反而使缺血所致功能代谢障碍和结构破坏进一步加重，这种现象称为缺血－再灌注损伤。与之密切相关的概念，还有氧反常、钙反常和pH反常。缺血－再灌注损伤在不同种属和各种组织器官均可发生，具有普遍性。 ( 二 ) 缺血－再灌注损伤的原因和条件 再灌注损伤取决于缺血时间、侧支循环、需氧程度以及电解质浓度。 ( 三 ) 缺血－再灌注损伤的发生机制 1. 自由基的作用 (1) 自由基的概念、特性、类型、体内代谢和生物学意义 (熟悉和了解) (2) 缺血－再灌注时氧自由基生成增多的机制 (掌握) 1) 黄嘌呤氧化酶形成增多； 2) 中性粒细胞的呼吸爆发；3) 线粒体损伤，氧分子单电子还原增多；4) 儿茶酚胺增加，自氧化增强。 (2) 自由基的损伤作用(掌握) 1) 生物膜脂质过氧化增强导致①膜结构破坏──膜的液态性和流动性减弱，通透性增强；②抑制膜蛋白功能──离子泵失灵和细胞内信号传递障碍；③线粒体功能受损──ATP 生成减少。 2) 细胞内Ca2+超载源于自由基引起细胞膜通透性增强，膜上Na+-K+-ATP酶失活和线粒体功能障碍。 3) DNA 断裂和染色体畸变外面无组蛋白保护的线粒体DNA对氧化应激敏感。 4) 蛋白质变性和酶活性降低自由基可引起蛋白质分子肽链断裂，使酶的巯基氧化。 5) 诱导炎症介质产生自由基可导致脂质过氧化和胞内游离钙增加，激活磷脂酶，脂加氧酶及环加氧酶。 2. 钙超载 (1) .细胞内钙稳态调节 (熟悉和了解) (2) 再灌注时细胞内钙超载的机制 (掌握) 1) Na+－Ca2+交换异常；2) 细胞膜通透性增高；3) 线粒体功能障碍；4) 儿茶酚胺增多。 (3) 钙超载引起再灌注损伤的机制 (掌握)
肾脏缺血再灌注损伤机制及其影响因素的研究进展
Journal of Physiology Studies 生理学研究, 2016, 4(3), 19-29 Published Online August 2016 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/703838518.html,/journal/jps https://www.wendangku.net/doc/703838518.html,/10.12677/jps.2016.43003 文章引用: 王翔宇, 马云波. 肾脏缺血再灌注损伤机制及其影响因素的研究进展[J]. 生理学研究, 2016, 4(3): 19-29. The Research Progress of Kidney Ischemia-Reperfusion Injury on Mechanism and Its Influencing Factors Xiangyu Wang, Yunbo Ma Department of Urology, Liaocheng People’s Hospital, Liaocheng Shandong Received: Nov. 14th , 2016; accepted: Dec. 24th , 2016; published: Dec. 27th , 2016 Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.wendangku.net/doc/703838518.html,/licenses/by/4.0/ Abstract Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when the blood flow to the particular organ is ob-structed, followed by the restoration of blood to the ischemic organ. In the kidney, IRI contributes to pathological conditions called acute kidney injury (AKI) that is a clinical syndrome with rapid kidney dysfunction and high mortality rates. Although the pathophysiology of IRI is very compli-cated and is not completely understood, several important mechanisms resulting in kidney failure have been mentioned. IRI usually is associated with an inflammatory reaction, oxidative stress, intracellular Ca 2+ overload, renin-angiotensin activation and microcirculation disturbance. Better understanding of the cellular pathophysiological mechanisms underlying kidney injury will hope- fully result in the design of more targeted therapies to prevent and treat the injury. In this review, we summarize some important potential mechanisms and therapeutic approaches in renal IRI. Keywords Ischemia-Reperfusion Injury, Kidney Injury, Free Radical, Ca 2+ Overload, Inflammation 肾脏缺血再灌注损伤机制及其影响因素的研究进展 王翔宇，马云波 Open Access
肠缺血再灌注损伤的防治研究进展
第20卷 第4期2005年8月 内蒙古民族大学学报(自然科学版) Journal of Inner Mongolia University for Nationalities Vol.20 No.4 Aug.2005肠缺血再灌注损伤的防治研究进展Ξ 马玉山,罗 力 (内蒙古医学院第一附属医院普外科,内蒙古呼和浩特 010050) 摘 要:本文概述了肠缺血再灌注损伤的可能机理及其预防和治疗措施. 关键词:缺血再灌注损伤;肠 中图分类号:R656.7R364.1 文献标识码:A 文章编号:1671-0185(2005)04-0452-04 The Progress of Prevention and Therapy in Ischemia R eperf usion Injury of Intestine MA Yu-shan,L UO Li (G eneral Surgery Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical College,Hohhot010050,China) Abstract:This review was performed to summarize the possible mechanism and therapy in is2 chemia reperfusion injury of intestine. K ey w ords:Ischemia reperfusion injury;Intestine 肠缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,简称I/R)是外科实践中常见的组织器官损伤之一,在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全以及小肠移植的病理演变过程中起重要作用.近年来许多研究表明肠缺血再灌注损伤不仅可以引起消化道局部的组织损害,而且可以导致肠内细菌毒素移位到体循环,引起网状内皮系统发生系列反应,进而导致大量相关介质和细胞因子的释放,甚至发生多系统器官功能不全综合征,因此近年来越来越受到重视,其发生发展机理及防治措施的研究也成为外科领域的重点和难点课题之一. 肠缺血再灌注损伤的病理生理机制尚不清楚,人们先后提出过能量衰竭、氧自由基损伤、钙超载、白细胞黏附与内皮细胞损伤、介质病、细胞因子和细胞凋亡等一系列学说,并针对肠缺血再灌注损伤的可能机制,进行了相应的防治实验研究,并取得了一些进展. 1 抗能量缺乏疗法 组织缺血时,组织细胞内氧的供应减少或中断、细胞的有氧代谢受到抑制、A TP合成急剧下降,加之无氧代谢产生的有毒酸性产物大量累积,导致细胞内酶活性的改变以及维持跨膜离子梯度的能量缺乏,在严重缺血时可使细胞内环境紊乱,甚至细胞死亡,因此在缺血期为缺血组织提供足够的A TP可以阻止无氧代谢及细胞膜内外离子的平衡.史晓峰等〔1〕在大鼠小肠缺血再灌注损伤的实验研究中发现,经肠系膜上动脉间断灌注1、6-二磷酸果糖,可以改善细胞的能量代谢,为细胞提供能量,同时具有稳定细胞生物膜、减少脂质过氧化物和氧自由基生成而起到对肠缺血再灌注损伤的保护作用.除此之外,在缺氧期吸入氧气,也可以明显改善肠缺血再灌注后的组织损害.高压氧能够抑制肠缺血再灌注损伤过程中TNF-α的产生,并能抑制中性粒细胞在肺中的聚集,因而能够减轻肠缺血再灌注的损伤〔2〕.O’Donnel等〔3〕则发现在缺血时的肠腔内持续注入携氧的过氟碳的保护作用,他们在肠缺血再灌注的模型中观察到:在缺血60分 Ξ收稿日期:2004-12-16 作者简介:马玉山(1973-),男,内蒙古通辽市人,内蒙古医学院在读硕士研究生(2003级).
缺血-再灌注损伤的发生机制
一、自由基的作用（一）自由基的概念与类型自由基（freeradical）的化学性质极为活泼，易于失去电子（氧化）或获得电子（还原），特别是其氧化作用强，故具有强烈的引发脂质过氧化的作用。生理情况下，细胞内存在的抗氧化物质可以及时清除自由基，使自由基的生成与降解处于动态平衡；对机体并无有害影响。病理情况下，由于活性氧生成过多或机体抗氧化能力不足，则可引发链式脂质过氧化反应损伤细胞膜，进而使细胞死亡。其种类很多，主要包括： 1.氧自由基 2.脂性自由基 3.其它（二）氧自由基生成增多的机制 1.黄嘌呤氧化酶的形成增多黄嘌呤氧化酶（xanthineoxidase，XO）及其前身黄嘌呤脱氢酶（xanthinedehydrogenase，XD）主要存在于毛细血管内皮细胞内。正常情况下，90％以XD的形式存在，XO仅占10％。1）当组织缺血缺氧时，由于ATP含量降低，离子转运功能障碍，Ca2+进入细胞激活Ca2+依赖性蛋白酶，促使XD大量转变为XO. 2）由于ATP 分解，ADP、AMP含量升高，并依次分解生成次黄嘌呤，故缺血组织中次黄嘌呤大量堆积。再灌注时，大量分子氧随血液进入缺血组织，XO在催化次黄嘌呤转变为黄嘌呤并进而催化黄嘌呤转变为尿酸的两步反应中，释放出大量电子，为分子氧接受后产生O-2和H2O2.H2O2在金属离子参与下形成更为活跃的OH.，使组织O-2、OH.、H2O2等活性氧大量增加。 2.中性粒细胞中性粒细胞在吞噬活动时耗氧量增加，其摄人O2的70％-90％在NADPH氧化酶和NADH 氧化酶的催化下，接受电子形成氧自由基，用于杀灭病原微生物。组织缺血可激活补体系统，或经细胞膜分解产生多种具有趋化活性的物质，如C3片段、白三烯等，吸引、激活中性粒细胞。再灌注期组织重新获得O2供应，激活的中性粒细胞耗氧量显著增加，产生大量氧自由基，称为呼吸爆发（respiratoryburst）或氧爆发（oxygenburst），造成细胞损伤。（三）自由基的损伤作用自由基发生剂可使正常及缺血组织细胞受到严重损伤，自由基清除剂则可有效减轻缺血-再灌注损伤。自由基具有极为活泼的反应性，自由基一旦生成，即可经其中间代谢产物不断扩展生成新的自由基，形成连锁反应。自由基可与各种细胞成分，如膜磷脂、蛋白质、核酸等发生反应，造成细胞结构损伤和功能代谢障碍。 1.膜脂质过氧化（1ipidperoxidation）增强：自由基对磷脂膜的损伤作用主要表现在其可与膜内多价不饱和脂肪酸作用使之发生过氧化，造成多种损害：①破坏膜的正常结构。脂质过氧化使膜不饱和脂肪酸减少，不饱和脂肪酸/蛋白质的比例失调，膜的液态性、流动性降低，通透性增加，细胞外内流增加；②间接抑制膜蛋白功能。③促进自由基及其它生物活性物质生成。形成多种生物活性物质，如前列腺素、血栓素、白三烯等，促进再灌注损伤；④减少ATP生成。线粒体膜脂质过氧化，导致线粒体功能抑制，ATP生成减少，细胞能量代谢障碍加重。 2.蛋白质功能抑制自由基可使酶的巯基氧化，形成二硫键；也可使氨基酸残基氧化，胞浆及膜蛋白和某些酶交联形成二聚体或更大的聚合物，直接损伤蛋白质的功能 3.破坏核酸及染色体自由基可使碱基羟化或DNA断裂，从而引起染色体畸变或细胞死亡。
肾缺血再灌注损伤大鼠模型具体步骤及说明
肾缺血再灌注损伤大鼠模型具体步骤及说明 ?原型物种人 ?来源缺血再灌注，双侧肾动脉夹闭法 ?模式动物品系SD大鼠，SPF级，雄性，体重220g~250g ?实验分组随机分组：对照组，模型组，阳性药物组，受试药物组，15只每组 ?实验周期24h or 72h ?建模方法1. 选取250g左右大鼠，术前禁食12h，自由饮水。 2. 15％水合氯醛(350mg／kg)腹腔注射麻醉,大鼠背部去毛，消毒备 皮。 3. 在背部脊椎旁1cm、肋骨下缘1cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏, 小心分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。 4. 缺血60min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。 5. 分两层缝合开口，待大鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲 养，定期观察大鼠状态及死亡情况并做好记录。 6. 对照组不做缺血处理，其他操作相同。 7. 分别取再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h六个时间点取材。麻 醉大鼠，下腔静脉取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时取左肾组织留作病理标本，右肾组织分生标本。 ?应用疾病模型
1. 血清生化指标检测： 取各时间点（0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h)血清，检测血清BUN（尿素氮）和Scr（血肌酐）水平,评估肾功能。 2. 肾系数检测 摘取双侧肾脏后，生理盐水冲洗，称重计算肾系数。 肾系数=双侧肾重（mg）/体重（g） 3. 肾小管坏死的评分 每张切片×200 倍镜下取外髓质部10 个视野，按0 = 正常，1 = 轻微损伤(受损肾小管< 5%) ，2= 轻度损伤(受损肾小管5 %～25 %) ，3 = 中度损伤(受损肾小管25 %～75 %) ，4 = 重度损伤(受损肾小管> 75 %) 作半定量分析并计算其均值，作为肾小管坏死的评分指数 4％多聚甲醛溶液固定48h。常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋。石蜡切片进行HE染色和PAS染色。 对照组大鼠肾小球、肾小管及肾间质结构基本正常。在模型组，随着再灌注时间的延长呈现不同程度的肾脏病理改变，可见肾小管上皮细胞浑浊肿胀，出现水样或空泡变性，刷状缘消失，部分肾小管上皮细胞凝固性坏死、脱落，腔内可见管型，并可见间质水肿，间质内灶性炎症细胞浸润，肾小球病变不明显。
肝脏缺血再灌注的损伤机制及和防治
肝脏缺血再灌注的损伤机制及和防治 摘要：缺血再灌注损伤是Jennings第一次提出的，是指组织或器官在缺血后紧接着得到血液供应，但是这时血液的供应不利于缺血的组织、器官的功能的恢复，甚至加重了代谢的障碍、结构的破坏。本文的肝脏缺血再灌注损伤是肝脏术后肝功能异常、原发性肝移植无功能、肝衰竭的重要原因之一【1】。肝脏缺血再灌注损伤的后果往往取决于缺血时间的长短、肝脏储备功能的强弱等【2】。目前。肝脏缺血再灌注损伤是肝脏外科的研究热点，普遍认为其病理机制是多种机制共同作用的结果，防治主要是缺血预处理、药物预处理和缺血后处理。 1.肝脏缺血再灌注损伤的机制 肝脏缺血再灌注损伤的发生可能有部分原因是由于肝脏缺血过程中的损伤，另一部分原因是当缺血的肝脏得到血流再灌注时产生一系列损伤。研究指出，缺血再灌注使得肝细胞和kuffer细胞、中性粒细胞、肝窦状隙内皮细胞、贮脂细胞等细胞之间发生相互作用【3】。另外，血小板、补体也有参与。活化的细胞释放大量的促炎因子、脂质炎性因子，导致炎性介质反应和细胞的凋亡。损伤会使得肝窦状隙内皮细胞被破坏，肝脏微循环障碍，进而加重肝脏微循环的缺血且导致肝细胞再生受阻【4】。 2.肝脏缺血再灌注损伤与氧自由基 研究指出，氧自由基在肝脏缺血再灌注损伤的时候发挥了较为重要的作用，主要来源于kuffer细胞、中性粒细胞和黄嘌呤氧化酶，主要包括超氧化物自由基、氢氧根离子、过氧化氢等。氧自由基造成肝细胞损伤的机制主要是：通过对细胞膜磷脂双分子结构中脂质的氧化，改变细胞膜通透性及流动性，从而直接损伤肝细胞；同时氧自由基损伤肝脏血管内皮细胞，特别是肝窦状隙内皮细胞，引起血液中血小板以及粒细胞等在微血管中聚集，阻碍肝脏微循环，氧自由基还可抑制线粒体氧化磷酸化，使肝细胞供能减少。 3.肝脏缺血与细胞内钙超载
机能实验 肾缺血再灌注
影响尿生成的因素和肾缺血再灌注损伤 （南方医科大学广州 510515） 【摘要】目的探究影响肾泌尿功能的因素，探究肾缺血后再灌注对肾的损伤现象。方法静脉分别补充37℃的生理盐水和20%的高渗葡萄糖，观测平均动脉压，尿量；结扎左肾动脉，一段时间后松开动脉夹再灌注，观测平均动脉压，尿量，血肌酐和尿肌酐含量，计算内生肌酐清除率(Ccr)。结果补充37℃的生理盐水和20%的高渗葡萄糖尿生成量增加，缺血再灌注后血肌酐浓度增高，尿肌酐浓度降低,内生肌酐清除率(Ccr)明显降低。结论增加血容量，肾滤过血液增多，尿生成增加；注射高渗溶液增加肾小管内原尿浓度，尿生成量增加；缺血再灌注后肾排泄能力降低，肾的功能受损。 【关键词】尿生成；肾缺血再灌注损伤；尿肌酐；内生肌酐清除率 肾是机体主要的排泄器官之一，探究影响肾泌尿功能的因素有助于利尿药等干预肾脏功能药物的研发；肾缺血再灌注(Ischemic reperfusion，I／R)损伤是临床上常见的病理过程，在肾脏手术、肾移植和体外震波碎石等过程中，均可发生不同程度的再灌注损伤，它是急性肾衰最常见的原因，因此探究肾的缺血再灌注这一病理现象具有重要意义。肾缺血再灌注时，内生肌酐清除率（Ccr）明显降低，肾功能受损.本实验通过复制肾脏缺血再灌注损伤的模型，对肾脏缺血再灌注损伤后血肌酐和尿肌酐的含量，以及内生肌酐清除率（Ccr）进行测定，来探究肾脏的缺血再灌注损伤。 1 材料与方法 1.1 实验材料 动物：家兔 器材：医用计算机记录系统，家兔手术台，哺乳动物手术器械，压力换能器，动脉静脉插管，三通管，注射器，兔绳，分光光度计，恒温水浴箱。 药品与试剂：20%乌拉坦，0.2%肝素，生理盐水，20%葡萄糖溶液，速尿，肌酐测定试剂。 1.2 探究影响尿生成的因素的方法[1] 家兔称重后用20%乌拉坦耳缘静脉麻醉，麻醉后将家兔仰卧位固定在兔台上。家兔颈部剪毛，沿甲状软骨下正中剪开皮肤5cm，分离右侧颈总静脉和左侧颈总动脉。从右侧颈总静脉插入静脉导管，左侧颈总动脉插管，连接压力换能器用于记录血压。将家兔换成右侧卧位，在左肋弓下缘两指处做一斜形切口，辨认输尿管并进行输尿管插管，用有刻度的试管收集尿液并计算每分钟尿量，取此时的尿液测量尿肌酐。静脉输入30ml生理盐水，用有刻度的试管收集尿液并计算
第十章 缺血与再灌注损伤
第十章缺血与再灌注损伤 复习提要 一、概念 缺血－再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)或称再灌注损伤，是指组织缺血一段时间，当血流重新恢复后，组织的损伤程度较缺血时进一步加重、器官功能进一步恶化的综合征。 二、发生原因 凡能引起血流重新恢复而导致组织损伤的因素都有可能成为再灌注损伤的发生原因。 三、影响因素 缺血时间 侧枝循环 对氧的需求程度 电解质浓度 四、发生机制 主要与以下三个方面的因素有关： (一)自由基生成增多 1． 1. 自由基的概念及分类 自由基(free radical, FR)：指外层轨道上有未配对电子的原子、原子团或分子的总称。 氧自由基 (oxygen free radical, OFR): 包括：超氧阴离子（O· 2 ）、羟自由 基(·OH)、单线态氧（1O 2）。O· 2 是其它氧自由基产生的基础。 一氧化氮（NO） 脂性自由基: 是氧自由基与多聚不饱和脂肪酸作用后生成的中间代谢产物，如烷自由基（L.）、烷氧自由基（LO.）、烷过氧自由基（LOO.）等。 2． 2. 缺血－再灌注损伤时自由基生成增多的机制 ①通过血管内皮细胞的黄嘌呤氧化酶途径产生自由基 ②激活的白细胞经NADPH氧化酶途径产生自由基 ③线粒体细胞色素氧化酶系统单电子还原生成氧自由基增多 ④体内清除自由基能力下降 3． 3. 正常机体清除自由基的机制: ①抗氧化酶类: 超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等。
②抗氧化剂: 维生素E、维生素C、辅酶Q等。 4． 4. 自由基在缺血－再灌注损伤中的作用 ①多价不饱和脂肪酸的过氧化，损伤生物膜 ②蛋白质和DNA分子结构的变化 (二)钙超载 钙超载（calcium overload ）是指Ca2+在细胞内大量积聚。 5． 1. 细胞内Ca2+的稳态调节（homeostasis ） ①Ca2+进入胞液的途径 质膜钙通道:包括①电压依赖性Ca2+通道（VOC）②受体操纵性Ca2+ 通道（ROC）:又称配体门控钙离子通道(ligand gated calcium channel )。 胞内钙库释放通道：包括三磷酸肌醇（IP 3）操纵的钙通道(IP 3 受体通道)、 ryanodine敏感的钙通道。 ②Ca2+离开胞液的途径 Ca2+泵(又称Ca2+-Mg2+-ATP酶)的作用: Na+-Ca2+交换: Ca2+-H+交换: 6． 2. 缺血-再灌注损伤时钙超载的机制 ATP合成减少 pH反常 细胞膜通透性增加 试题 [A型题] 1.以下哪一条不是白细胞浸润引起组织损伤的机制： A.消耗大量ATP，加剧高能磷酸化合物的缺乏 B.机械嵌塞在微循环，引起无复流现象 C.增高毛细血管通透性引起组织水肿 D.释放溶酶体酶，消化组织细胞 E.通过“呼吸爆发”，产生大量氧自由基破坏组织 2.再灌注时组织内白细胞浸润增加的机制可能与以下哪一条无关：Ａ.组胺与激肽的作用 Ｂ.Ｃ3a与Ｃ5a的作用 C.LTB 4 作用 Ｄ.花生四烯酸代谢产物的作用 Ｅ.趋化性炎症介质的作用 3.心肌缺血／再灌注损伤时钙代谢障碍不表现为： A.胞浆钙超载 B.肌浆网摄钙能力下降 C.线粒体钙聚集 D.肌浆网钙聚集 E.线粒体中磷酸钙沉积
肾缺血再灌注损伤(RIRI)动物模型具体步骤及方法
肾缺血再灌注损伤(RIRI)动物模型具体步骤及方法 原型物种人 来源缺血再灌注，双侧肾动脉夹闭法 模式动物品系Balb/c小鼠，SPF级，雄性，周龄：4~6周，体重： 20g~22g 实验分组随机分组：对照组，模型组，阳性药物组，受试药物组(3个浓度梯度组)，15只每组 实验周期24h、72h 建模方法1 选取20-22g左右小鼠，术前禁食12h，自由饮水。 2 3％戊巴比妥钠(80mg/kg)腹腔注射麻醉,小鼠背部去毛，消毒备皮。 3 在背部脊椎旁0.5cm、肋骨下缘0.5cm处剪开皮肤及肌肉，可见到肾脏, 小心分离出两侧肾脏的肾动脉，迅速用动脉夹夹闭两侧肾动脉。 4 缺血45min后松开动脉夹，恢复血流，观察肾脏恢复情况。 5 分两层缝合开口,待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录。 6 对照组不做缺血处理，其他操作相同。 7 分别取再灌注0h、3h、6h、12h、24h、72h六个时间点取材。麻醉小鼠，摘眼球取血，室温静置2h后于4℃3000r离心10分钟提取血清，放入-80冰箱冻存。同时取左肾组织留作病理标本，右肾组织分生标本。 应用可用于研究肾缺血再灌注损伤在临床预防和治疗中的作用
1. 血清生化指标检测：取各时间点（0h、1h、3h、6h、12h、24h、72h)血清，检测血清BUN（尿素氮）和Scr（血肌酐）水平,评估肾功能。 2. 肾系数检测: 摘取双侧肾脏后，生理盐水冲洗，称重计算肾系数。 肾系数=双侧肾重（mg）/体重（g） 3.肾小管坏死的评分: 每张切片×200 倍镜下取外髓质部10 个视野，按 0 = 正常，1 = 轻微损伤(受损肾小管< 5%)， 2= 轻度损伤(受损肾小管5 %～25 %)， 3 = 中度损伤(受损肾小管25 %～75 %) ， 4 = 重度损伤(受损肾小管> 7 5 %) 作半定量分析并计算其均值，作为肾小管坏死的评分指数。 4％多聚甲醛溶液固定48h。常规组织脱水、透明、浸蜡、包埋。石蜡切片进行HE染色和PAS染色。 对照组小鼠肾小球、肾小管及肾间质结构基本正常。在模型组组，随着再灌注时间的延长呈现不同程度的肾脏病理改变，可见肾小管上皮细胞浑浊肿胀，
病理生理学缺血再灌注损伤试题及答案
第十章缺血－再灌注损伤 一、选择题 【A型题】 1．缺血再灌注损伤最常见于下述哪一器官? A．心肌 B．脑 C．肝 D．肾 E．肠 2．最活泼有力的氧自由基是： A．-? 2 O B．H2O2 C．OH· D．LO· E．LOO· 3．认为再灌注损伤实为缺血的继续和叠加的学说为： A．钙超载 B．自由基损伤 C．无复流现象 D．白细胞作用 E．能量代谢障碍 4．缺血-再灌注性心律失常最常见的类型： A．房性心律失常 B．室性心律失常 C．房室交界部阻滞 D．房室传导阻滞 E．房颤 5．氧反常损伤程度加重，不见于： A．缺氧的时间越长 B．缺氧时的温度越高 C．缺氧时酸中毒程度越重 D．重给氧时氧分压越高 E．再灌注时pH纠正缓慢 6．有关自由基的错误说法是： A．自由基是具有一个不配对电子的原子、原子团和分子的总称 B．-? 2 O是其他活性氧产生的基础 C．OH＾自由基的产生需有过渡金属的存在 D．体内的自由基有害无益 E．自由基的化学性质极为活泼 7．钙反常时细胞内钙超载的重要原因是： A．ATP减少使钙泵功能障碍 B．Na+-Ca2+交换增加 C．电压依赖性钙通道开放增加 D．线粒体膜流动性降低 E．无钙灌流期出现的细胞膜外板与糖被表面的分离 8．导致染色体畸变、核酸碱基改变或DNA断裂的自由基主要为： A．-? 2 O B．OH· C．H2O2 D．LO· E．LOO· 9．缺血一再灌注时细胞内氧自由基生成增加不见于： A．中性粒细胞吞噬活动增强 B．儿茶酚胺增加 C．黄嘌呤氧化酶形成减少 D．细胞内抗氧化酶类活性下降 E．线粒体受损、细胞色素氧化酶系统功能失调 10．自由基对机体的损伤最主要是通过： A．蛋白质交联 B．直接损伤核酸 C．引发葡萄糖交联 D．脂质过氧化引起损伤 E．引起染色体畸变 11．下面哪个不是活性氧? A．NO B．-? 2 O C．OH· D．CO2 E．LOO·
影响尿的生成因素和肾缺血再灌注损伤
影响尿生成的因素和肾缺血再灌注损伤 南方医科大学广州 【摘要】目的探究影响肾泌尿功能的因素，探究肾缺血后再灌注对肾的损伤现象。方法静脉分别补充37℃的生理盐水和20%的高渗葡萄糖，观测平均动脉压，尿量；结扎左肾动脉，一段时间后松开动脉夹再灌注，观测平均动脉压，尿量，血肌酐和尿肌酐含量，计算内生肌酐清除率(Ccr)。结果补充37℃的生理盐水和20%的高渗葡萄糖尿生成量增加，缺血再灌注后血肌酐浓度增高，尿肌酐浓度降低,内生肌酐清除率(Ccr)明显降低。结论增加血容量，肾滤过血液增多，尿生成增加；注射高渗溶液增加肾小管内原尿浓度，尿生成量增加；缺血再灌注后肾排泄能力降低，肾的功能受损。 【关键词】肾；尿生成；缺血再灌注损伤 肾是机体主要的排泄器官之一，探究影响肾泌尿功能的因素有助于利尿药等干预肾脏功能药物的研发；肾缺血再灌注(Ischemic reperfusion，I／R)损伤是临床上常见的病理过程，在肾脏手术、肾移植和体外震波碎石等过程中，均可发生不同程度的再灌注损伤，它是急性肾衰最常见的原因，因此探究肾的缺血再灌注这一病理现象具有重要意义。肾缺血再灌注时，内生肌酐清除率（Ccr）明显降低，肾功能受损.本实验通过复制肾脏缺血再灌注损伤的模型，对肾脏缺血再灌注损伤后血肌酐和尿肌酐的含量，以及内生肌酐清除率（Ccr）进行测定，来探究肾脏的缺血再灌注损伤。 1 材料与方法 1.1 实验材料 动物：家兔 器材：医用计算机记录系统，家兔手术台，哺乳动物手术器械，压力换能器，动脉静脉插管，三通管，注射器，兔绳，分光光度计，恒温水浴箱。 药品与试剂：20%乌拉坦，0.2%肝素，生理盐水，20%葡萄糖溶液，速尿，肌酐测定试剂。 1.2 探究影响尿生成的因素的方法 家兔称重后用20%乌拉坦耳缘静脉麻醉，麻醉后将家兔仰卧位固定在兔台上。家兔颈部剪毛，沿甲状软骨下正中剪开皮肤5cm，分离右侧颈总静脉和左侧颈总动脉。从右侧颈总静脉插入静脉导管，左侧颈总动脉插管，连接压力换能器用于记录血压，取血用于测量血肌酐。将家兔换成右侧卧位，在左肋弓下缘两指处做一斜形切口，辨认输尿管并进行输尿管插管，用有刻度的试管收集尿液并计算每分钟尿量，取此时的尿液测量尿肌酐。静脉输入