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倒置相差显微镜及荧光显微镜原理、使用与注意事项

倒置相差显微镜及荧光显微镜原理、使用与注意事项
倒置相差显微镜及荧光显微镜原理、使用与注意事项

倒置相差显微镜及荧光显微镜的使用

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1倒置相差显微镜

倒置相差显微镜,是将相差显微镜和倒置显微镜相结合的产物,倒置相差显微镜既具有倒置显微镜的倒置观察方式,同时又具有与相差显微镜相一致的成像原理。

因此,研究倒置相差显微镜的工作原理就需分别研究倒置显微镜和相差显微镜的工作原理。

1.1倒置显微镜的工作原理:

倒置显微镜组成和普通显微镜一样,主要包括三部分:机械部分、照明部分、光学部分。其中与普通显微镜有明显区别的是:物镜与照明聚光系统的相对位置。相比于普通显微镜,倒置显微镜的物镜与照明聚光系统以载物台为轴颠倒位置,物镜在载物台之下,照明系统在在载物台之上。这样的构造使得照明聚光系统与载物台的有效距离可以显著扩大,便于放置培养皿、细胞培养瓶等较厚的待观察器具,而同时物镜与材料之间的工作距离不必很大。

图1.1倒置显微镜

由于倒置显微镜观察的材料一般都是培养的细胞,透明性大,结构对比不明显,故倒置显微镜常配备相差物镜,实际上也就构成了倒置相差显微镜(图1.1)。

1.2相差显微镜的工作原理:

1.2.1光学知识

镜检时,视场中的样品只有在其透射光的波长(颜色)和振幅(亮度)与周围介质有明显变化时,才能被眼睛所分辨。照明光线通过无色透明的物体时,透射光的波长和振幅都不发生明显改变,尤其是振幅,几乎无变化。所以用普通光学显微镜观察时,难以辨清这样物体的结构,必须借助于固定和染色等理化方法,使样品和背景的透射光在波长或振幅上发生变化,即在颜色和亮度上有所

差异,以供识别。

一束光线在透过折射率n不同的透明介质后,产生的衍射光和透过的直射光的波长没有明显变化,只是衍射光的振幅稍小于直射光,这也是透明不均质物质产生些许明暗变化的原因,但这一点变化很小,并不能有效分辨。变化明显的是衍射光相对透射光在相位上有1/4λ的滞后,虽然人眼不能分辨相位的差别,但可以分辨振幅和波长的变化。相差显微镜就是利用这一点,将相位的差别转变成振幅的变化,也就是将本来均为透明但折射率不同的各个结构显现出明暗差距,从而可以被清楚地分辨。

可见光光线通过介质水或其他小分子匀质物质时,由于介质分子远小于可见光波长,故而光的衍射现象并不明显,可以说透射光是直射光。但当可将光透过细胞结构或其他粒径与入射光波长相近的物质结构时,就会产生明显的衍射现象,透射光转化为衍射光。也就是说,细胞等常见观察物的结构大小刚好可以使可将光产生衍射现象。相差显微镜就是利用这一点。光波通过小颗粒的物体后产生直射光和衍射光,衍射光的光波振幅小,相位滞后。在光学系统中,这种直射光和衍射光相遇或光的叠加,振幅发生变化,光线或明或暗,就是光的干涉现象。

1.2.2相差显微镜结构

相差显微镜不同于普通光学显微镜,在装置上有四种必不可缺的部件:相差物镜(内有相板)、具有环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿色的滤色镜。

1.2.2.1相差物镜(phase contrast objective)

相差物镜与普通物镜的主要区别在于具有相板结构(图1.2),相板(phase plate)是由光学玻璃制成的,利用光的衍射和干涉现象,将直射光和衍射光的相位差转变为振幅差。

图1.2相差物镜(示相板)

在圆形相板的平面上,有一圈与周围(里外)相板厚度不同的或凸凹的圆环(图1.3)。相板分两部分:

(1)共轭面(conjugate area):通常为环状,是通过直射光的部分。其环是凸起的,也可能是凹陷的。

(2)补偿面(complemetary area):共轭面内外两侧部分,是通过衍射光的部分。

在相板的共轭面或补偿面上,涂有改变光波相位或吸收光线的物质,通常为氟化镁。当光线通过时,使光波的相位或振幅改变,从而达到不同的目的与观察效果。

图1.3相板的种类及构造

左上:吸收直射光的明反差相板平面和剖面图;左下:吸收直射光的暗反差相板剖面图;右上:吸收衍射光的明反差相板平面和剖面图;右下:吸收衍射光的暗反差相板剖面图;黑色:吸收光线层;浅色:推迟相位层;白色:玻璃。

相板的种类比较多,对光的吸收率高低不同,所以产生不同的反差效果,从反差上大致可分下列两类(图1.4):

(1)明反差(bright contrast)或负反差(negative contrast):是指在相差显微镜的视场中,物像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于周围介质时,直射光被相板的共轭面(因为在共轭面上涂有改变相位和吸收光线的物质)推迟1/4波长,同时吸收80%~90%,振幅变小,致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射没有变化,由于直射光推迟1/4波长,两者(直射光与衍射光)有完全相同的相位,合成波P等于直射光S与衍射光D之合,即P=S+D,故振幅加大。所以被检物体比只有直射光照射的背景亮得多。

(2)暗反差(dark contrast)或正反差(positive contrast):是指在相差显微镜的视场中,背景亮度大于物像亮度的现象。与明反差相反,把通过补偿面(因为在相板的补偿面上涂有改变光波相位的物质)的衍射光推迟1/4波长,使衍射光与直射光的相位相差1/2波长,同时,直射光在共轭面(上涂吸光物质)被部分吸收(可能是为了避免背景过亮影响观察)。由于两者在像点相互干涉的结果,使合成波(P=S-D)振幅变小,被检物像的影像比背景显著变暗。

图1.4明反差与暗反差

左:明反差,直射光(S)与衍射光(D)相位相同,两波干涉结果合成波P=S+D,振幅加大;右:暗反差,直射光与衍射光相位相差1/2波长,两波干涉结果合成波P=S-D,振幅变小。

由上所述,正是由于相板的存在,相差显微镜才具有其特殊的分辨能力。在相差物镜内的后焦面上装有种类不同的相板,因而物镜在明暗反差上可区分为两大类,即明反差(B)或负反差(N)物镜和暗反差(D)或正反差(P)物镜。物镜的反差类别,用英文字母B或N或D或P标志在物镜外壳上,并兼有高H(High)、中M(Medium)和低L(Low)等三种不同的反差。有的相差物镜用ph 字样的标示。

同一反差类别的物镜,依放大率的不同,又可分为10×、20×、×40、和100×数种,因此,相关物镜种类颇多,一套可多达20余种。

相差物镜多为消色差物镜或平场消色差物镜(PL)。

1.2.2.2转盘聚光器(turret condenser)

位于镜台之下,普通聚光器的所在位置上,由聚光镜和环状光阑(annular diapheragm)构成。环状光阑位于聚光镜之下,是一种特殊的光阑装置,由大小不同的环状通光孔构成,不同规格的通光孔——环状光阑装配在一个可旋转的转盘上,按需要调转使用(图1.5)。环状光阑的环宽与直径各不相同,与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配,不可滥用。转盘前端朝向使用者一面有标示窗(孔),转盘上的不同部位标有0、1、2、3和4或0、10、20、40和100字样,通过标示窗显现。“0”表示非相差的明视场的普通光阑。1或10、2或20、3或40和4或100,表示与相应放大率的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。通过手动转入的标示窗内之数字,表示该数字所代表的环状光阑已进入光路。

图1.5转盘聚光器的构造

1.2.2.3合轴调中望远镜(centering telescope)

合轴调中望远镜简称CT,又名合轴调中目镜。它是眼透镜,可行升降调节,具有较长的焦距的一种望远目镜。镜筒较长,其直径与观察目镜相同。它的功用仅作为环状光阑的环孔(亮环)与相差物镜相板的共轭面环孔(暗环)的调中合轴与调焦之用。相差显微镜使用时,转盘聚光器的环状光阑与相差目镜必须匹配,且环状光阑的孔环与相差物镜相板共轭面的环孔在光路中要准确合轴,并完全吻合或重叠。以保证直射光和衍射光各行其路,使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。但是,镜体的光路中前述两环的影像较小,一般目镜难以辨清,不能进行调焦与合轴的操作,所以必须借助合轴调中望远镜。

1.2.2.4绿色滤色镜(green filter)

相差物镜的种类,从色差消除情况来分,多属消色差物镜(achromatic objective)或PL物镜。消色差物镜的最佳清清晰范围的光谱区为510~630nm。欲提高相差显微镜的性能最好以波长范围小的单色光照明,即接物镜最佳清晰范围的波长的光线进行照明。所以,使用相差物镜时,在光路上加用透射光线波长为500~600nm左右的绿色滤色镜,使照明光线中的红光和蓝光被吸收,只透过绿光,可提高物镜的分辨能力。该滤色镜兼有吸热的作用,以利活体观察。

1.2.2.5相差显微镜的光路与成像

相并显微镜的照明光束,由转盘聚集器环状光阑的环状孔射入聚光镜,透射载物台上的被检样

品,经样品后,入射光除透射的直线光外,同时产生衍射光。衍射光的振幅较小,相位滞后。直射光和衍射光进入物镜,前者由环状的共轭面、后者由较大的补偿面透过相板,前后相互干涉造像。样品的影像由直射光(S)和衍射光(D)经干涉后的合成波(P)造成,即P=S±D;背景仅由直射光形成。由于直射光和衍射光两种光波的相位差异不同造成不同的反差效果,或明反差或暗反差不等视所用物镜的相板类别而定。成像光束由物镜射入目镜,在目镜的视场光阑处再次放大,并由出射光瞳射出目镜。(图1.6)

图1.6相差显微镜光路图

根据上述原理和结构所制成的显微镜便是相差显微镜。

1.2.3相差显微镜的使用

1.2.3.1相差物镜的调换安装

从物镜转换器上拆下普通物镜,旋入相差物镜,与普通目镜配套使用。

1.2.3.2转盘聚光器的调换安装

旋转聚光器升降螺旋,把普通明视场聚光器至最低位,旋松固紧螺丝,卸下聚光器。把转盘聚光器安放到相应位置上,旋紧固紧螺丝,转动聚光器升降螺旋,使聚光器升至最高位置。转盘聚光器的标示孔,朝向操作者。此时,转盘聚光器上面的聚光镜部分,进入光路;下面的环状光阑转盘,可视需要转动使用,把与物镜匹配的环孔旋入光路,使之处于转盘聚光镜下。

转盘聚光器调换安装后,要进行合轴调中,使聚光器的光轴与显微镜的主光轴合一。其步聚如下:

(1)把转盘聚光器的环状光阑调至“0”位,明视场照明的普通可变光阑进入光路。

(2)旋转聚光器升降螺旋,聚光器升至最高位。

(3)接通照明光源,使视场明亮。

(4)把被检样品放到载物台上,用低倍(4×)物镜聚焦。

(5)缩小镜座上的视场光阑开孔,至最小。

(6)从目镜观察,在暗视场中可见一缩小的、明亮的、多角形的视场光阑图像。

(7)转动转盘聚光器的两个调中杆,推动聚光器,把视场中的明亮的多角形的视场光阑图像,调至视场中央。

(8)开放视场光阑至视场同大,视两者周边是否完全重合;否则,复用调中螺杆,使聚光器

精神调中。

1.2.3.3把绿色滤色镜放入镜座的滤色镜架上。

1.2.3.4相板圆环与环状光阑圆环的合轴调中

相差物镜的后焦面装有相板。按物镜放大率与反差效果的不同,相板圆环(共轭面)的大小与结构亦不同。转盘聚光器的环状光阑为一系列的透光的,不同大小的明亮环孔,与不同放大率的物镜相应。使用时严格匹配,当物镜更换时,环状光阑亦作相应的更换或调整。

在视场中观察所见,环状光阑为一明亮的圆环,而相板的圆环为一暗环。互相匹配的明环与暗环大小一致。在使用时两者要合轴,互相重叠。两环的重叠,须通过合轴调节方能取得。其方法如下:

(1)相差物镜与环状光阑的匹配:正确地匹配取决于所用物镜放大率。例如,当使用40×相差物镜时,环状光阑转向ph3或40位,使相应地环状光阑进入光路。

(2)把CT放入目镜筒:从目镜筒取出一个目镜,换入调中合轴望远镜(CT)。CT为一眼透镜,也是可行升降调节的望远目镜,专为观察视场中明环与暗环图像之用。因为用一般目镜看不见两环的清晰图像。CT在使用前眼透镜应处于最低位,即CT为最短小的状态。

(3)明环与暗环的聚焦:一手固定位于目镜筒中的CT镜筒,使其透镜位置不能上移,另一手逆时针转到CT上部可调的眼透镜部分。转动的同时,通过CT向现场中观察,刚旋转时,两环可能为模糊的图像,继续转动CT目镜可调部分至清晰地窥见明环与暗环止。(图1.7)

图1.7光环与相板的合轴过程

(4)明环与暗环的调中重叠:相板的暗环是固定不动的,处于光路之中,暗环的中心,即显微镜光轴的中心。环状光阑的亮环可调节移动。转盘聚光器环状光阑的位置,因聚光器的可调其中心位置,往往偏离光轴轴心,需调整,使其归中。环状光阑的调中装置或部件,因厂家或型号的不同而有别。如OLYMPUS BH2-PC型相差显微镜,环状光阑调中装置为位于转盘聚光器两侧的两个伸缩自如的调中螺杆,用以操纵改变环状光阑的方位,达到调中;而Nikon FIVORPHOT型显微镜的相差装置,其环状光阑的调中部件为位于转盘聚光器表面,可向任一方向滑动的环状钮。调中时,手指调中装置,移动明环,使之与暗环合一。在两环调中过程,始终在通过CT的观察下进行。

在调节过程中,如亮环比暗环小,并位于暗环内侧时,应降低聚光器位置,使亮环放大。若亮环大于暗环时,应提升聚光器,使亮环缩小。如聚光器已升至最顶点还不能完全重合,可能是载玻片过厚之故。

(5)回装观察目镜:待相差物镜的暗环与环状光阑的亮环调中、重叠后,从目镜筒中取出CT,放回观察用的接目镜,以便镜检观察。

1.2.3.5相差物镜的选择

相差物镜有不同倍率、不同反差类别和反差程度之分。相差物镜的反差类别和反差程度以及放大倍数,皆用英文字母和数字标示在物镜壳中(表1.1)。

20×PH20倍正反差反差程度高

20×PM40倍正反差反差程度中等

100×PL100倍正反差反差程度低

40×NH40倍负反差反差程度高

40×NM40倍负反差反差程度中等

100×NL100倍负反差反差程度低

100×DH100倍暗反差反差程度高

40×DM40倍暗反差反差程度中等

20×DL20倍暗反差反差程度低

10×BH10倍明反差反差程度高

20×BM20倍明反差反差程度中等

40×BL40倍明反差反差程度低

表1.1物镜标示解读

相差镜检时,依被检样品的种类、结构和反差程度的不同,而确定应选用相差物镜的种类。这不存在死硬的规定,可依观察者的习惯和爱好而变。通常是哪一种相差物镜都能得到清晰的像,只是有的物镜更好些而已,因此可任意选择。暗反差物镜对习惯于明视场镜检者适宜。当与染色标本进行比较或进行测定以及加强半透明物体的反差时,多用暗反差;而计算数量或观察物体运动以及研究极小的样品时,多使用明反差。一般来说,相差物镜的应用范围如表1.2。

表1.2物镜应用范围(引自相关作者)

总之,在相差镜检时,于诸多的相差物镜中选一物镜,绝非易事。除参考上表所列应用范围外,最佳方法是通过各种类型的相差物镜进行实际镜检测定,找出最宜相差物镜。

1.3倒置相差显微镜

图1.8倒置相差显微镜

如图1.8即为倒置相差显微镜,可以看到整体的倒置构造,以及聚光器、环形光阑、相差物镜等结构。

前面已经介绍了倒置显微镜和相差显微镜的原理以及使用方法。倒置相差显微镜就是二者的组合体,其原理与使用方法也就是二者的原理与使用方法,一一对应,不再赘述。

2荧光显微镜

2.1荧光概念

荧光是物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态,再回到低能状态时释放出的光,是非温度辐射光,又称冷光。依据产生原因,荧光可分为:化学荧光(氧化还原反应发出的荧光)、光化荧光(光源激发而产生的荧光)、生物荧光、放射荧光四种。荧光显微镜应用的是光化荧光,通常利用紫外光(320-400nm)激发荧光物质,产生可见光荧光,多余的能量以热能放出。可以认为是被检物体自己发出可见光,从而被观察到。

荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。对被检物体来说,荧光产生方式有两种:自发荧光,经过紫外光照射直接发出荧光;继发荧光,被观察物体经过荧光染料处理之后,经过紫外光照射才能发出荧光。细胞中有些物质,如叶绿素等,受紫外线照射后产生自发荧光;另有一些物质本身虽不能发荧光,但如果用荧光染料或荧光抗体染色后,经紫外线照射亦可发出继发荧光,荧光染料种类很多(表1.3)

名称浓度(%)处理时间(min)

吖啶橙0.1~1.00.5~3

荧光红0.1~1.00.5~3

伊红Y0.11~2

金色胺0.1~1.00.5~3

酸性品红0.11~2

玫瑰红B0.11~10

瑰红G0.1~0.0011~3

甲基绿0.1~0.011~3

刚果红0.11~2

中性红0.1~0.0055~数小时

硫酸黄连素0.1~0.0021~数小时

表1.3常用荧光染料使用浓度及处理时间一览表

注:被检物经荧光染料处理后,荧光的颜色基本与染料的颜色相似,但在不同波长紫外线的激发下,其颜色也有差异。

2.2荧光显微镜结构与原理

荧光显微镜利用一个高发光效率的点光源,经过滤色系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光、激发标本内的荧光物质发射出各种不同颜色的荧光后,再通过物镜和目镜的放大进行观察(图2.1)。这样在强烈的对衬背景下,即使荧光很微弱也易辨认,敏感性高,主要用于细胞结构和功能以及化学成分等的研究。

图2.1荧光显微镜

2.2.1荧光显微镜分类

荧光显微镜按照明方式可分为落射式和透射式两类。落射式荧光显微镜是近代发展起来的新式荧光显微镜,其激发光从物镜向下落射到标本表面,即用同一物镜作为照明聚光器和收集荧光的物镜。透射式荧光显微镜较为原始,其激发光源是通过聚光镜穿过标本材料来激发荧光的。

2.2.2落射式荧光显微镜

落射式荧光显微镜的优点是视野照明均匀,成像清晰,放大倍数愈大荧光愈强。更适用于不透明及半透明标本,如厚片、滤膜、菌落、组织培养标本等的直接观察。

落射式荧光显微镜的构造主要包括:汞灯光源、激发滤板、双色束分离器(分色镜)和压制滤板四部分(图2.2)。

图2.2落射式荧光显微镜光路图

2.2.2.1汞灯光源

汞灯光源发射很强的紫外和蓝紫光,足以激发各类荧光物质,因此,为荧光显微镜普遍采用。现在多采用100~200W的超高压直流汞灯作光源,它是用石英玻璃制作,中间呈球形,内充一定数量的汞,工作时由两个电极间放电,引起水银蒸发,球内气压迅速升高,当水银完全蒸发时,可达50~70个标准大气压力,这一过程一般约需5~15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。

超高压汞灯也散发大量热能。因此,灯室必须有良好的散热条件,工作环境温度不宜太高。

200W超高压汞灯的平均寿命,在每次使用2h的情况下约为200h,开动一次工作时间愈短,则寿命愈短,如开一次只工作20min,则寿命降低50%。因此,使用时尽量减少启动次数。灯泡在使用过程中,其光效是逐渐降低的。灯熄灭后要等待冷却才能重新启动。点燃灯泡后不可立即关闭,以免水银蒸发不完全而损坏电极,一般需要等15min。

超高压汞灯(100W或200W)光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统,灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜,前面安装有集光透镜。

2.2.2.2激发滤板

荧光光源采用超高压汞灯,它可发出各种波长的光,但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长,所以需要加用激发滤板(一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片),仅使一定波长的激发光透过照射到标本上,而将其他光都吸收掉。

根据光源和荧光色素的特点,可选用以下四类激发滤板,以便提供一定波长范围的激发光。

⑴紫外光激发滤板:此滤板可使400nm以下的紫外光透过,阻挡400nm以上的可见光通过。常用型号为UG-1或UG-5,外加一块BG-38,以除去红色尾波。

⑵紫外蓝光激发滤板:此滤板可使300~450nm范围内的光通过。常用型号为ZB-2或ZB-3,外加BG-38。

⑶紫蓝光激发滤板:它可使350~490nm的光通过。常用型号为QB24(BG12)。

⑷蓝绿光激发滤板:最大吸收峰在500nm以上者的荧光素(如罗达明色素)可用之(如B-7)激发。

近年开始采用金属膜干涉滤板,由于针对性强,波长适当,因而激发效果比较玻璃滤更好。如西德Leitz厂的FITC专用KP490滤板和罗达明的S546绿色滤板,均远比玻璃滤板效果好。

激发滤板分薄厚两种,一般暗视野选用薄滤板,亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。

2.2.2.3双色束分离器

光路中需加上一个双色束分离器(分色镜),它与光铀呈45度角,激发光被反射到物镜中,并聚集在样品上,样品所产生的荧光以及由物镜透镜表面、盖玻片表面反射的激发光同时进入物镜,反回到双色束分离器,使激发光和荧光分开,残余激发光再被压制滤板吸收。

2.2.2.4压制滤板

每种物质被激发光照射后,在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性,一般都比激发光弱,为能观察到专一的荧光,在物镜后面需加压制滤板。它的作用有二:一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过,表现出专一的荧光色彩。

2.2.3透射式荧光显微镜

透射式荧光显微镜常用暗视野集光器,也可用普通集光器,调节反光镜使激发光转射和旁射到标本上.这是比较旧式的荧光显微镜。其优点是低倍镜时荧光强,而缺点是随放大倍数增加其荧光减弱.所以对观察较大的标本材料较好。

透射式荧光显微镜的主要构造包括:汞灯光源、激发滤板、暗场聚光镜、压制滤板四部分(图2.3)。

图2.3透射式荧光显微镜光路图

2.2.

3.1暗视野聚光镜

透射式荧光显微镜与落射式荧光显微镜的主要结构的功能相似,如激发滤板、暗视野聚光镜、压制滤板等。其中暗视野聚光器需进行主要介绍。暗视野聚光镜又称暗场聚光镜,在荧光显微镜中的应用日益广泛。因为激发光不直接进入物镜,因而除散射光外,激发光也不进入目镜,可以使用薄的激发滤板,增强激发光的强度,压制滤板也可以很薄,因紫外光激发时,可用无色滤板(不透过紫外)而仍然产生黑暗的背景。从而增强了荧光图像的亮度和反衬度,提高了图像的质量,观察舒适,可能发现亮视野难以分辨的细微荧光颗粒。可以说,暗视野聚光镜是将激发光汇聚,隔绝可见光,维持暗场的特殊聚光镜。

2.3荧光显微镜使用

2.3.1荧光显微镜标本制作要求

①载玻片:载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间,太厚的坡片,一方面光吸收多,另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁,厚度均匀,无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。

②盖玻片:盖玻片厚度在0.17mm左右,光洁。为了加强激发光,也可用干涉盖玻片,这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片,它可以使荧光顺利通过,而反射激发光,这种反射的激发光还可激发标本。

③标本:组织切片或其他标本不能太厚,应控制在10um左右为好,如太厚激发光大部分消耗在标本下部,而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外,细胞重叠或杂质掩盖,影响判断。采用石蜡制片时。必须彻底脱蜡,因为石蜡本身可发青色荧光。玻片最好用莹石玻璃制成的。

④封裱剂:封裱剂常用甘油,必须无自发荧光,无色透明,荧光的亮度在pH8.5~9.5时较亮,不易很快褪去。所以,常用甘油和0.5mol/l pH9.0~9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。

⑤镜油:一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,必须使用镜油,最好使用特制的无荧光镜油,也可用上述甘油代替,液体石蜡也可用,只是折光率较低,对图像质量略有影响。

2.3.2荧光显微镜使用方法

①打开灯源,超高压汞灯要预热15min才能达到最亮点。

②透射式荧光显微镜需在光源与暗视野聚光器之间装上所要求的激发滤片,在物镜的后面装上相应的压制滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片、双色束分离器、压制滤片的插块。

③用低倍镜观察,根据不同型号荧光显微镜的调节装置,调整光源中心,使其位于整个照明光斑的中央。

④放置标本片,调焦后即可观察。使用中应注意:未装滤光片不要用眼直接观察,以免引起眼的损伤;用油镜观察标本时,必须用无荧光的特殊油镜;高压汞灯关闭后不能立即重新打开,需待汞灯完全冷却后才能再启动,否则会不稳定,影响汞灯寿命。

⑤观察。例如:在荧光显微镜下用蓝紫光滤光片,观察到经0.01%吖啶橙荧光染料染色的细胞,细胞核和细胞质被激发产生两种不同颜色的荧光(暗绿色和橙红色)。

2.3.3荧光显微镜使用注意事项

①严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序。

②应在暗室中进行检查。进入暗室后,接上电源,点燃超高压汞灯5~15min,待光源发出强光稳定后,眼睛完全适应暗室,再开始观察标本。

③防止紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜。

④检查时间每次以1~2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3~5min后,荧光也明显减弱;所以,最多不得超过2~3h。

⑤荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源。天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再用时,须待灯泡充分冷却后才能点燃。一天中应避免数次点燃光源。

⑥标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发。长时间的激发光照射标本,会使得荧光衰减和消失现象,故应尽可能缩短照射时间。暂时不观察时可用挡光板遮盖激发光。

⑦标本观察时候应采用无荧光油,应避免眼睛直视紫外光源。

⑧电源应安装稳压器,电压不稳会降低荧光灯的寿命。

小结

以上主要介绍了倒置相差显微镜和荧光显微镜的工作原理和使用方法。内容较多,有些地方较难理解,需要在实践中逐渐摸索掌握。

倒置相差显微镜的主要部分是相差显微镜,相差显微镜的关键是相差物镜和环形光阑,更具体地说是相板和环形光阑。光源产生的光透过环形光阑和聚光器成为环形光锥,照射在被检物上,产生了直射光和衍射光。二者分别通过相板上的共轭面和补偿面,并产生了干涉。共轭面和补偿面上的涂层分别能使直射光和衍射光产生1/4λ的相位滞后,因此导致干涉光的振幅加强和减弱,并由此产生了明反差和暗反差。使被检物即使不经染色,也可清晰分辨。

荧光显微镜分为透射式和落射式两类,前者较为原始,后者较为先进。两类荧光显微镜的基本构件相似,主要区别为:透射式的激发光透过标本,标本整体产生荧光,荧光再进入物镜,放大倍数越高,荧光越弱;落射式的激发光投射在标本表面,标本表面产生荧光,荧光在进入物镜,放大倍数越高,荧光越强,适于进行高倍观察。荧光显微镜主要构件有汞灯光源、激发滤板、分色镜、压制滤板、暗场聚光镜(透射式)等。此外,由于汞灯发热严重,大多还装有吸热滤镜。部分荧光显微镜还有相差物镜和环形光阑,因此可以进行相差观察。还有的荧光显微镜采取倒置构架,又是倒置显微镜,等等。

参考文献

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[]《第六章特殊显微镜的工作原理和使用》ppt文档百度文库

[]《荧光显微镜原理及应用》word文档百度文库

[]荧光显微镜百度百科

[]《MF51型倒置荧光显微镜说明书》

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[]光的衍射百度百科

细胞室无菌技术标准操作规程

细胞室无菌技术标准操作规程 一、无菌室的灭菌 1. 定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然 后用3%。来苏尔或者新洁尔灭或者0.5 %过氧乙酸擦拭。超净台上滤网需每月清洗 1 次。 2. CO孵箱(培养箱)灭菌:用75%酒精擦拭或者0.5 %过氧乙酸,再用紫外灯照 射。 3. 实验前灭菌:打开紫外灯、超净台各20-30 分钟。在开紫外灯杀菌前,应确认无 菌室无人后方可开紫外灯杀菌。 4. 实验后灭菌:用75%酒精(3%新洁尔灭)擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物 台。 5 ?定期检测下列项目:钢瓶之CO压力;CO培养箱之CO浓度、温度、及水盘是 否有污染(水盘的水用无菌水,每周更换);无菌操作台内之气流压力,定期更换紫外线灯管及HEPAi滤膜,预滤网(300小时/预滤网,3000小时/HEPA。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750 ),定期更换水槽的水。 二、实验人员的无菌准备 1. 肥皂洗手; 2. 穿好隔离衣,放好拖鞋; 3. 用75%酒精棉球擦净双手; 三、无菌操作的要点 1. 凡是带入超净工作台内的酒精、PBS培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦 拭瓶子的外表面; 2. 靠近酒精灯火焰操作; 3. 器皿使用前必须过火灭菌; 4. 继续使用的器皿(如瓶盖、滴管)要放在高处,使用时仍要过火; 5. 各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液

6. 吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。 细胞传代培养(消化法)标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分 瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na):以10ml 分装于15 ml 无菌离心管中,保存于-0C,使用前放在37C水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 (1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37 r水浴锅内预热。 (2)用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 (3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 (4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 (5)准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。 (6)取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 (7)从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 (8)打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。

显微镜的使用注意事项

注意事项 ■持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势,不可单手提取,以免零件脱落或碰撞到其它地方。 ■轻拿轻放,不可把显微镜放置在实验台的边缘,应放在距边缘10cm处,以免碰翻落地。 ■保持显微镜的清洁,光学和照明部分只能用擦镜纸擦拭,切忌口吹手抹或用布擦,机械部分用布擦拭。 ■水滴、酒精或其它药品切勿接触镜头和镜台,如果沾污应立即用擦镜纸擦净。■放置玻片标本时要对准通光孔中央,且不能反放玻片,防止压坏玻片或碰坏物镜。 ■要养成两眼同时睁开观察的习惯,以左眼观察视野,右眼用以绘图。 ■不要随意取下目镜,以防止尘土落入物镜,也不要任意拆卸各种零件,以防损坏。 ■使用完毕后,必须复原才能放回镜箱内,其步骤是:取下标本片,转动旋转器使镜头离开通光孔,下降镜台,平放反光镜,下降集光器(但不要接触反光镜)、关闭光圈,推片器回位,盖上绸布和外罩,放回实验台柜内。最后填写使用登记表。 故障原因 一、检定方法把标准刻线尺放置在硬度计(或显微镜)的工作台上,检查时先调好焦距,使在目镜视野内或投影屏上能清晰地看到标准刻线尺的刻线,并调整到与目镜内的刻线重合,然后将读数显微镜的刻线与标准刻线尺的刻线进行比较,应至少在整个测量范围的5个间隔段进行测量,各间隔段比较3次,取3 次比较结果的平均值,其相对误差W按下式进行计算: W=(Li-L)/L×100% 式中:W——相对误差(mm);Li——读数显微镜的比较段所测出的长度(mm), (i=1~5);L——标准刻线尺比较段的实际长度(mm)。 读数显微镜的刻度按上述方法逐段进行比较,其误差应不大于±0.5%。 二、故障原因与调修 1.显微镜混浊不清 主要原因:镜片不洁或发霉。 排除方法:当镜片上存有灰尘或污物时,应用毛刷、羽毛除去,继而用镜头纸或用脱脂棉蘸少许无水酒精或乙醚细心地沿环形轨迹擦拭,但不要让擦拭液体流失。 2.镜内不能清晰地看到压痕边缘 主要原因:部分镜片有松动现象。 排除方法:重新固紧镜片松动之处。 3.读数显微镜刻度值与标准尺刻度不重合 主要原因:物镜镜头松动或物镜镜头与镜筒连接处垫圈丢失,焦距变化所致。 排除方法:将物镜镜头紧固,若垫圈丢失,应经过反复调试其厚度,配上合适的垫圈,至刻度误差最小的位置为止。

OLYMPUSIX51倒置显微镜操作规程-厦门大学医学院中心试验室

倒置荧光显微镜 操作规程 Olympus IX5 厦门大学医学院中心实验室 黄静茹 2017年3月

说明: ①透射光主开关;②汞灯高压电源开关;③透射光光强控制钮;④滤色片架; ⑤光路选择杆;⑥X轴和Y轴调节钮;⑦物镜转盘;⑧粗/微调焦旋钮; ⑨双目观察筒;⑩屈光度调节环;?聚光镜高度调节钮;?聚光镜对中旋钮;?视场光阑调节杆;?孔径光阑调节杆;?聚光镜转盘;?荧光光闸(SHUTTER);?荧光激发块转盘;?荧光减光阀

正式操作仪器之前请注意如下事项: 首先要在仪器预约保护时间内及时使用本人注册的校园卡刷卡开始实验。 1.查看仪器使用记录本,如之前使用者有记录仪器异常情况,请不要开机使用。 2.查看仪器整体有无异常,周围环境是否正常,需要时要开启室内空调,检查 并清空除湿机水箱。 3.查看仪器使用记录本及刷卡机“日历”,如之前使用者刚刚关机,请等候30 分钟以上再开机使用。 一、开机 1、打开透射光源(白光)主开关①; 2、打开荧光光源(汞灯高压电源)②; 3、打开电脑,进入cellSens Standard工作站; 备注:标本为HE染色、免疫组化时,不需要打开荧光光源;标本为荧光染料染色时,一般也不需要打开白光光源。 二、明场观察(Bright Field BF) 1、正确放置标本,BF主要用于HE染色、免疫组化标本; 2、转动荧光激发块转盘?到“6”的位置; 3、转动聚光镜转盘?到“BF”位置,直到听到咔嗒声; 4、将光路选择杆⑤推进去(选择目镜观察光路); 5、转动物镜转盘⑦,选用合适的物镜,调节白光光强控制钮③至合适的强度,调节粗/细调焦旋钮⑧聚焦观察,根据需要调节瞳间距⑨和屈光度⑩; 三、相衬观察(Phase contrast PH) 1、正确放置标本,PH主要用于没有任何染色的、较透明的标本; 2、转动荧光激发块转盘?到“6”的位置; 3、转动物镜转盘⑦,选用合适的物镜; 4、转动聚光镜转盘?,使相衬光学元件与所用物镜相匹配(见表1); 5、将光路选择杆⑤推进去(选择目镜观察光路); 6、调节光强控制钮③直至合适的强度,调节粗/细调焦旋钮⑧进行聚焦观察,根

倒置式金相显微镜的操作规程

倒置式金相显微镜的操作规程 摘要:倒置式金相显微镜的实用操作规范, 可以保证金相显微观察的效果, 也利于设备保护。但是,更重要的是规程背后包含更加丰富的内容, 这才是金相显微镜操作过程中需要深入了解的。本文介绍了倒置式金相显微镜的操作规程, 规程细节的详细分析, 以及在实践教学中应用、维护。 关键词: 倒置式; 金相显微镜; 操作规范; 日常维护; 在有些专业显微镜的使用频率非常高的, 有必要全面提高学生的显微镜技术。生物显微镜的操作, 可参考的文献比较多, 但是文献中介绍金相显微镜操作的比较少, 特别是倒置式金相显微镜。由于对样品观察面与背面平行度没有要求, 制样困难小,倒置式金相显微镜的实际应用非常多; 但现在还看不到一个比较适用、完整的。我们根据实际操作经验, 在正确使用、维护显微镜方面介绍一些经验, 供大家参考。 1. 现有文献的不足 随着技术的提高显微镜在不断地更新换代, 显微镜使用方法也要不断地调整。生物显微镜如此, 金相显微镜也是如此。而所能见到的有关金相显微镜操作方面的国内文献在这方面动作比较慢,不适应现在的要求。 1. 1. 关于变压器 近十几年来, 金相显微镜的变压器都已经实现了内置, 操作者从一般的角度出发, 不用再关心是否要连接到一个变压器上, 是否处于安全电压伏数的问题。国外在80年代初, 国内在80年代末, 基本实现了这一设计。不过, 很多最新出版的有关这方面的专业书籍, 还是沿用陈旧的说明: 注意不要直接插到220伏的电源上, 这就太落伍了。当然, 对于早期的显微镜还是需要考虑的。不过只应在操作说明的特别关注部分注明即可, 基本操作规范还是应该跟上技术、设计的发展。 1. 2. 偏重于正置式金相显微镜 在较早的文献中, 关于金相显微镜的操作类似如下的说明是主流, 为保证在聚焦过程中使物镜触及试样, 操作的次序应该是先调节粗动螺丝, 使物镜接近试样的表面, 再通过目镜观察试样, 调整粗动旋钮, 使物镜朝着离开试样的方向移动。必须养成这种操作习惯。有关金属显微组织检验方法的国家标准中也是这样的叙述: 聚焦调节时, 物镜头部不能与试样接触, 应先转动粗调旋钮使物镜尽量接近试样(目测), 然后从目镜中观察的同时调节粗调旋钮, 使物镜渐渐离开样品直到看到显微组织映像时, 再使用微调旋钮调至映像清晰为止。这样的描述, 适用于正置式金相显微镜, 而不太适用于倒置式金相显微镜, 因为使用者根本无法实现这样的操作, 尤其是在采用高倍物镜时, 根本无法观察到物镜与样品表面的距离变化。 1. 3. 操作、维护混杂在一起 这是最常见的。维护工作对一般操作者来讲不必一定了解, 混杂在一起, 容易干扰重点关注的地方。应单独列出管理者、维护者关注的部分。 1. 4. 没考虑不同厂家的金相显微镜在机械构造上的差异

学生显微镜的使用方法和注意事项

显微镜是人类20世纪最伟大的发明物之一。在它发明出来之前,人类关于周围世界的观念局限在用肉眼,或者靠手持透镜帮助肉眼所看到的东西。显微镜把一个全新的世界展现在人类的视野里,人们第一次看到了数以百计的"新的"微小动物和植物,以及从人体到植物纤维等各种东西的内部构造。近年来,由于科学技术的发展和人们生活水平的提高,显微镜开始在各大学校普及,越来越多的学生有机会亲自接触到显微镜了。那么关于学生在使用显微镜做实验的时候有哪些使用方法和操作注意事项呢?下面将给您详细讲解。 1.取镜 取下需替换的镜头放入镜头瓶中,镜头调整好位置,旋紧于镜头盖上,最后放置于物镜瓶中旋紧。 2.安装新镜头 将物镜通过旋转安装到物镜转换器上,安装的时候需要按着顺时针的方向旋转转换器,物镜这时候的物镜倍率是由低到高。 3.安装确认无误后,即可进行使用

显微镜安装好以后,需要检测是否齐焦,若不齐焦,检查物镜是否旋紧,安装好物镜后,即可正常使用。 4.调节 把所观察的标本放到载物台上。注意:使有盖玻片的一面朝上,且被观察的部分位于通光孔的正中央,再用压片夹夹住。转动准焦螺旋,将镜筒尽量调低。注意:从侧面观察物镜,不要让物镜压到标本上,以防镜头将标本压碎。 左眼注视目镜内,同时逆时针方向转动准焦螺旋,使镜筒缓缓上升,直到看清物像为止。如果物像偏离视野,可慢慢移动标本。移动时应注意标本移动的方向与视野中看到的物像移动的方向相反。 5.观察与记录 用左眼对准镜内观察,同时右眼看桌面的记录本,并做好记录。注意:观察时,不能随便移动显微镜的位置。 6.还原

显微镜使用完后,将标本取下放回原处,然后将镜筒降到低处,一手握镜臂,一手托镜座,将显微镜放回镜箱内。 深圳市爱科学教育创新有限公司(以下简称爱科学)成立之初是 一家专注于研制新一代教学显微镜的科技型企业,公司致力于将先进的影像技术、电子信息技术及新时期的人文需求融入到传统光学仪器中,创造出一系列更加适合教学的显微镜产品。风雨中成长的几年里,爱科学掌握了数十项核心技术,于多项评比中荣获“自主创新银奖”、“中国教育装备产品创新奖”、教育装备“金奖产品”、“金点设计奖”、“红棉中国设计奖”等荣誉。这一切艰苦奋斗的成果,使得爱科学将目光由显微镜领域扩展到整个实验室装备领域中。

细胞传代标准操作规程版

细胞传代培养SOP(消化法) 具体步骤如下: 1. 传代前准备: 1.1预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热。 1.2 用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 1.3 正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 1.4 点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 1.5 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8 分钟再次消毒。 1.6 取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 1.7 从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 1.8 打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶-EDTA消化: 2.1加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶-EDTA液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37T < 2.2 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。 2.3 吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞: 3.1 吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 3.2吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.3 平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8 分钟。 3.4弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞: 4.1 分装:将细胞悬液吸出分装至2-3 个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。 4.1 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5X 105/ml。最后要做好标记。 5. 继续培养: 用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时

光学显微镜的原理及构造

光学显微镜的原理及构造显微镜是人类认识物质微观世界的重要工具,是现代科学研究工作不可缺少的仪器之一。显微镜自1666年问世以来已有300多年的历史了,其间随着科学技术不断发展,显微镜的品种不断增加,结构和性能逐步得到完善和提高。 根据不同的使用用途,光学显微镜可分为普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、倒置显微镜、体视显微镜、偏光显微镜等10多种。目前,世界上许多国家都可以生产光学显微镜,牌名、种类繁杂,其中德国、日本等国制造的显微镜品质、数量占优势,但价格昂贵。 对于现代的光学显微镜,包括各种简单的常规检验用显微镜、万能研究以及万能照相显微镜等,首先要认识其构造及各部件的功能,同时要掌握正确的调试、使用和保养方法,才能在实际应用中面对各种要求时以不同的显微镜检方法,充分发挥显微镜应有的功能,提高常规检验工作效率. 光学显微镜的原理和构造 随着科学技术的发展,显微镜检方法由最传统的明视野、暗视野发展出了相差法、偏光方法;荧光方法也由透射光激发进展为落射光激发,使荧光效率大为提高;微分干涉相衬方法基于偏光方法,而巧妙地利用了微分干涉棱镜,使之能应用于医学与生物学的样品,又能应用于金相样品的分析与检验。 下面以德国ZEISS公司生产的Axioplan万能研究用显微镜,简单介绍万能显微镜的基本组成部件。 1. 显微镜主机体(stand) 显微镜的主机体设计成金字塔形,而底座的截面呈T字形,使显微镜的整体相当稳固。显微镜的光学部件和机构调节部件、光源的灯室、显微照相装置、电源变压稳压器等,都可安装在主机体上或主机体内。 2. 显微镜的底座(base) 底座和主机体通常组成一个稳固的整体。底座内通常装有透射光照明光路系统(聚光、集光和反光)部件,光源的滤光片组,粗/微调焦机构,光源的视场光阑也安装在底座上。 3. 透射光光源(tranilluminator) 透射光光源由灯室(lamp housing)、灯座(lamp socket)、卤素灯(halogen lamp)、集光与聚光系统(lamp collector and lamp condenser)及其调整装置组成。 4. 透射光光源与反射光光源的转换开关(toggle switch) 这是新一代AXIO系列显微镜特有的装置,透射光和反射光可通用。当具有透/反两用的配置时,利用这一转换开关能方便而又迅速的使透射光 和反射光互相转换。在纯透射光的配置中,这一开关就改为电源开关。

显微镜操作步骤和注意事项

操作步骤和注意事项 (一)正置显微镜 1、安放 右手握住镜臂,左手托住镜座,使镜体保持直立.桌面要清洁、平稳,要选择临窗或光线充足的地方.单筒的一般放在左侧,距离桌边3~4厘米处. 2、清洁 检查显微镜是否有毛病,是否清洁,镜身机械部分可用干净软布擦拭.透镜要用擦镜纸擦拭,如有胶或粘污,可用少量二甲苯清洁之. 3、对光 镜筒升至距载物台1~2厘米处,低倍镜对准通光孔.调节光圈和反光镜,光线强时用平面镜,光线弱时用凹面镜,反光镜要用双手转动. 若使用的为带有光源的显微镜,可省去次步骤,但需要调节光亮度的旋钮. 4、安装标本 将玻片放在载物台上,注意有盖玻片的一面一定朝上.用弹簧夹将玻片固定,转动平台移动器的旋钮,使要观察的材料对准通光孔中央. 5、调焦 调焦时,先旋转粗调焦旋钮慢慢降低镜筒,并从侧面仔细观察,直到物镜贴近玻片标本,然后左眼自目镜观察,左手旋转粗调焦旋钮抬升镜筒,直到看清标本物像时停止,再用细调焦旋钮回调清晰. 操作注意:不应在高倍镜下直接调焦;镜筒下降时,应从侧面观察镜筒和标本间的间距;要了解物距的临界值. 若使用双筒显微镜,如观察者双眼视度有差异,可靠视度调节圈调节.另外双筒可相对平移以适应操作者两眼间距. 6、观察 若使用单筒显微镜,两眼自然张开,左眼观察标本,右眼观察记录及绘图,同时左手调节焦距,使物象清晰并移动标本视野.右手记录、绘图. 镜检时应将标本按一定方向移动视野,直至整个标本观察完毕,以便不漏检,不重复. 光强的调节:一般情况下,染色标本光线宜强,无色或未染色标本光线宜弱;低倍镜观察光线宜弱,高倍镜观察光线宜强.除调节反光镜或光源灯以外,虹彩光圈的调节也十分重要. (1)低倍镜观察 观察任何标本时,都必须先使用低倍镜,因为其视野大,易发现目标和确定要观察的部位. (2)高倍镜观察 从低倍镜转至高倍时,只需略微调动细调焦旋钮,即可使物像清晰. 使用高倍镜时切勿使用粗调焦旋钮,否则易压碎盖玻片并损伤镜头. 转动物镜转换器时,不可用手指直接推转物镜,这样容易使物镜的光轴发生偏斜,转换器螺纹受力不均匀而破坏,最后导致转换器就会报废.

透射电子显微镜的原理

透射电子显微镜的原理 XXX (大庆师范学院物理与电气信息工程学院 2008级物理学 200801071293 黑龙江大庆163712) 摘要:透射电子显微镜在成像原理上与光学显微镜类似。它们的根本不同点在于光学显微镜以可见光作照明束,透射电子显微镜则以电子为照明束。在光学显微镜中将可见光聚焦成像的玻璃透镜,在电子显微镜中相应的为磁透镜。由于电子波长极短,同时与物质作用遵从布拉格(Bragg)方程,产生衍射现象,使得透射电镜自身在具有高的像分辨本领的同时兼有结构分析的功能。 关键词:第一聚光镜;第二聚光镜;聚光镜阑;物镜光阑;选择区光阑;中间镜 作者简介:XXX(1988-),黑龙江省绥化市绥棱县,物理与电气信息工程学院学生。 0引言: 工业多相催化剂是极其复杂的物理化学体系。长期以来,工业催化剂的制备很大程度上依赖于经验和技艺,而难以从原子分子水平的科学原理方面给出令人信服的形成机制。为开发更高活性、选择性和稳定性的新型工业催化剂,通过各种表征技术对催化剂制备中的过程产物及最终产品进行表征是一个关键性的基础工作。在当前各种现代表征手段中,透射电子显微镜尤其是高分辨透射电子显微镜,可以在材料的纳米、微米区域进行物相的形貌观察、成分测定和结构分析,可以提供与多相催化的本质有关的大量信息,指导新型工业催化剂的开发。 为什么透射电子显微镜有如此高的分辨率那?本文阐述了透射电子显微镜的工作原理。 1透射电子显微镜的定义/组成 1.1定义 在一个高真空系统中,由电子枪发射电子束, 穿过被研究的样品,经电子透镜聚焦放大,在荧光 屏上显示出高度放大的物像,还可作摄片记录的一 类最常见的电子显微镜称为透射电子显微镜。[1] 1.2组成 透射电子显微镜由照明系统、成像系统、记录 系统、真空系统和电器系统组成。(如图1) 2透射电子显微镜的照明系统 照明系统的作用是提供亮度高、相干性好、束 流稳定的照明电子束。它主要由发射并使电子加速 的电子枪和会聚电子束的聚光镜组成。

金相显微镜使用注意事项

金相显微镜使用注意事项 金相显微镜使用注意事项: (1)操作时必须特别谨慎,不能有任何剧烈的动作。不允许自行拆卸光学系统。 (2)严禁用手指直接接触显微镜镜头的玻璃部分和试样磨面。若镜头上落有灰尘,会影响显微镜的清晰度与分辨率。此时,应先用洗耳球吹去灰尘和砂粒,再用镜头纸或毛刷轻轻擦拭,以免直接擦试时划花镜头玻璃,影响使用效果。 (3)切勿将显微镜的灯泡(6~8V)插头直接插在220V的电源插座上,应当插在变压器上,否则会立即烧坏灯泡。观察结束后应及时关闭电源。 (4)在旋转粗调(或微调)手轮时动作要慢,碰到某种阻碍时应立即停止操作,报告指导教师查找原因,不得用力强行转动,否则会损坏机件。 3.金相显微镜仪器维护 为了使仪器在正常使用条件下,保持它的有效性能,除了必须使用恰当外,还必须注意加强维护保养,现就维护保养问题提出下列几点要求(仅供参考)。 (1)仪器应贮放在空气流通和较干燥的地方,避免过冷过热和接触腐蚀性气体,不能与化学用品(干燥剂除外)同时贮放于同一地方。使用后宜用罩子遮盖并抹擦干净。不用时,要及时移走试样(玻片),用擦镜纸擦拭镜头,并将镜头转成八字式,同时下降镜筒固定,以免物镜镜头与集光器上的透镜相击而受损。再将显微镜装放入木箱内,放置在干燥、通风处。在可能条件下,最好每隔一定的时间,选择天气好的日子,将仪器和附件从木箱中取出,一起在室内宽敞、干燥、空气流通的地方,作两、三小时的室内晾曝。在高温天气作业完毕后,应注意贮放地点的温度,如温差悬殊,用毕后即收藏会在仪器上面产生湿气,容易使仪器发潮损坏。 (2)使用后应给目镜斜管盖上防尘盖子,如没有防尘盖子亦应套上目镜,以免灰尘落入斜管内,影响镜座光具的清洁。 (3)不宜随便拆卸和揩抹光学系统内部的半反射镜。除此之外,在透镜或玻璃表面不慎接触油污尘垢,可用细洁亚麻布或洁净脱脂棉花,沾少许二甲苯拭除(但不能用酒精,以免浸入透镜内层影响质量),由镜头中心向外旋转擦拭,并用擦镜纸或软绸布轻轻拭净,否则易于脱胶,或模糊而影响检测效果。如只是沾上灰尘,可用橡皮小吹风球把灰尘吹掉(不可用口吹),或用软毛笔或用细木棒卷上棉花,轻轻擦除之。镜头表面镀有一层兰透光膜,不要误作污物擦拭,禁止用金属工具来代替棉签进行擦拭。 (4)使用油浸系物镜后,必须立即采用上述方法把油垢除去,抹擦干净,抹时千万小心,特别注意不能按压镜面,否则容易使透镜脱离镜座。 (5)仪器长期使用后,粗动滑板部分及载物台滑动部分可能出现油脂不足或干涸现象,此时应及时添加润滑油脂。粗(微)动机构宜用流动性油脂,载物台滑动部分宜用有适当粘度的(但注意不能含有酸性)油脂。

细胞冻存与细胞复苏标准操作规程(SOP)

背景知识: 细胞培养的传代及日常维持过程中,在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费,而且细胞一旦离开活体开始原代培养,它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;细胞储存在液氮中,温度达-196℃,理论上储存时间是无限的。 原理: 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融,实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂,这两种物质能提高细胞膜对水的通透性,加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外,减少细胞内冰晶的形成,从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法,这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 主体内容(操作步骤): 一、材料 (一)仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱(4℃、-20℃、-70℃) 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱 7. 液氮冰箱 易生物仪器库:https://www.wendangku.net/doc/754679974.html,/yp/product-list-42.html (二)玻璃器皿 1. 吸管(弯头、直头) 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶(250ml、100ml) 4. 废液缸 (三)塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 胶塞 4. 移液管(10ml) 5. 15ml离心管 6. 冻存管(1~2ml) (四)其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 3. 记号笔 4. 医用橡皮膏 5. 移液枪 (五)试剂 1. D-Hanks液 2. 小牛血清

显微镜操作步骤和注意事项

显微镜操作步骤和注意 事项 集团文件发布号:(9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-

操作步骤和注意事项 (一)正置显微镜 1、安放 右手握住镜臂,左手托住镜座,使镜体保持直立.桌面要清洁、平稳,要选择临窗或光线充足的地方.单筒的一般放在左侧,距离桌边3~4厘米处. 2、清洁 检查显微镜是否有毛病,是否清洁,镜身机械部分可用干净软布擦拭.透镜要用擦镜纸擦拭,如有胶或粘污,可用少量二甲苯清洁之. 3、对光 镜筒升至距载物台1~2厘米处,低倍镜对准通光孔.调节光圈和反光镜,光线强时用平面镜,光线弱时用凹面镜,反光镜要用双手转动. 若使用的为带有光源的显微镜,可省去次步骤,但需要调节光亮度的旋钮. 4、安装标本 将玻片放在载物台上,注意有盖玻片的一面一定朝上.用弹簧夹将玻片固定,转动平台移动器的旋钮,使要观察的材料对准通光孔中央. 5、调焦 调焦时,先旋转粗调焦旋钮慢慢降低镜筒,并从侧面仔细观察,直到物镜贴近玻片标本,然后左眼自目镜观察,左手旋转粗调焦旋钮抬升镜筒,直到看清标本物像时停止,再用细调焦旋钮回调清晰. 操作注意:不应在高倍镜下直接调焦;镜筒下降时,应从侧面观察镜筒和标本间的间距;要了解物距的临界值.

若使用双筒显微镜,如观察者双眼视度有差异,可靠视度调节圈调节.另外双筒可相对平移以适应操作者两眼间距. 6、观察 若使用单筒显微镜,两眼自然张开,左眼观察标本,右眼观察记录及绘图,同时左手调节焦距,使物象清晰并移动标本视野.右手记录、绘图. 镜检时应将标本按一定方向移动视野,直至整个标本观察完毕,以便不漏检,不重复. 光强的调节:一般情况下,染色标本光线宜强,无色或未染色标本光线宜弱;低倍镜观察光线宜弱,高倍镜观察光线宜强.除调节反光镜或光源灯以外,虹彩光圈的调节也十分重要. (1)低倍镜观察 观察任何标本时,都必须先使用低倍镜,因为其视野大,易发现目标和确定要观察的部位. (2)高倍镜观察 从低倍镜转至高倍时,只需略微调动细调焦旋钮,即可使物像清晰. 使用高倍镜时切勿使用粗调焦旋钮,否则易压碎盖玻片并损伤镜头. 转动物镜转换器时,不可用手指直接推转物镜,这样容易使物镜的光轴发生偏斜,转换器螺纹受力不均匀而破坏,最后导致转换器就会报废. (3)油镜的观察 先用低倍镜及高倍镜将被检物体移至视野中央后,再换油镜观察.油镜观察前,应将显微镜亮度调整至最亮,光圈完全打开.

olympus_i71倒置显微镜操作规程

OLYMPUS IX71倒置显微镜操作规程 编写人:於锋时间 一、目的 正确使用倒置显微镜对细胞标本的形态特征进行观察,为生命科学的研究提供更多可靠的实验数据。 二、原理 倒置显微镜系统(IX71系列)是在透镜成像原理基础上发展起来的显微观察系统,利用卤素灯为光源,光线经过聚光镜汇聚后透过标本,通过物镜对标本进行聚焦放大成像,最后通过目镜把物镜所成的像再次放大,从而使实验者能够清晰的分辨体外培养的细胞的形态以及内部结构,主要用于体外活细胞培养形态观察,根据实验需求配置了明场、暗场、相差、荧光等技术模块。 三、主要操作规程 相差观察: 1.打开主开关 2.转动光路选择盘到“眼睛”位置。 3.装上观察样本。使用10X物镜,将聚光镜转盘转到“BF”位置。 4.瞳距调节 5.屈光度调节:通过螺旋目镜屈光度调节环。 6. 通过粗微调对样本准确调焦。选择所用物镜,10X,20X,40X。 相差观察时转动聚光镜转盘到“PH”位置。相差只能用10X,20X物镜观察和摄影。 7. 调节光线强度:明场观察时,调节孔径光栏。相差观察时,打开孔径光栏 8. 观察。 荧光观察步骤: 1.打开荧光供电装置开关,关掉显微镜主开关。等大约10分钟后电弧稳定。 2.连接UV防护板 3.把光路选择转盘和选择杆转到“眼睛”位置。 4.使相应的荧光激发滤色镜进入光路 5.根据标本不同,选择U,B,G激发。

6.打开激发光光闸使光通过把所用物镜推入光路10X,20X,40X。 7.把标本放在载物台上,对标本进行调焦,如果荧光衰退快,请将激发光光闸推入光路 使用1小时后关掉电源开关。 普通明场观察: 1.打开明场电源开关(“︱”为开,“○”为关) 2.将样品置于载物台上 3.将光路选择旋钮调至观察位置 4.从低倍镜开始观察,相差环拨到明场(BF)位置,荧光滤色块转盘拨到“1”的位置 5.调节透射光光强,调焦,找到预观察视野 6.依次换到高倍镜,观察样品 7.拍照时将光路选择旋钮调至相机位置 关机: 1. 关闭汞灯电源(注意:汞灯需使用半小时以上方可关闭,关闭半小时以后方可再次开启) 2. 将透射光强调到最小,透射光选择按钮按出 3. 关闭明场电源开关 4. 将镜头转到低倍镜,取出样品,若使用过油镜用干净的擦镜纸擦拭镜头 5. 确认数据已经保存,关闭软件 6. 使用光盘拷贝数据(禁止使用移动储存设备拷贝数据) 7. 关闭电脑,登记使用时间、荧光数字等使用情况

显微镜使用过程和注意事项

........ 显微镜使用过程(每个过程应注意的方法) ①取镜和安放: 一手握镜臂,一手托镜座【右握左托,保持镜身直立,防目镜、反光镜脱落】, 把显微镜放在距离试验台边缘10cm处【避免碰翻落地】,略偏左,装好目镜和物镜。 ②对光:转动转换器,使低倍物镜正对通光孔。注意:不要板着目镜,使目镜松动。 转动遮光器,选择最大光圈对准通光孔。左眼注视物镜、右眼睁开, 转动反光镜【直对或斜对光源】,将光线反射到镜筒里。 使光线通过光圈、通光孔、标本、物镜、镜筒、目镜,可看到白亮的视野。 注意:转动反光镜,先用平面镜,视野太暗换凹面镜【可避免强光刺眼】。 外界光线过强,可调小光圈。 ③安放装片:把制作的玻片标本放在载物台上,并用压片夹压住,标本要正对通光孔中心。 ④调焦:从侧面看着物镜!顺时针转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓下降 至接近玻片标本为止【约0.2-0.5cm,免物镜和玻片相挤压】。 注意:物镜不要碰到标本。 ⑤观察:左眼向物镜内观察、右眼睁开【以便绘图】, 逆时针转动粗准焦螺旋,使镜筒缓缓【太快,物像来不及看到就闪过】上升 直到看到物像为止。再略微转动细准焦螺旋使物像更清晰。 ⑥清洁收放:观察完毕,先升镜筒,取下玻片标本。 用洁净纱布将显微镜外表擦净。如需擦拭镜头,要用擦镜纸轻擦。 转动转换器,使两个物镜伸向前方, 将镜筒缓缓降到最低处。【防止因重力作用使镜筒自然下降,引起滑丝】 将反光镜放在直立或水平位置。把显微镜放进镜箱,锁好箱门,放回原处。 注意事项:1、物象的放大倍数=目镜放大倍数×物镜放大倍数 2、物像是实物的倒像【上下倒、左右倒】。(旋转1800)例如:b在显微镜里是q 。 3、物像移到视野中央的方法:物像在视野的右上方,载玻片向右上方移动。 物像的移动方向与玻片标本的移动方向相反。 4、如何确定污点(花斑)位置?目镜、物镜、玻片标本。 5、放大倍数越大或低倍镜换成高倍镜: 视野越暗、视野范围越小、细胞体积越大、细胞数目越少)【可调成大光圈、凹面镜】。 试题试卷

倒置金相显微镜安全操作规程

倒置金相显微镜安全操作规程 1内容 本操作规程规定了本公司用于观察金相组织的徕卡倒置式金相显微镜DMILM的相关使用及保养方法,使相关员工能正确使用和维护本公司显微镜。 2范围 本操作规程适用于本公司检验员的操作。 3细则 3.1准备工作 1)检查倒置金相显微镜是否良好。 2)把显微镜放在平整的桌子上。 3)倒置金相显微镜构造如图1所示。 图1倒置金相显微镜 3.2使用 1)被测试样应干燥洁净,其观察面应平整光洁,不得有杂物、凹坑及明显的加工痕迹。 2)取下显微镜防尘罩,打开照明系统电源后,显微镜后部光源灯亮。取下显微镜载物台上的物镜保护盖,将试样平稳放在载物台上。 3)用显微镜直接观察时,调整双目镜的宽度,使双眼能看到同一视场。转动显微镜右侧与载物台相连的手柄,将试样被观察部位移动到视场下,缓慢转动粗调旋钮,当视场内出现模糊的图像时,停止粗调旋钮,改为转动微调旋钮,直到整个视场内出现清晰的图像。 4)转动显微镜底座右侧的照明系统电压调节旋钮,调整光源到适宜亮度。 5)如果要用不同放大倍数进行观察,可转动换物镜旋座到所需要的放大倍数的物镜。 6)如需要对试样组织尺寸进行测量,可通过左侧目镜的目镜测微尺进行尺寸测量。可通过旋转目镜调整微尺方向。 7)如要对试样组织拍照,可通过显微镜与电脑相连的数字摄像头进行拍摄取像,所使用的软件为Profound Iron & Steel 金相图像分析系统软件。 8)使用完毕,盖上物镜保护盖,关闭电源。长时间不使用,则盖上防尘罩。

3.3 Profound Iron & Steel 金相图像分析系统 3.3.1定标 第一次使用,需进行定标。定标就是得到图像像素和常用度量单位间的对应关系,步骤如下: a)打开显微镜。 b)将物台测微尺放于载物台上,打开Profound Iron & Steel 金相图像分析软件,点击图像快速采集按钮,即可观察到显微镜下的图像,使用显微镜调焦系统对图像进行调节,调整好后,点击“抓拍F8”按钮可摄取带有标尺的清晰图像。 c)单击关闭按钮关闭图像摄取窗口,单击“标定标尺”,出现对话框。 d)标尺方式选定“x向线段”,在对话框中输入标尺名称和标尺长度(比如在50×放大倍数下摄取的标尺图像,输入标尺名称为50×,以便于记忆),单位为“公制”。然后在所摄取标尺图像起始处按下鼠标左键,向标尺另一边移动鼠标,直到结束。然后输入选定的测微尺的实际长度,点击“保存标尺”按钮。则50倍放大倍数下的标尺就定好了。 e)如果再定其他倍数下的标尺,重复上述操作。 3.3.2图像处理 a)反色:以图像相反的颜色显示图像,即是对每个像素的像素值都发生变化,灰白图像黑白反转,以突出显示物体。 b)彩色灰度化:将彩色转变为灰色,显示成256级灰度图像。 c)对比度增强:单击该按钮弹出对话框,拖动滑块可调整图像的亮度和对比度。 d)直方图均衡:增强当前图像的对比度和显示动态的边界。 e)二值化:进行阀值分割,将灰度图像转化为二值图像,变成只有两个灰度级的图像,即0和1,1代表物体,0代表背景。 f)二值图像处理:如果初始的阀值分割不能够令人满意,对二值图像的某些形式的出来通常能提高其质量,以便更准确的测量和观察。本软件包括腐蚀、碰撞、开运算、闭运算、收缩、细化、抽骨架、剪枝、粗化、No Touch、填内孔、去孤点、取碎屑、去毛刺等二值图像处理功能。 g)编辑图像:编辑当前图像,对图像像素值直接进行修改,主要作用是孔洞填充、断点连接、分割物体。 h)标注:使用该功能对图像作标注,标注图像的文本信息或迭加标尺等(常用尺寸标注结果已储存,可在对话框“文件”直接打开)。 i)景深扩展:试样不平坦时,景深范围内的图像是清晰的,景深外是模糊的,这是光学系统的物理特征,不能通过调整显微镜来解决。景深扩展功能通过将同一视场不同聚焦面的图像序列进行合成,最终可得到该视场完整清晰的图像。 j)图像拼接:显微镜视野较小,为了得到较大区域的全貌图像,图像拼接功能可以把试样上数幅有关系的图像,通过自动搜索重合区域,拼接成一幅高分辨率的全貌图像。 3.3.3图像变换 a)裁剪:单击“专用”菜单下的“视场设置”,弹出对话框,选择矩形、圆形、椭圆形工具的一种,在图像上单击左键,图像上出现视场,按住左键任意移动视场,选择完毕后,单击“裁剪”按钮。 b)任意角旋转:单击该菜单,弹出对话框,在对话框中输入角度,点击确定,图像可旋转任意角度。 c)水平翻转:将图像水平翻转。

金相显微镜的基本原理、构造及使用

5.2 金相显微镜的基本原理、构造及使用 金相显微镜可用来鉴别和分析各种金属和合金的组织结构,广泛应用在工厂或实验室进行铸件质量的鉴定、原材料的检验或对材料处理后金相组织的研究分 析等工作。还可用于半导体检测、电路封装、精密模具、生物材料等检验与测量。【实验目的】 1.了解金相显微镜的基本原理、基本结构和使用方法。 2.掌握仔细阅读显微镜使用说明书并进行正确操作的方法。 【实验原理】 显微镜的基本放大作用由焦距很短的物镜和焦距较大的目镜来完成的,物体位于物镜的前焦点外但很靠近焦点位置,物体经过物镜形成倒立的放大实像,这个像位于目镜的物方焦距内但很靠近焦点位置,作为目镜的物体,目镜将物镜放大的实像再放大成虚像,位于观察者的明视距离(距人眼250mm)处,供眼睛观察。光路图见“2.4光学基本仪器”中的图2-? 为了减少球面像差、色像差和像域弯曲等像差,金相显微镜的物镜和目镜都是由透镜组构成的复杂光学系统。显微镜的成像质量在很大程度上取决于物镜的 质量,因此物镜的构造尤为复杂,根据对各种像差的校正程度不同,物镜可分为消色差物镜、复消色差物镜和平视场物镜等三大类。近年来,由于采用计算机技术,物镜的设计和制造都有了很大改进。 实际上,一方面,金相显微镜所观察的显微组织,往往几何尺寸很小,小至 可与光波波长相比较,此时不能再近似地把光线看成直线传播,而要考虑衍射的影响。另一方面,显微镜中的光线总是部分相干的,因此显微镜的成像过程是个比较复杂的衍射相干过程。此外,由于衍射等因素的影响,显微镜的分辨能力和放大能力都受到一定限制,目前金相显微镜可观察的最小尺寸一般是0.2μm左右,有效放大倍数最大为1500~1600倍。 金相显微镜总的放大倍数为物镜与目镜放大倍数的乘积。放大倍数用符号“Х”表示,例如物镜放大倍数为20Х,目镜放大倍数为10Х,则显微镜的放大倍数为200Х。通常物镜、目镜的放大倍数都刻在镜体上,在使用显微镜观察试 样时,应根据其组织的粗细情况,选择适当的放大倍数,以细节部分能观察得清晰为准。 金相显微镜最常见的有正置、倒置和卧式三大类。本实验使用的是正置金相显微镜为例,光学系统结构图如图5-2-1所示。

细胞培养传代冻存复苏操作规程(自编)

细胞培养程序 材料 A、仪器 1. 净化工作台, 2. 离心机, 3. 恒温水浴箱, 4. 冰箱(4℃) 5. 倒置相差显微镜, 6. CO2培养箱, 7. 振荡混合仪 8. 酶联免疫检测仪,9. 移液枪,10. 电磁力搅拌机,11. 微孔滤器 B、玻璃器皿 1. 吸管, 2. 小烧杯(100ml), 3. 废液缸, C、塑料器皿 1. 吸头, 2. 枪头, 3. 96孔培养板, 4. 15ml离心管, 5. 50ml离心管, 6. 胶塞, D、其他物品 1. 微量加样枪, 2. 红血球计数板, F、试剂 1. D-Hanks液, 2. 小牛血清, 3. RPMI1640, 4. 双抗(青霉素、链霉素), 5. 0.25%胰酶, 6.0.025% EDTA 7. 二甲基亚砜(DMSO), 8. MTT溶液:称取250mgMTT,放入小烧杯中,加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min,用0.22um的微孔滤器除菌,分装,4℃保存备用,两周内有效。 一、原代细胞培养或细胞株(系)复苏培养: (一)细胞原代培养 1.贴壁细胞培养法: 1)、组织块培养法 将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此,5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴,置青霉素小瓶中,加两滴小牛血清,用剪刀尽可能将其剪碎,用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁,倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置,从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液(小

牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml),使组织块有培养液与其接触为准,轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。 或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。培养2~4小时,待小块贴附后,将培养瓶缓慢翻转平放,静置培养,动作要轻,严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败,若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多,以保持组织块湿润即可,培养24小时后再补液,培养3~5天时可换液,一方面补充营养,一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 其他方法:消化分离法、器官培养略 2.悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化,可采用低速离心分离,直接培养,或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 (二)细胞株(系)细胞复苏培养 细胞复苏的主要操作步骤 (1)佩戴眼镜和手套,从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中,并不时摇动,在1分钟内使其完全融化。 (3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5~10分钟,弃去上层液,加入适量培养液后接种于培养瓶中,接种浓度1×109/L,置37℃温箱静置培养,次日更换一次培养液,继续培养,观察生长情况。若细胞密度较高,及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中,并加入培养基贴壁培养12~24小时后,充去上清,换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量,如果冻存数量为106,则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高,生

金相显微镜的使用方法、注意事项和维护

金相显微镜的使用方法、注意事项和维护 金相显微镜主要用于鉴定和分析金属内部结构组织,它是金属学研究金相的重要仪器,是工业部门鉴定产品质量的关键设备,该仪器配用摄像装置,可摄取金相图谱,并对图谱进行测量分析,对图象进行编辑、输出、存储、管理等功能。 1.1使用说明 (1)将光源插头接上电源变压器,然后将变压器接上户内220V 电源即可使用。照明系统在出厂前已经经过校正。 (2)每次更换灯泡时,必须将灯座反复调校。灯泡插上灯座后,在孔径光栏上面放上滤色玻璃,然后将灯座转动及前后调节,以使光源均匀明亮地照射于滤色玻璃上,这样,灯泡已调节正确,这时则将灯座的偏心环转动一个角度,以便将灯座紧固于底盘内。灯座及偏心环上有红点樗,如卸出时,只要将红点相对即可。 (3)观察前原则上要装上各个物镜。在装上或除下物镜时,须把载物台升起,以免碰触透镜。如选用某种放大倍率,可参照总倍率表来选择目镜和物镜。 (4)试样放上载物台时,使被观察表面复置在载物台当中,如果是小试样,可用弹簧压片把它压紧。

(5)使用低倍物镜观察调焦时,注意避免镜头与试样撞击,可从侧面注视接物镜,将载物台尽量下移,直至镜头几乎与试样接触(但切不可接触),再从目镜中观察。此时应先用粗调节手轮调节至初见物像,再改用细调节手轮调节至物像十分清楚为止。切不可用力过猛,以免损坏镜头,影响物像观察。 当使用高倍物镜观察,或使用油浸系物镜时,必须先注意极限标线,务必使支架上的标线保持在齿轮箱外面二标线的中间,使微动留有适当的升降余量。当转动粗动手轮时,要小心地将载物台缓缓下降,当目镜视野里刚出现了物像轮廓后,立即改用微动手轮作正确调焦至物像最清晰为止。 (6)使用油浸系物镜前,将载物台升起,用一支光滑洁净小棒蘸上一滴杉木油,滴在物镜的前透镜上,这时要避免小棒碰压透镜及不宜滴上过多的油,否则会弄伤或弄脏透镜。 (7)为配合各种不同数值孔径的物镜,设置了大小可调的孔径光栏和视场光栏,其目的是为了获得良好的物像和显微摄影衬度。当使用某一数值孔径的物镜时,先对试样正确调焦,之后,可调节视场光栏,这时从目镜视场里看到了视野逐渐遮蔽,然后再缓缓调节使光栏孔张开,至遮蔽部分恰到视场出现时为止,它的作用是把试样的视野范围之外的光源遮去,以消除表面反射的漫射散光。

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