藏绵羊DNA分子遗传标记的研究进展
收稿日期:2006-07-03 修回日期:2006-09-29 基金项目:青海省科技厅基础研究与软科学计划项目(项目编号:2006-Z -601)作者简介:马志杰(1978~),男,硕士,助理研究员,研究方向:动物遗传育种与繁殖,E-m ai:l m azi w i se @yahoo .ci n .cn
藏绵羊DNA 分子遗传标记的研究进展
马志杰1
,魏雅萍1
,钟金城2
,马玉红
1
(1 青海省畜牧兽医科学院畜牧研究所,西宁810016;2 西南民族大学生命科学与技术学院)
摘要:分析讨论了藏绵羊DNA 分子遗传标记在其遗传育种研究中的应用现状和存在的问题,展望了其今后的研究趋势和发展前景。
关键词:藏绵羊;
DNA 分子标记
中图分类号:Q 78 文献标识码:A 文章编号:1000-7083(2007)03-0718-04
Progress on DNA M olecularM arkers of T ibet Sheep
MA Zh -i ji e 1
,W E I Ya -p i n g 1
,ZHONG Jin -cheng 2
,MA Yu -hong
1
(1.Institute of A ni m a l Sc i ence ,Q i ngha iA cademy o f A ni m a l Sc i ence and V ete ri nary M ed ici ne ,X ini ng 810016;
2.Co llege of L ife Science &T echno l ogy ,Sou t hwest U niversity for N ationa lities) Abstract :The present situa tion on the d iffe rent m o lecu l ar ma rkers (RFLP ,RAPD,
SSR,SSCP ,
S N Ps ,etc )i n T i bet
sheep g enetic and breedi ng has done w it h syste m atic d i scuss i on and ana l ysis ,and has probed i nto research trend and deve l op -m ent prospect based on the current s it uation and ex i sti ng proble m. K ey word s :T i bet sheep ;DNA m o l ecular m arke r DNA 分子标记作为遗传标记之一,是对基因水平上遗传
变异的直接反映。与形态遗传标记、细胞遗传标记以及生化遗传标记相比,它具有在物种基因组中存在普遍、多态性丰富、遗传稳定和准确性高等特点。因此,已被广泛应用于遗传作图、基因定位、基因连锁分析、动植物标记辅助选择和物种的起源、演化和分类等研究。目前,已有部分DNA 分子标记被运用于藏绵羊的遗传育种研究当中。通过了解各种分子标记在藏绵羊遗传育种中的研究现状,并分析比较各种分子标记在藏绵羊科研中的可行性和优缺点,可为今后开展藏绵羊的基因定位、分子标记辅助选择以及起源、演化和分类等研究提供必要的理论指导和经验借鉴,将大大加快藏绵羊分子育种进程。本文分析了藏绵羊DNA 分子遗传标记的研究现状,提出了建议和看法,以便为今后的研究奠定理论基础提供参考资料。
1 藏绵羊DNA 分子标记的研究进展
藏绵羊分子遗传标记的研究起始于20世纪90年代后期,对其m t DNA 标记的研究相对较多。涂正超等[1]首次采用Apa 、A va 、Ba mH 、B cl 、C la 、E coR I 、EcoR 、H ind 、H p a 、K pn 、Ps t 、Pvu 、X ba 、X ho 等14种限制性内切酶对12只藏绵羊m t DNA 进行了多态性分析,结果共检
测出35个酶切位点,发现A va 、C la 、Pvu 3种酶切类型具有多态性。根据不同个体的m t DNA 酶切类型,表明藏绵羊存在3种m t DNA 单倍型,m t D NA 多态度 值为0 0012,说明藏绵羊m t DNA 多态性比较贫乏。在探讨绵羊的起源问题上,成述儒等
[2]
对包括藏绵羊在内的143只中国家养绵羊(9个
群体,包括甘肃高山细毛羊、甘肃藏羊、甘南藏羊、青海细毛
羊、岷县黑裘皮羊、小尾寒羊、滩羊、湖羊和青海藏羊)m t DNA D-环部分序列进行了PCR 扩增测序,获得1个长度为723bp 的序列(含5个75bp 的重复单元),137个长度为648bp 的序列(含4个75bp 的重复单元),5个长度为573bp 的序列(含3个75bp 的重复单元)。由此他们认为,含有4个重复单元是家养绵羊m t DNAD-环的特征,m t DNA 序列长度的变异主要是由于重复区重复单元次数的不同造成。对137个含有4个重复单元的序列进行分析,发现157个变异位点,占研究位点的24 22%。A 、T 、G 、C 含量分别为35 67%、27 85%、13 84%和22 64%。137个序列共发现96个单倍型,单倍型比例为70 07%,显示中国家养绵羊具有丰富的m t DNA D-环序列多态性。96个单倍型序列系统发育树呈现出3个明显分支,网络分析也分为明显的3支,因此认为中国家养绵羊有3个母系起源。从G enbank 获得的91个绵羊D-环序列和中国的96个绵羊D-环单倍型序列进一步研究表明,摩佛伦(M oufl on)与中国绵羊具有较近的亲缘关系,但没发现羱羊、盘羊和东方盘羊对中国和蒙古绵羊起源有贡献的证据。与此同时,罗玉柱等[3]也对包括藏绵羊在内的中国和蒙古共20个绵羊群体(包括湖羊、甘肃藏羊、滩羊、青海藏羊、青海细毛羊、小尾寒羊、岷县黑裘皮羊、甘南藏羊、甘肃高山细毛羊、D arkhad 、Bayad 、Sa rt uul 、Suta i 、K e re i d 、G ob -i A lta i 、Ba i drag 、T a m ir 、K ho t ont 、Barg a 、U ze m chin)、314只绵羊m t DNA D -环的部分序列进行了测定。结果表明:中国绵羊和蒙古绵羊m t D-NA D -环区的部分序列中A 、T 、G 、C 含量没有明显的差别;蒙古绵羊的多态位点数(26 85%)略高于中国绵羊(24 22%);中国绵羊群体的单倍型多样度在青海藏羊、甘肃藏羊、甘南藏羊、甘肃高山细毛羊、青海细毛羊、小尾寒羊和滩羊群体中
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较高,但在湖羊和岷县黑裘皮羊中较低;蒙古绵羊的单倍型多样度在Bayad和Ba i drag群体中最高,但在G ob i A lta i群体中最低。从总体上看,蒙古绵羊的遗传多样性要略高于中国绵羊。217个中国和蒙古绵羊的单倍型序列的系统发生分析表明,中国和蒙古绵羊均有3个母系起源,即A、B和C3类主要的单倍型。其中A类单倍型在所有中国绵羊群体及绝大多数蒙古绵羊群体中占优势,平均比例为58 73%;B类单倍型居中,为24 68%;C类单倍型最少,仅为16 59%。从G enBank中获得的91个绵羊D-环区序列与中国和蒙古绵羊D-环区的单倍型进行网络关系分析表明,欧洲摩弗仑羊与中国和蒙古绵羊具有较近的亲缘关系,没发现羱羊、盘羊和东方盘羊对中国和蒙古绵羊起源有贡献的证据。李祥龙[4]利用H i nf 、M sp 、Sau3A 、X sp 、T aq 等5种限制性内切酶采用PCR-RFLP技术研究了包括藏绵羊在内的我国9个地方绵羊品种(包括藏绵羊、乌珠穆沁羊、蒙古羊、哈萨克羊、阿勒泰羊、小尾寒羊、滩羊、湖羊和同羊)和2个引入品种(包括无角道赛特羊和德国美利奴羊)共计83只绵羊个体线粒体DNA D-l oop区多态性。结果表明,中国主要地方绵羊品种线粒体DNA D-l oop区存在两种基本单体型,提示我国主要地方绵羊品种起源于两个母系祖先。线粒体DNA D-l oop区多态度为0 0421%,说明我国地方绵羊品种线粒体DNA多态度较为贫乏。以上研究表明,由于m t DNA分子量小、进化速度快、遗传自主、无组织特异性及严格的母系遗传等特性,近年来已被广泛用于藏绵羊与其近缘种间及种内群体间遗传多态性丰富程度的检测研究。
由于PCR-RFLP标记独特的优点,近年来也被运用于藏绵羊核内基因的分子标记研究。熊勇[5]对藏绵羊ZFX/ZFY 基因ex tron11中463bp部分片段进行了克隆与序列测定,并构建物种间分子系统发生树。结果发现在藏绵羊该序列内一A va 酶切位点可对藏绵羊进行性别鉴定,该位点在雌性中酶切产生2条带而在雄性中产生3条带。序列比较分析表明,同一种属或品种内ZFY在进化过程中较ZFX更活跃。分子系统进化关系分析表明藏绵羊与摩弗伦羊亲缘关系最近,而与马、猪等其他物种较远。袁烈[6]对藏绵羊和藏山羊ZFX/ZFY基因i n tron10部分片段进行了克隆与序列分析,并构建分子系统发生树。结果表明在藏山羊和藏绵羊该基因intron10的976bp序列中ZFY基因序列内存在一Pvu 酶切位点,而ZFX序列内无该酶切位点,因此该酶切位点也可对藏绵羊、藏山羊进行性别鉴定。藏绵羊与藏山羊等其它物种序列比较分析表明,同一种属或品种内ZFY的碱基替换率高于ZFX,ZFY在进化过程中较ZFX更活跃。N J法构建的分子系统树表明,应用ZFY内含子构建的进化树可用于种、属间的分类,用ZFX内含子构建的进化树可对亚科级物种的进化进行分类。
在RA PD标记研究方面,巩元芳等[7]对藏绵羊、蒙古羊、湖羊、滩羊、小尾寒羊、乌珠穆沁羊、阿勒泰羊7个我国地方绵羊品种和无角陶赛特羊、德国美利奴羊、萨福克羊3个引入品种进行了RA PD多态性分析。结果表明: RAPD可作为一种有效的标记用于绵羊品种之间遗传亲缘关系分析。 在所使用的43种随机引物中,有35种引物扩增出多态谱带,多态频率为66 24%,说明RAPD技术用于研究绵羊核DNA的遗传变异具有较高的检出率和灵敏度。 总群体平均遗传多样性指数(H sp)为0 9139,说明绵羊群体具有较为丰富的遗传多样性。 我国地方绵羊品种间的分子聚类关系与其所处的地理位置、考古学结果,以及细胞遗传学研究结果基本一致,引入品种间的分子聚类关系也与其育成史基本一致。李祥龙[8]利用10种10碱基随机引物对我国藏绵羊等8个地方绵羊品种进行了RA PD多态性分析。结果表明,我国地方绵羊品种基因组DNA多态位点百分率为81 36%,群体平均遗传多样性指数为1 3370,表明具有丰富的群体遗传多样性。但藏绵羊、小尾寒羊、滩羊和蒙古羊群体遗传多样性程度较低。群体遗传分化指数为0 9172,说明遗传变异主要存在于群体间。品种间的分子聚类关系基本上反映了品种间的遗传亲缘关系,与品种的形成历史及我国地方绵羊的起源进化学说基本一致,具有相同来源的蒙古羊、乌珠穆沁羊、小尾寒羊和湖羊的分子聚类关系表明,4个地方绵羊品种间已经有了明显的遗传分化,小尾寒羊、乌珠穆沁羊间遗传分化较低,湖羊与蒙古羊之间相对较高,而小尾寒羊和乌珠穆沁羊与湖羊和蒙古羊之间的遗传分化最高。肖玉萍等[9]应用6个RA PD引物对藏绵羊、牦牛和果蝇3个物种的亲缘关系进行了初步分析,结果表明藏绵羊物种内的遗传多样性较牦牛物种内的遗传多样性高;根据RA PD标记聚类的结果能反映3个物种的分子进化关系,表明RAPD标记可用与物种间亲缘关系的分析研究。朱金秋等[10]也从80个随机引物中筛选出30个重复性好的引物对藏绵羊和四川黑山羊、南江黄羊、北川白山羊、成都麻羊4个山羊品种进行了RA PD分析,并对13只南江黄羊个体,18只黑山羊个体的基因组DNA进行PCR扩增。N e i氏遗传距离计算和U PGM A 法聚类图结果表明:黑山羊与南江黄羊的遗传距离最小,亲缘关系较近;藏绵羊与各品种间的遗传距离都很大,亲缘关系远。表明RAPD技术可作为一种有效的分子标记用于山羊品种间以及和其他物种的遗传亲缘关系研究。此外,杨晓军等[11]以青海和甘肃省分布的8个藏系绵羊群体为对象对其进行了RAPD标记分析。结果表明,藏系绵羊总群体具有丰富的遗传多样性,其中群体内遗传多样性平均为0 37,总群体平均遗传多样性指数为1 51;遗传多样性75 15%分布在品种群间,24 15%分布在品种群内。现有藏系绵羊可划分为高原草地型和山谷草地型两大类群。RAPD标记方面的研究说明,该标记可作为一种有效的标记用于藏绵羊等品种(群体)内以及与绵羊品种(群体)间遗传亲缘关系的分析, RA PD技术用于绵羊核DNA的遗传变异研究具有较高的检出率和灵敏度。
在微卫星标记研究方面,李祥龙[12]利用15个微卫星标记对我国藏绵羊、乌珠穆沁羊、哈萨克羊、阿勒泰羊、滩羊和蒙古羊6个地方绵羊品种微卫星多态性进行了研究,结果表明,微卫星标记不同位点间遗传多样性差异极显著(P< 0 01),群体间多态信息含量(P IC)、近交程度(F is)和观察杂合度(O bs H et)差异不显著,但基因多样性(g ened i ve rsity)和期望杂合度(Exp H et)差异显著(P<0 05)。所研究的我国6个地方绵羊品种与欧洲品种具有相似的遗传多样性,但
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具有较高的近交系数。个体和群体的聚类分析结果提示我国地方绵羊品种可能起源于两类祖先。群体间的聚类分析结果还表明,蒙古羊与乌珠穆沁羊分化不明显且具有较近的遗传亲缘关系,蒙古羊与藏绵羊间分化明显且具有较远的遗传亲缘关系。滩羊、阿勒泰羊以及藏绵羊间也具有较近的遗传亲缘关系。所研究的我国6个地方绵羊品种的遗传分化(F st)与西班牙绵羊品种接近,但明显小于欧洲其他绵羊品种。杨燕等[13]也利用26个微卫星标记对我国7个地方绵羊品种的遗传多样性进行了分析。计算了基因频率、平均杂合度(H)、多态信息含量(P IC)及有效等位基因数(N e),并根据N e i氏标准遗传距离利用U PGM A法进行了聚类分析。结果表明:26个微卫星位点共检测到278个等位基因,N e在2 1288~13 3924之间;以等位基因频率为基础,得出位点的平均杂合度在0 0629~0 5903之间,品种平均杂合度在0 3633~0 4489之间。26个位点均为高度多态位点,P IC在0 6628~0 8712之间。聚类分析表明,哈萨克羊、阿勒泰羊和巴音布鲁克羊遗传关系最近;然后与白藏羊、黑藏羊聚为一类;湖羊和晋中羊聚为一类。各绵羊品种的聚类关系与其来源、育成史及地理分布基本一致。上述研究结果证实微卫星标记可用于绵羊品种的遗传多态性分析。同时,也说明微卫星标记能够揭示绵羊品种间和品种内的遗传变异关系,进行品种的分类研究。
SNP s标记是一种发生在物种m t D NA或核基因组序列单链上的DNA变异,该变异可通过DNA序列测序检测。同时,由于SNP s在基因组中比微卫星更为普遍且通常位于所研究基因内(如cS N P)或接近研究基因位点位置,这便使其可能影响基因表达水平和蛋白结构的功能机制研究成为可能。基于以上优点,S N Ps标记也被逐渐运用于藏绵羊遗传育种研究当中。李祥龙等[14]最早利用测序及变性高效液相色谱(DHPLC)法研究了藏绵羊、哈萨克羊、滩羊和蒙古羊黑素细胞刺激素受体(M S HR)基因SNP多态性。结果表明,在扩增的415bp片断长度范围内存在一个T317C突变,且发现DH-PLC可检测到该突变并被证明是一种高通量且简便的筛选方法。所研究的4个绵羊群体在该突变位点均处于H ardy-W e i nbe rg平衡状态。蒙古羊与哈萨克羊较近的遗传亲缘关系以及滩羊与藏绵羊较近的遗传亲缘关系与微卫星DNA的研究结果一致。高爱琴等[15]采用PCR-SSCP技术对包括藏绵羊在内的4个绵羊品种FGF5基因多态性进行了SNP分析。结果表明:FGF5基因外显子1用引物1扩增的产物存在一G T突变,该突变位点导致编码的氨基酸发生A S的改变;而用引物2扩增的产物发现一C T碱基突变,属同义突变。在对不同绵羊品种的基因型和基因频率统计分析中,引物1扩增产物小尾寒羊、湖羊、藏羊以等位基因A为主,而中国美利奴羊则以等位基因B为主,且各群体均处于H ardy-W e i nbe rg平衡;而引物2扩增产物小尾寒羊、湖羊、中国美利奴羊均以等位基因D为主,藏羊以等位基因E为主,且藏羊的基因型频率与其它品种有显著差异,中国美利奴羊在引物2位点的基因频率处于H ardy-W e i nberg不平衡状态。以上研究为不同绵羊品种毛用性状的研究提供了一定的分子基础,同时,也为揭示不同绵羊品种的遗传多样性差异提供了理论基础。
从以上藏绵羊各种DNA分子遗传标记的研究现状可以看出,目前有关藏绵羊DNA分子遗传标记的研究可概括为以下几点: PCR-R FLP、RA PD、SSR、PCR-SSCP、S N P s、m t D NA 等DNA分子遗传标记已被运用于藏绵羊品种内以及与其它绵羊品种间的遗传多样性分析以及其起源、演化和分类研究。 在研究当中,涉及了各种分子标记技术在藏绵羊以及其它绵羊品种中的方法应用探索。 研究的范围正在逐步拓宽,即各种分子标记不仅被用于核外基因组的多态性分析,也逐渐渗入核基因组功能基因的多态性检测。 部分分子标记不仅被用于藏绵羊与其它本地或引进绵羊品种的起源、驯化和分类研究,而且被用于探究与其他物种(如山羊、牦牛、马、猪等)的分子进化关系。 部分分子标记(如PCR-SSCP标记和SNP s标记)已被用于藏绵羊一些经济性状功能基因的多态性检测研究。 随着各种分子标记技术的应用,藏绵羊和其它物种特别是近缘种间的比较基因组学研究正在逐步开展并加深。
2 展望
综上所述,DNA分子标记在藏绵羊遗传育种研究中已渗透到以下研究领域: 藏绵羊品种的起源、演化和分类研究; 藏绵羊与其它绵羊品种间及与其它近缘种间的亲缘关系和分子进化分析; 藏绵羊经济性状功能基因的克隆和多态性研究等。可以看出,DNA分子标记技术的应用使藏绵羊品种的起源、演化和分类研究以及藏绵羊种间和种内亲缘关系鉴定更为深入。而对藏绵羊经济性状功能基因的克隆、多态性研究以及经济性状功能基因的多态性与生产性能的相关分析等研究,目前还处于刚起步阶段,开展较少。因此,笔者认为,利用分子生物学技术对藏绵羊经济性状主基因的研究可能将是今后研究的重点,有必要加大藏绵羊经济性状主基因效应的分析,进而加大各经济性状主基因的分子生物学研究力度,从而为藏绵羊分子育种的开展提供必要的前提。可以相信,随着DNA分子标记技术在藏绵羊科学研究中的应用,藏绵羊经济性状功能基因的克隆、定位、表达调控以及分子标记辅助选育研究将会得到更深入的开展。
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阴道毛滴虫铁氧还蛋白与甲硝唑抵抗的研究进展
朱晓燕1,谢辉2综述 王雅静1*审校
(1.四川大学华西基础医学与法医学院寄生虫学教研室,成都610044;2 郑州市第五人民医院检验科)
摘要:氢化酶体是阴道毛滴虫重要的代谢器官,该器官内存在的铁氧还蛋白不仅是虫体代谢过程中主要的电子传递介体,而且也在甲硝唑的激活中起关键作用。近年来阴道毛滴虫的甲硝唑抵抗株在临床和实验室都有报道,实验研究发现活化药物的铁氧还蛋白减少或缺失,因此对铁氧还蛋白与甲硝唑抵抗的相关性研究越来越受到医学及药学界的重视。本文总结近年来该领域的研究成果及发展动态,以期对滴虫药物抵抗的发生机制以及滴虫病防治的研究提供有价值的资料。
关键词:阴道毛滴虫铁氧还蛋白;甲硝唑抵抗;研究进展
中图分类号:R382 文献标识码:A 文章编号:1000-7083(2007)03-0721-04
Research Advances of R elations hip bet ween Ferredoxin of Tricho m onas vag i n alis
and R esistance toM etronidazole
Z HU X iao-yan1,X I E H u i2,WANG Ya-jing1
(1 D epart ment o f P aras it o logy,W est China Schoo l o f P recli n i ca l and Forens i c M edicine,S ichuan U n i versity,
Chengdu610044;2 D epart m ent of C li n ica l L aboratory,F ifth P eop l e s H osp ital of Zhengzhou)
Abstrac t:H ydrogenosom e i s a si gn ifi cantm e tabolic o rgan of T richo m onas vaginalis and ha rbo rs a k i nd o f prote i n ca lled ferredox i n,wh i ch is not noly key electron transport med i u m but a lso plays a critica l role i n t he reducti ve acti vation o f m e-t ronidazo le In recent yea rs,there are m any reports about me tron i dazo l e-resistant iso l a tes of T vaginalis i n c li n i c and labora-tory.Em pirical studys d i scover ferredox in decreases or loses i n m etroni dazo le-resi stant iso lates,t herefore,mo re and mo re researchers pay close attention to the re l a ti onsh i p bet w een ferredox in and res i stance to m etronidazo le T he paper rev i ew s re-l evant researches and d i scusses the current status,wh i ch prov i des va l uab l e i nfor m ation to the drug-resistant mechan i s m of T vag i nalis,prevention and trea t m ent to trichomon i asis
K ey word:fe rredox i n of T richo m onas vaginalis;resistance to m etron i dazo l e;research advance
阴道毛滴虫(T richo m onas vag i nalis)是寄生在人体泌尿生殖道的一种常见病原体,可引起阴道毛滴虫病(T r i chom on-i as i s),该病是严重威胁人类健康的主要性传播疾病(sexua lly trans m itted d i sease,STD)之一,并且也是影响其它STD流行的一个重要危险因素[1]。阴道毛滴虫的氢化酶体中存在[2F e-2S]铁氧还蛋白(ferredox i n,Fd)。作为最原始的真核生物,阴道毛滴虫缺乏线粒体,其特有的双层膜结构氢化酶体为虫体的主要代谢器官,它是丙酮酸盐氧化脱羧,ATP形成的场所:铁氧还蛋白氧化还原酶(py ruva te:ferredox i n ox-i doreductase,PFOR)介导丙酮酸盐氧化脱羧形成乙酰辅酶A 和CO
2
,并且伴随ATP的产生,在这个反应途径中释放的电子从PFOR传递到F d,在氢化酶催化下氢离子接受F d传递
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分子标记
分子标记 3分（内容丰富） 编辑词条 分子标记技术在搜搜百科中为本词条的同义词，已为您做自动跳转。 摘要 Molecular Markers 【分子标记的概念】 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。 【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern
分子遗传学名词解释
2014分子遗传学复习 一、名词解释 1、结构基因（Structural gene）：可被转录形成mRNA，并进而翻译成多肽链，构成各种结构蛋白质，催化各种生化反应的酶和激素等。 2、调节基因（Regulatory gene）：指某些可调节控制结构基因表达的基因，合成阻遏蛋白和转录激活因子。其突变可影响一个或多个结构基因的功能，或导致一个或多个蛋白质（或酶）量的改变。 3、基因组(genome)：基因组（应该）是整套染色体所包含的DNA分子以及DNA 分子所携带的全部遗传指令。或单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部DNA或RNA。 4、C值悖理(C-v a l u e p a r a d o x)：生物基因组的大小同生物在进化上所处的地位及复杂性之间无严格的对应关系，这种现象称为C值悖理(C——value paradox)。 N值悖理（N-v a l u e p a r a d o x）：物种的基因数目与生物进化程度或生物复杂性的不对应性，这被称之为N（number of genes）值悖理(N value paradox)或G（number of genes）值悖理。 5、基因家族(gene family)：由同一个祖先基因经过重复(duplication)与变异进化而形成结构与功能相似的一组基因，组成了一个基因家族。 6、孤独基因（orphon）：成簇的多基因家族的偶尔分散的成员称为孤独基因（orphon) 。 7、假基因(pseudogene): 多基因家族经常包含结构保守的基因，它们是通过积累突变产生，来满足不同的功能需要。在一些例子中，突变使基因功能完全丧失，这样的无功能的基因拷贝称为假基因，经常用希腊字母表示 8、①卫星DNA（Satellite DNA）：是高等真核生物基因组重复程度最高的成分，由非常短的串联多次重复DNA序列组成。 ②小卫星DNA(Minisatellite DNA) ：一般位于端粒处，由几百个核苷酸对的单元重复组成。 ③微卫星DNA (Microsatellite DNA)：由2－20个左右的核苷酸对的单元重复成百上千次组成。 ④隐蔽卫星DNA(cryptic satellite DNA)：用密度梯度离心分不出一条卫星带，但仍然存在于DNA主带中的高度重复序列 9、DNA指纹(DNA fingerprints)：小卫星DNA是高度多态性的，不同个体，各自不同。但其中有一段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”，如果把核心序列串联起来作为探针，与不同个体的DNA进行分子杂交，就会呈现出各自特有的杂交图谱，它们和人的手纹一样，具有专一性和特征性，因个体而异，因而称为“DNA指纹”。 10、超基因(super gene) ：是指真核生物基因组中紧密连锁的若干个基因座，它们作用于同一性状或一系列相关性状。 超基因家族（supergene family）：是DNA序列相似，但功能不一定相关的若干个单拷贝基因或若干组基因家族的总称。 11、单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)：主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA顺序多态性。它是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90％以上。 12、遗传标记（Genetic marker）：可示踪染色体、染色体片段、基因等传递轨
DNA分子标记技术及其应用
DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；
分子标记技术综述
分子标记技术及其在植物药材亲缘关系鉴定中的应用 分子标记技术 分子标记（Molecular Markers）是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映[1]。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有极大的优越性：大多数分子标记为共显性，对隐性性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速[2]。 技术种类及原理 分子标记技术自诞生起已研究出数十种，尽管方法差异显著，但都具有一个共同点，即用到了分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）、电泳等检测手段。应用较为广泛的技术有以下几种： 1.限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphisms，RFLP） RFLP是最早开发的分子标记技术，指基因型间限制性内切酶位点上的碱基插入、缺失、重排或突变引起的，是由Grodzicker等于1974年创立的以DNA-DNA杂交为基础的遗传标记。基本原理是利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况[3]。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern 杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点，可靠性高，不受环境、发育阶段或植物器官的影响。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个，标记结果稳定，重复性好。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，RFLP分析工作量大，成本高，使用DNA量大，使用放射性同位素和核酸杂交技术，不易自动化，尽管结合PCR技术，RFLP仍在应用，但已不再是主流分子标记。 2.随机扩增多态性DNA（Random Amplification Polymorphism，RAPD） RAPD技术是1990年由William和Welsh等人利用PCR技术发展的检测DNA多态性的方法，其基本原理是利用随机引物（一般为8—10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生DNA片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性[4]。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD可用于对整个基因组DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。 与RFLP技术相比，RAPD技术操作简便快速，省时省力，DNA用量少，同时无需设计特定的引物，扩增产物具有丰富的多态性。但RAPD也存在一些缺点：(1)RAPD标记是一个显
分子标记遗传图谱的构建方法---完整
分子标记遗传图谱的构建 检测出的每个分子标记反映的都是相应染色体座位上的遗传多态性状态。为了有效地分析利用分子标记所提供的遗传信息，人们希望知道不同分子标记在染色体上的相对位置或排列情况，也就是要构建分子标记的遗传连锁图谱。利用DNA标记构建遗传连锁图谱在原理上与传统遗传图谱的构建是一样的。其基本步骤包括：选择适合作图的DNA标记；根据遗传材料之间的DNA多态性，选择用于建立作图群体的亲本组合；建立具有大量DNA标记处于分离状态的分离群体或衍生系；测定作图群体中不同个体或株系的标记基因型；对标记基因型数据进行连锁分析，构建标记连锁图。至今为止，已构建了许多植物的高密度分子标记连锁图。本章侧重介绍利用DNA标记构建分子遗传连锁图谱的原理与方法。 第一节作图群体的建立 要构建DNA标记连锁图谱，必须建立作图群体。建立作图群体需要考虑的重要因素包括亲本的选配、分离群体类型的选择及群体大小的确定等。 一、亲本的选配 / 亲本的选择直接影响到构建连锁图谱的难易程度及所建图谱的适用范围。一般应从四个方面对亲本进行选择，首先要考虑亲本间的DNA多态性。亲本之间的DNA多态性与其亲缘关系有着密切关系，这种亲缘关系可用地理的、形态的或同工酶多态性作为选择标准。一般而言，异交作物的多态性高，自交作物的多态性低。例如，玉米的多态性极好，一般自交系间配制的群体就可成为理想的RFLP作图群体；番茄的多态性较差，因而只能选用不同种间的后代构建作图群体；水稻的多态性居中，美国康乃尔大学实验室1988年发表的RFLP连锁图谱是以籼稻和爪哇稻之间的杂交组合为基础构建的（McCouch et al. 1988）。在作物育种实践中，育种家常将野生种的优良性状转育到栽培种中，这种亲源关系较远的杂交转育，DNA 多态性非常丰富。第二，选择亲本时应尽量选用纯度高的材料，并进一步通过自交进行纯化。第三，要考虑杂交后代的可育性。亲本间的差异过大，杂种染色体之间的配对和重组会受到抑制，导致连锁座位间的重组率偏低，并导致严重的偏分离现象，降低所建图谱的可信度和适用范围；严重的还会降低杂种后代的结实率，甚至导致不育，影响分离群体的构建。由于各种原因，仅用一对亲本的分离群体建立的遗传图谱往往不能完全满足基因组研究和各种育
分子标记与植物遗传改良
第6讲分子标记与植物遗传改良 一、分子标记在植物遗传研究中的应用p1 二、分子标记在植物育种中的应用p4 三、DNA分子标记的原理p11 四、质量性状的分子标记p25 (p1-14, p15-32) 一、分子标记在植物遗传研究中的应用 分子标记是指一类在分子水平（多为DNA）上的具有多态性的遗传标记。1980年RFLP 作为新型遗传标记首次被提出，开创了直接应用DNA变异的新阶段。分子标记技术多种多样，各具特点，在实际中应根据需要和条件来选用。从植物遗传改良的角度来看，技术难度较小、使用成本较低且准确度又较高的分子标记将更易于为人们所接受。总之，随着多种类型分子标记的发展，分子标记技术将在植物遗传研究中得到越来越广泛的应用。 （一）分子标记连锁图的构建 近年来，农作物基因组和分子生物学研究取得了巨大进展，构建了许多高密度的分子标记连锁图。 早在1988年，美国Cornell大学即用一个50株的籼粳亚种间F2群体（IR34583/Bulu Dalum）构建了第1张水稻RFLP连锁图。 1994年底，Cornell大学和日本水稻基因组研究组（RGP）同时发表了各自构建的高密度水稻分子标记连锁图。前者的作图群体为113株的野-栽回交群体（Oryza sativa/ O. longistaminata// O. sativa）。图谱全长1491cM，共含726个分子标记，其中多为基因组DNA 克隆，标记间平均距离2cM。后者是利用186株籼粳亚种间F2群体构建而成，全长1575cM，共含1383个分子标记，其中cDNA克隆883个，基因组DNA克隆265个，RAPD标记147个。（基因的遗传距离以图距为单位，1个图距单位相当于1%的重组率。cM：一种度量重组概率的单位。在生殖细胞形成的减数分裂过程中，常常会发生同源染色体之间的交叉现象，如果两个标记之间发生交叉重组的概率为1％，那么它们之间的距离就定义为1cM。对人类基因组，1cM大致相当于1Mbp。水稻基因组的大小估计为430Mb，是禾谷类作物基因组中最小的，大约为人基因组大小的1/7，）为了使两张图能相互参照，信息通用，华中农业大学从两张图中选出了400多个RFLP
分子遗传(名词解释及简答)
名词、简答（依据ppt） 一、基因表达调控 1.基因(Gene) 遗传的基本单位，含有编码一种RNA，大多数情况是编码一种多肽的信息单位； 负载特定遗传信息的DNA片段，其结构包括由DNA编码序列、非编码调节序列和内含子组成的DNA区域。 2.基因表达(gene expression) 从DNA到蛋白质的过程。 对这个过程的调节即为基因表达调控(regulation of gene expression)。 3.基因表达的特点 时间特异性——发育阶段特异性 空间特异性——组织细胞特异性 4.基因表达调控的概念 机体各种细胞中含有的相同遗传信息(相同的结构基因)，根据机体的不同发育阶段、不同的组织细胞及不同的功能状态，选择性、程序性地表达特定数量的特定基因的过程。 5.基因表达的方式 1）组成性表达(constitutive expression):基因较少受环境因素影响，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。如管家基因 ★管家基因(housekeeping gene)：某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达。 2）诱导和阻遏表达 诱导表达(induction expression)——在特定环境信号刺激下，基因表现为开放或增强，表达产物增加。 阻遏表达(repression expression)——在特定环境信号刺激下，基因被抑制，从而使表达产物减少。 6.基因表达调控的意义 1）以适应环境、维持生长和增殖 2）以维持细胞分化与个体发育 7.原核生物基因表达的调控 8、真核生物基因表达的调控——多层次和复杂性 ★转录前水平：染色体丢失、基因扩增、基因重排、DNA的甲基化、 组蛋白修饰、染色质结构
分子标记技术
分子标记技术 摘要：分子标记技术就是利用现代分子生物学基础分析DNA分子特性，并借助 一些统计工具，将不同物种或同一物种的不同类群区分开来，或者将生物体的某些性状与DNA分子特性建立起来的关联关系，已广泛应用于植物遗传与育种研究的众多领域，包括遗传图谱的构建、遗传多样性分析、物种起源与进化、品种资源与纯度鉴定、分子辅助育种等多个方面，具有重大作用。 关键词：分子标记技术原理RFLP RAPD SSR AFLP EST SNP TRAP 分子标记技术应用 引言 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 一．常用分子标记原理 分子标记技术的种类根据不同的核心技术基础，DNA分子标记技术大致可分为三类: 第一类以Southern杂交为核心, 其代表性技术为RFLP；第二类以PCR 技术为核心，如RAPD、SSR、AFLP、STS、SRAP、TRAP等；第三类以DNA序列(mRNA 或单核苷酸多态性)为核心，其代表性技术为EST标记、SNP标记等。理想的分子标记应达到以下的要求：①具有高的多态性；②共显性遗传；③能够明确辨别等位基因；④分布于整个基因组中；⑤选择中性(即无基因多效性)；⑥检测手段简单、快速；⑦开发成本和使用成本尽量低廉；⑧在实验室内和实验室间重复性好。目前，没有任何一种分子标记均满足以上的要求，它们均具有各自的优点和不足。其特点比较见表一。 1．限制性内切酶片段长度多态性标记（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP） 1974年，Grozdicker 等人鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时，发现了经限制性内切酶酶解后得到的DNA片段产生了差异，由此首创了第一代DNA 分子标记技术——限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP)。其原理是由于不同个体基因型中内切酶位点序列不同(可能由碱基插入、缺失、重组或突变等造成)，利用限制性内切酶酶解基因组DNA时，会产生长度不同的DNA酶切片段，通过凝
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记 1.分子标记技术及其定义 1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。 2.分子标记技术的类型 分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。 2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术 (1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记； (2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。 2.2 以重复序列为基础的分子标记技术 (1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA； (2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA; (3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。 2.3 以PCR为基础的分子标记技术 (1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA； (2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性； (3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性； (4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性； (5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性； (6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域； (7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。 2.4以mRNA为基础的分子标记技术
分子标记种类及概述
分子标记概述 遗传标记主要有四种类型: 形态标记（morphological marker）、细胞标记（cytological markers）、生化标记（Biochemical marker）和分子标记（molecular marker）。分子标记是其中非常重要的一种，他是以个体间遗传物质核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA 水平遗传多态性的直接的反映。 早在1923年，Sax等就提出利用微效基因与主基因的紧密连锁，对微效基因进行选择的设想。但由于形态标记数目有限，而且许多标记对育种家来说是不利性状，因而难以广泛应用。细胞标记主要依靠染色体核型和带型，数目有限。同工酶标记在过去的二、三十年中得到了广泛的发展与应用。作为基因表达的产物，其结构上的多样性在一定的程度上能反映生物DNA组成上的差异和生物遗传多样性。但由于其为基因表达加工后的产物，仅是DNA 全部多态性的一部分，而且其特异性易受环境条件和发育时期的影响；此外同工酶标记的数量有限，不能满足育种需要。近年来，分子生物学的发展为植物遗传标记提供了一种基于DNA变异的新技术手段，即分子标记技术。 与其它标记方法相比，分子标记具有无比的优越性。它直接以DNA形式出现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，不受季节、环境的限制，不存在表达与否的问题；数量极多，基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；多态性高，利用大量引物、探针可完成覆盖基因组的分析；表现为中性，即不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；许多标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利，能够鉴别出纯合的基因型与杂合的基因型，提供完整的遗传信息。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等位基因编码的酶的不同分子形式）。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。 分子标记种类 利用分子标记技术分析生物个体之间DNA序列差别并用于作图的研究始于1980年。经过十几年的发展，现在的DNA标记技术已有几十种，主要有一下几大类。
分子标记在植物遗传育种中的应用
分子标记在植物遗传育种中的应用 E M摘要N: 分子标记是继形态标记O细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的较为理想的遗传标记F已被广泛地应用于生命科学研究的各个领域P在植物遗传育种中F分子标记主要用于基因组图谱构建O基因定位O辅助标记选择O种质资源评价O基因克隆O杂种优势预测O杂交育种及跟踪育种过程等方面P文章主要介绍了分子标记在植物遗传育种中的应用原理及分析方法F并对其应用前景进行了展望PM关键词N 分子标记K植物遗传育种K遗传标记 优良品种是当今农业经济发展的基础资源F对目标性状#如丰产O优质O抗逆等$的选择是新品种选育过程的中心环节P 传统的育种方法主要是根据植物在田间的表现进行评价和选择P 但由于表型性状不仅取决于遗传组成F也受控于环境条件F有时环境条件的影响可遮盖植株在基因型上的差异F因此仅根据表型进行选择F效果不够理想P特别是对受多基因控制的数量性状的选择F更难做到准确P虽然育种学已建立了一套完整的选择程序F并在农业生产上培育出了许多高产O优质O抗逆的新品种F然而传统的育种方法仍存在周期长O预见性差O工作量大O工作效率低等问题P随着遗传学的发展F人们注意到利用易于鉴别的遗传标记 #R6=6398SA0T607$来进行辅助选择F可提高选择效果P遗传标记已逐渐成为植物遗传育种的重要工具P尤其是分子遗传学的发展及分子标记技术的建立F使作物遗传育种进入了一个新阶段P新
技术与传统方法相结合F有可能解决目前育种中一些重要环节上的主要难题F从而大大加速育种工作进程P分子标记已在遗传图谱的构建O辅助标记选择O基因克隆等方面显示出了非常诱人的前景P - 应用分子标记构建基因组图谱 基因组图谱是遗传研究的重要内容F又是种质资源O育种及基因克隆等许多应用研究的理论依据和基础P因此F基因组图谱已成为当今生命科学的重要研究领域P基因组图谱包括以染色体重组交换为基础的遗传图谱#R6=6398SA+$和以U2? 的核苷酸序列为基础的物理图谱#V4W798A’SA+$P数十年来F许多遗传学家利用形态标记O生化标记和传统的细胞遗传学方法F为构建各种主要作物的遗传图谱进行了大量工作F并取得了一定的进展P但是由于形态标记和生化标记数目少F特殊遗传材料培育困难及细胞学工作量大F因而除极少数作物#如玉米O番茄$外F在分子标记出现之前F大多数作物还没有一个较为完整的遗传连锁图F极大地限制了遗传学理论研究和应用研究的进展P 进入.,年代以来F分子标记的迅速发展F大大促进了遗传连锁图的构建P目前主要农作物O果树O蔬菜等的XCYV7OX?VU7遗传图谱已相继建立M-ZINP利用分子标记构建遗传图谱的理论基础是染色体的交换与重组P 两点测验和三点测验是其基本程序P由于作图群体的不断增大和标记数量的日益扩增F如今的遗传图谱构建已不得不计算机化了P 遗传图谱构建过程主要包括[-$选择和建立适合的作图群体
DNA分子标记及其优缺点
DNA分子标记种类及相应的优缺点 摘要： 对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。 关键词：DNA分子标记优缺点 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。 ②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。 优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。 缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。 1.1. 2 RAPD 标记技术。为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams
遗传标记的发展及其类型
遗传标记的发展及其类型 1形态标记 19世纪60年代，Mendel以豌豆为材料，详细研究了豌豆的7对相对性状的遗传规律。由于这些性状都具有典型的外部形态，很容易识别，从而构成了最早的遗传标记，即形态学标记，由此奠定了近代遗传学的基础。形态标记是利用植物外部形态多态性进行的标记技术。自然界中的生物存在着许多非常明显的形态标记，如果形、花色、矮杆、卷叶等。形态标记简单直观且经济方便，但大多数植物中的形态标记数量有限，多态性较差，表型易受环境影响，且形态标记的获得周期长，不适于需要完整的基因组测试的数量性状位点分析，故形态标记在作物遗传育种中的作用有限。 2细胞学标记 细胞学标记是利用植物细胞染色体的变异的标记技术。植物细胞染色体的变异包括染色体核型和带型的变异。细胞学标记虽然能进行一些重要基因的染色体定位，但标记材料的培育需要大量的人力和时间，并且有些物种对染色体数目和结构变异反应敏感，难以获得标记材料，从而限制了细胞学标记在遗传育种上的应用。 3生化标记 生化标记主要指同工酶标记，是依据植物体内有效成分的化学分析进行标记的技术。同工酶是同种功能的酶的不同形式，由一个以上基因座位编码，其可通过电泳和组织化学染色法分离成肉眼可见的酶谱带型。与形态标记和细胞学标记相比，生化标记表现近中性，对植物经济性状无大的不良影响，且是基因产物差异的直接反映，受环境影响较小。但由于在植物群体研究中能表现出位点多态性的同工酶种类较少，使其应用也受到限制而不能成为较理想的遗传标记。 4分子标记 分子标记是以生物大分子的多态性为基础的标记技术，目前使用的分子标记主要是指DNA分子标记。DNA分子标记能反映植物个体或种群的基因组DNA 间的差异，如由于碱基易位、倒位、缺失、插入、重排或由于存在长短与排列不一的重复序列而产生的差异。起步于20世纪70年代的分子标记在近40年间发展迅速，目前已出现了几十种分子标记方法。与前3种标记(形态、细胞学和生化标记)技术相比，分子标记具有巨大的优越性: ①直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可检测到，受季节、环境限制，不存在表达
分子标记辅助育种技术
分子标记辅助育种技术 第一节 分子标记的类型和作用原理 遗传标记是指可以明确反映遗传多态性的生物特征。 在经典遗传学中，遗传多态性是指等位基因的变异。 在现代遗传学中，遗传多态性是指基因组中任何座位上的相对差异。 在遗传学研究中，遗传标记主要应用于连锁分析、基因定位、遗传作图及基因转移等。 在作物育种中，通常将与育种目标性状紧密连锁的遗传标记用来对目标性状进行追踪选择。 在现代分子育种研究中，遗传标记主要用来进行基因定位和辅助选择。 1、形态标记 形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状。如、株高、穗型、粒色等的相对差异。 形态标记数量少，可鉴别标记基因有限，难以建立饱和的遗传图谱。 有些形态标记受环境的影响，使之在育种的应用中受到限制。 2、细胞学标记 细胞学标记是指能够明确显示遗传多态性的细胞学特征。如染色体的结构特征和数量特征。 核型：染色体的长度、着丝粒位置、随体有无。 可以反映染色体的缺失、重复、倒位、易位。 染色体结构特征 带型：染色体经特殊染色显带后，带的颜色深浅、宽窄 和位置顺序,可以反映染色体上常染色质和异染 色质的分布差异。 染色体数量特征—是指细胞中染色体数目的多少。染色体数量上的
遗传多态性包括整倍体和非整倍体变异。 细胞学标记 优点：克服了形态标记易受环境影响的缺点。 缺点： （1）培养这种标记材料需花费大量的人力物力； （2）有些物种对对染色体结构和数目变异的耐受性差，难以获得相应的标记材料； （3）这种标记常常伴有对生物有害的表型效应； （4）观察鉴定比较困难。 3、蛋白质标记 用作遗传标记的蛋白质分为酶蛋白质和非酶蛋白质两种。 非酶蛋白质：用种子储藏蛋白质经一维或二维聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据显示的蛋白质谱带或点，确定其分子结构和组成的差异。 酶蛋白质：利用非变性淀粉凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳及特异性染色检测，根据电泳谱带的不同来显示酶蛋白在遗传上的多态性。 蛋白质标记的不足之处： （1）每一种同工酶标记都需特殊的显色方法和技术； （2）某些酶的活性具有发育和组织特异性； （3）标记的数量有限。 4 、 DNA标记 DNA分子标记是DNA水平上遗传多态性的直接反映。 DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸系列的任何差异，包括单个核苷酸的变异。 二、分子标记的类型及作用原理
分子标记技术简介
分子标记技术简介 分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记——形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。 分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。 理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。
【分子标记的种类】 一、基于分子杂交技术的分子标记技术 此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。 ①限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP) 1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以DNA—DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。 RFLP的等位基因其有共显性特点。RFLP标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为1—4个。RFLP技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。
SSR分子标记遗传分析
SSR分子标记遗传分析 实验原理： SSR简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记），也叫微卫星序列重复，是由一类由几个核苷酸（1－5个）为重复单位组成的长达几十个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了SSR长度的高度变异性，由此而产生SSR标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。 优点：（1）标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上； （2）是共显性标记，呈孟德尔遗传； （3）技术重复性好，易于操作，结果可靠。 缺点：开发此类标记需要预先得知标记两端的序列信息，而且引物合成费用较高 实验材料： 欧美山杨杂种幼嫩叶片 实验器具、药品： 模板DNA、dNTP、PCR提取Buffer、Mg2+、上游引物、下游引物、Taq酶、去离子水、琼脂糖、Gel-RED染色剂、1×TAE、PCR仪、琼脂糖凝胶电泳系统、紫外凝胶成像系统 SSR引物及退火温度 位点Loci 重复单元 Repeat unit 引物序列(5′-3′) Primer sequence (5′-3′) 退火温度 T(℃) PTR2 (TGG)8AAGAAGAACTCGAAGA TGAAGAACT(F) ACTGACAAAACCCCTAA TCTAACAA(R) 63℃ PTR7 (CT)5A T(CT)6A TTTGA TGCCTCTTCCTTCCAGT(F) TA TTTTCA TTTTCCCTTTGCTTT(R) 49.4℃ PTR14 (TGG)5TCCGTTTTTGCA TCTCAAGAA TCAC(F) A TACTCGCTTTA TAACACCA TTGTC(R) 55.4℃ 实验步骤： 1.总DNA的提取 采用CTAB法提取植物总DNA （1）取700ul CTAB提取液加入20ul巯基乙醇于65℃金属浴内预热； （2）称取适量植物叶片,放入消过毒的研钵中,迅速加入液氮研磨成白色粉末； （3）将粉末移入提取液,混匀,65℃水浴（或金属浴）30min,其间不时的温和摇匀； （4）加入700ul氯仿:异戊醇(24:1)轻轻摇匀,10000rpm 离心10min,取上清(重复2次)；（5）加入700ul异丙醇室温沉淀10min,10000rpm 离心10min,弃上清； （6）用70%乙醇洗两次,37℃气干.去除DNA表面的盐或试剂小分子物质； （7）加入20ul灭菌的去离子水溶解DNA； （8）利用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总DNA的含量和纯度。 2.总DNA的检测
三代遗传标记
三代遗传标记 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。 1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。