脲酶Km值测定

实验十脲酶Km值测定

一、目的

脲酶是氮素循环的一种关键性酶,它催化尿素与水作用生成碳酸铵,在促进土壤和植物体内尿素的利用上起有重要作用。对其进行多方面研究,早已引起人们重视。通过本实验,学习脲酶Km值的测定方法。

二、原理

脲酶催化下列反应:

脲酶Km值测定

在碱性条件下,碳酸铵与奈氏试剂作用产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范围内,呈色深浅与碳酸铵量成正比。故可用比色法测定单位时间内酶促反应所产生的碳酸铵量,从而求得酶促反应速度。

脲酶Km值测定

在保持恒定的最适条件下,用相同浓度的脲酶催化不同浓度的尿素发生水合反应。在一定限度内,酶促反应速度与脲浓度成正比。用双倒数作图法可求得脲酶的Km值。

三、仪器、试剂和材料

1.仪器

(1)试管16 ×160mm 21支

(2)吸管0.5ml×15,lml×1,Zml×1,10ml×1

(3)漏斗5个

(4)721型分光光度计

(5)电热恒温水浴

(6)离心机

(7)康氏振荡机

2.试剂

(1)1/10 mol/L脲15.015g,水溶后定容至250ml。

(2)不同浓度脲液用1/10 mol/L 脲稀释成1/20、1/30、1/

40、l/50 mol/L的脲液。

(3)1 /15 mo/L pH7.0磷酸盐缓冲液Na2HPO4 5.969g,水溶后定容至250ml。NaH2PO4 2.268g,水溶后定容至250ml。取Na2HPO4溶液60ml,NaH2PO4溶液40ml混匀,即为1/15 mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液。

(4)10%硫酸锌20g ZnSO4溶于200ml蒸馏水中。

(5)0.5 mol/L氢氧化钠5g NaOH,水溶后定容至250ml。

(6)10%酒石酸钾钠20g酒石酸钾钠溶于200ml蒸馏水中。

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