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报告基因检测系统

第六章报告基因检测系统

公司现已发展的有三种报告基因检测系统:NF-Kb,p53,NFAT.根据待检基因对其作用的原理,及在药物,抗体等作用下,产生的不同效果,这三种报告基因系统又具体可以分为:NF-kB 刺激系统和NF-kB 抑制系统;p53刺激系统和p53抑制系统;NFAT刺激系统和NFAT抑制系统.

1. NF-kB 报告基因检测系统

(NF-kB 刺激系统;NF-kB 抑制系统)

1.1细胞培养

1)细胞株及材料

细胞株: 293-T细胞

培养基: DMEM(10%FBS GBICO),DMEM(无血清)

培养器皿:T75(75cm2)培养瓶(以下相同),24孔细胞培养板

2)细胞培养及铺板

a) 传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种293T至75 cm2培养瓶,细胞长满后铺板并传代.

注:一般一瓶细胞总数可以达到3×107个,可以按1:8分瓶.

b) 铺板:

细胞消化:将培养好的293 T细胞,倾去培养基,加入1-2ml1×胰酶轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min,观察细胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测到细胞成单个,或是只有2-3个细胞聚团,即可以加入含有血清的DMEM(10%FBS) 10ml左右,终止胰酶的消化作用,随后从中取少量细胞计数.

细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数,细胞密度的计算按照公式:

细胞密度(单位:个/ml)=(4个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数

铺板: 24孔板按照每孔1.0105(NF-kB 刺激系统)或0.8105(NF-kB 抑制系统),接种体积为500L来铺板.

细胞加入后将24孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(勿转动),使细胞能够均匀分布,放置细胞培养箱生长.

1. 2 转染

1)试剂及材料:

转染试剂:Lipofectamin 2000

质粒: a:对照质粒:pEF-BOS

TRAF6(NF-kB 刺激系统)

Dominant negative TRAF6 (NF-kB 抑制系统)

b:NF-kB-luc report plasmid

c:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上

2)转染:

铺板后24小时转染,每个样品须作3个重复孔,目的是为消除实验误差,并且在24孔板上相应位置做好标记.

在A,B两个eppendorf管中分别加入:

A:0.1g NFkB-luc reporter gene+0.4g interest gene+ serum free DMEM 至终体积50l/孔.

B:1.5L lipofectamine 2000+48.5L serum free DMEM 体积为50l /孔,室温放置5min

A,B二者混合,室温放置20-30min后将混合液缓慢而均匀的加到24孔板细胞液中,每孔为100L,轻轻摇晃,使DNA分布均匀,培养24hr.

NF-kB 刺激系统:negative cotrol: pEF-BOS

positive control:TRAF6,

NF-kB 抑制系统:negative cotrol: pEF-BOS

positive control:Dominant negative TRAF6(TRAF6 DN).

(进一步具体转染方法可以参照Lipofectamin2000的说明书.)

1.3 细胞收获及处理

刺激因子:TNF(肿瘤坏死因子),母液浓度2g/Ml,使用浓度20ng/ml

Buffer: 5×PBL裂解液 (Tricine:pH7.8,40 mM;

NaCL: 50 mM;

EDTA: 2 mM;

MaSO4: 1 mM;

DTT: 5 mM;

Triton X-100:1% )

1) NF-kB 刺激系统:

转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率,处理细胞.

2)NF-kB 抑制系统:

转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率

加药刺激:TNF用DMEM 培养基稀释后,200l/孔换液.

加药刺激12-16小时后收细胞.

3)细胞处理:吸干培养液,24孔板中每孔加入1×PBL buffer,在摇床上振荡10-15分钟.置于冰上后,取出5l裂解液,加入发光管中,可以马上上机检测,可以马上上机,或放入-80C保存.

1.4 luciferase 分析

参见promega公司的TECHNICAL MANUAL 上机操作方法附在后面.

1.5 Western-blot检测待检基因的表达情况

见后.

2. p53报告基因检测系统(P53抑制系统)

p53刺激系统仍在优化之中,因此主要介绍p53抑制系统的操作步骤.

2.1 细胞培养及铺板

1)细胞株及材料:

细胞株: Saos(p53-/-),细胞骨肉瘤细胞(Osteosarcoma cell),缺失p53基因. 培养基: DMEM(10%FBS GBICO),DMEM(无血清)

培养器皿:75cm2培养瓶,24孔细胞培养板

2)细胞培养及铺板:

a)传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种Saos至75cm2培养瓶,细胞长满后铺板并传代.一瓶75cm2的细胞长满约为1107个.

b) 铺板:

细胞消化:将培养好的Saos细胞(75cm2培养瓶),倾去培养基,加入2ml胰酶轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min.观察细胞从瓶壁上脱落下来(也

可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测到细胞成单个,或是只有2-3个细胞聚团,即可以加入含有血清的DMEM(10%FBS)10 ml左右,终止胰酶的消化作用.

细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数.

细胞密度(单位:个/ml)=(4个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数

铺板:24孔板的细胞接种量为每孔1.0105个,接种体积为500l来铺板.

细胞加入后将24孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(勿转动),使细胞能够均匀分布,放置细胞培养箱生长.

2.2 转染

1)试剂及材料:

转染试剂:Lipofectamin 2000

质粒: a:对照质粒:pEF-BOS; P53 wild type plasmid

b:P53-luc report plasmid

c:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上

2)转染:

铺板后24小时转染,每个样品须作3个重复孔,目的是为消除实验误差,并且在24孔板上相应位置做好标记.在a,b两个eppendorf管中分别加入:

a:0.1g P53-luc reporter gene+0.4g interest gene+ 25ng P53 wild type plasmid +serum free DMEM 至终体积50l/孔.(negative cotrol不加P53 wild type plasmid)

b:1.5L lipofectamine 2000+48.5L serum free DMEM 体积为50l /孔,室温放置5min

a,b二者混合,室温放置20-30min后将混合液缓慢而均匀的加到24孔板细胞液中,每孔为100l,轻轻摇晃,使DNA分布均匀,培养24hr.

P53抑制系统:negative cotrol: pEF-BOS

positive control:pEF-BOS+P53 wild type plasmid

(进一步具体转染方法可以参照Lipofectamin2000的说明书.)

2.3 细胞收获及处理

Buffer: 5×PBL裂解液 (Tricine:pH7.8,40 mM;

NaCL: 50 mM;

EDTA: 2 mM;

MaSO4: 1 mM;

DTT: 5 mM;

Triton X-100:1% )

1) 转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率.

2) 细胞处理:吸干培养液,24孔板中每孔加入1×PBL buffer,室温下摇床上振荡10-15分钟.置于冰上,取出5L裂解液,加入发光管中,可以马上上机检测,或放入-80C保存.

2.4 luciferase 分析

上机操作方法附在后面.

2.5 Western-blot检测待检基因的表达情况

操作附在后面.

3. NFAT报告基因检测系统

(NFAT刺激系统;NFAT抑制系统)

3.1 细胞培养

1)细胞株及材料:

细胞株:Jurkat-T细胞

培养基:RPMI 1640(10%FBS GBICO;1%双抗),RPMI 1640(无血清)

培养器皿:75cm2培养瓶;175cm2培养瓶;25 cm2培养瓶;96孔细胞培养板

2)Jurkat-T细胞的培养:

Jurkat-T细胞为悬浮细胞,细胞活力好时,镜检多为10-20个细胞聚团,少游离的单个细胞,细胞圆而透亮.一般培养按密度来计算,起始培养密度不要低于1105个/ ml,24hr后细胞密度即可达到2105个/ ml,以此类推在第五天上即可以达到1.6106个/ ml,根据这个来调整接种密度及传代天数.最好细胞的密度高不能超过1.6106个/ ml.

例如,起始培养密度2105个/ ml,体积30 ml,在第三天时, 细胞密度达到8105个/ ml,细胞总数达到2.4107个,因为检测一个待检基因的电击所需细胞数量为1107,所以,此培养的细胞数只能做 2.4个样品,因此,根据实验所需要检测的样品数目来调整培养细胞的体积(象175cm2的培养瓶可以培养200-250ml,细胞总数可以达到16-20107,这样就可以电击16-20个样品).

3.2 电击转化

细胞总数达到检测样品所需则可转染.

转染用品:电击仪,400mm 电击杯(Biorad #1652088)

质粒: a:对照质粒:NFAT刺激系统:negative control:pEF-BOS

posivie control: SYC plasmid

NFAT抑制系统: negative control:pEF-BOS

posivie control: SLIM plasmid

b: NFAT-luc report plasmid

c:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上

试剂: 台盼蓝(0.4%)用于活细胞计数.

1)将Jurkat-T细胞转到50ml离心管中,细胞计数(细胞密度最好在1106左右).

2) 1000rpm离心,用无血清的RPMI1640培养液收集细胞,调整浓度为2.5107/ml,每个电极杯中加入400l细胞液(细胞数为1107个).

3)依次加入10g NFAT-luc reporter gene和20ug interest gene(体积控制在20l以内),使质粒和细胞混匀(尽量不要有bubble).NFAT-luc reporter gene是每个电击杯都必须加的可以先在加到电击杯之前预先和细胞混好.

4)电击条件250V,950F.电击前轻轻弹击电击杯,将杯底的细胞重悬起来,注意不要产生气泡.电击时观察一下time constant(约为24ms).

5)电击完后立即弹击电击杯的侧壁数次,室温下放置30min.

6)将电极杯中的细胞加到10ml RPMI1640培养液中(含serum)24cm2培养瓶,培养40hr(即培养到第三天上午).

3.3 铺板,加药

C305:1:60稀释使用

PMA: 储存浓度为0.5mg/ml,应用浓度为50ng/ml(稀释10000倍)) Ionomycin: 储存浓度为1mM,应用浓度为1M(稀释1000倍));详见附1.

1) 将转染培养40hr后的细胞转到15ml离心管中,进行活细胞计数(台盼蓝染色),离心收细胞,调整细胞浓度为2106个/ml.

2) 在96孔板中,每孔加50l细胞(细胞数为1105个),每个样品还是要做3个复孔.NFAT刺激系统,NFAT抑制系统可以同时进行,前者无需加药刺激,后者需要做

C305抗体刺激和PMA+ Ionomycin刺激,因此,一个样品需要做9个复孔.按顺序在96孔板中加入细胞,并相应做好标记.

3) 对于NFAT刺激系统,直接在每孔中补加50l新鲜培养基,使终体积为100l;对于NFAT抑制系统分别加入50l C305(anti-TCR, 60倍稀释);或50l PMA(50ng/ml)+Ionomycin(1M),刺激8-12小时.

3.4细胞收获及处理

试剂:5×PBL裂解液(同前).

将刺激8-12小时后的细胞取出,每孔加入25L 5PBL buffer,将细胞置于-80C保存,准备第二天检测.

3.5 Luciferase检测

将细胞培养板取出,37C放置10-15min,将裂解液融化,显微镜下确认细胞已完全裂解,取出5L裂解液置于发光管中,上机检测.

3.6.Western-blot检测待检基因的表达情况

见下.

4.Western-blot

试剂:Flag-antibody(1:4000)

goat anti-mouse-HRP

Pierces显色底物.

取剩余细胞裂解液加入SDS Loading buffer.

裂解液与SDS Loading buffer比例视蛋白浓度而定.一般293 T细胞裂解液按1:1加入2SDS Loading buffer,Jurkat T和Saos细胞裂解液按6:1加入6 SDS Loading buffer.

100℃加热变性5-10分钟,上样.聚丙烯酰胺蛋白胶浓度为10%,75V/125V.一般Jurkat T和Saos细胞上样量为20l,293 T细胞为8l.

电泳:根据所要分离的蛋白质分子量大小,配制适当浓度的SDS-PAGE胶,常用浓度为10%-20%

转膜

湿转

在一适当容器中加入转移缓冲液,将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和4张普通滤纸浸泡约10min(若用PVDF膜,则首先要将PVDF膜置于甲醇中浸透10min,然后和硝酸纤维素膜同样使用);

依次将2张滤纸,SDS-PAGE胶,膜,2张滤纸叠放在一起,对齐并赶出其中的气泡; 将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中(胶在阴极);

接通电源,在4℃冰浴中进行转膜,恒流300毫安(或恒压100伏)转膜>1hr,或恒压30伏转膜过夜.

B,半干转

在一适当容器中加入转移缓冲液,将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和2张约3mm厚滤纸浸泡约10min;

依次将1张滤纸,SDS-PAGE胶,膜,1张滤纸叠放在一起,对齐并赶出其中的气泡; 将膜靠近阳极(底部)装入转膜仪中(膜在下,胶在上);

接通电源,恒流0.8毫安/cm2膜, 转膜1.5hrs;

杂交(以下各步均置于摇床上进行)

a) 将转好的膜浸于5%脱脂奶中封闭30min;

b) 将膜浸于含有一抗(终浓度为1μg/ml)的TBST中室温1hr;

c) 用TBST将膜浸洗3次,至少10min/次;

d) 将膜浸于含有二抗的TBST中室温30min;

e) 用TBST将膜浸洗3次,>10min/次,膜即可用于显色反应.

若使用偶联酶标抗体(例如:anti-flag-HRP),则在牛奶封闭后, 将膜浸于含有抗体的TBST中1hr,然后用TBST将膜浸洗3次,10min/次,膜即可用于显色反应. 显色

目前主要使用PIERCE试剂盒显色

将膜表面的液体略微沥干,置于干净的保鲜膜上;

将等体积的底物1和底物2混合(通常用量为10μl / cm× cm膜)后,均匀覆盖于膜的表面,避光放置3-5min;

将膜表面的液体略微沥干后,用干净的保鲜膜包裹,固定于暗盒中即可压X光片,压片时间可适当调节;

显影,定影,分析结果.

膜的strip--膜经Strip后可继续用于另一次western blot实验

将膜浸于stripping buffer中,50℃放置30min;(最好放在通风柜中)

用TBST浸洗膜2次,每次置于摇床上10min;

5% 脱脂奶粉封闭30分钟.

报告基因检测

荧光素酶报告基因原理：转录因子是一种具有特殊结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子，也称为反式作用因子。某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现共价结合，从而对基因的表达起抑制或增强的作用。荧光素酶报告基因实验（luciferase assay）是检测这类转录因子和其靶启动子中的特异顺序结合的重要手段。其原理简述如下：（1）构建一个将靶启动子的特定片段插入到荧光素酶表达序列前方的报告基因质粒，如pGL3-basic等。（2）将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染293细胞或其它相关的细胞系。如果此转录因子能够激活靶启动子，则荧光素酶基因就会表达，荧光素酶的表达量与转录因子的作用强度成正比。（3）加入特定的荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应，产生荧光，通过检测荧光的强度可以测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否能与此靶启动子片段有作用。步骤： (1) 铺细胞于24 孔板中，{选用48孔板（如果比较难做的系统可以选用24孔板甚至12孔板，细胞量越多表达的酶相应越多），铺板密度约为30%（如果比较着急做实验，密度可以提高）。}每孔细胞数为20 万细胞左右，待细胞融汇度达到70% （适合磷酸钙转染）、85% （适合脂质体转染）时进行转染。一般选用细胞密度为50-70%时进行转染（因为转染后要让质粒表达一定的时间，一般是18-24小时，故而这个细胞密度到加药时密度会差不多到100%）。转染体系的配置：目标蛋白的质粒（pBind-），luc质粒，fermentas转染试剂，（质粒：转染试剂=1：1-3（μg：μL）这个比例根据细胞、质粒转染难易程度而定，必要时需要自己摸条件）。——此步骤与与普通的细胞转染实验的要求相同。脂质体法（1）在细胞密度达到80%左右，于转染前1小时用基本培养基（常用无血清培养基Opti-MEM）为细胞换液。【对转染后易死的细胞可用不含双抗但含有10%FBS的DMEM或1640培养基】（2）根据细胞培养皿的大小，按下表配制转染试剂体系。将适量欲转染的质粒DNA与适量体积的Opti-MEM混匀。同时，将适量的脂质体【采用下表中所给量的一半】也和适量的Opti-MEM混合。室温静置5分钟【时间过长会降低脂质体活性】。（3）将（2）中两溶液转移到同一EP管中，吹打使其混匀。静置20分钟。（4）将质粒DNA和脂质体混合液加入到细胞培养皿中，置于CO2培养箱中37℃培养（5% CO2，37 ℃）4－6小时后更换正常培养基（含双抗和10%FBS）。脂质体法各试剂用量 DNA(ug) opti培养基（μl）

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体 1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）？ DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。 2.有哪些海肾荧光素酶载体？海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体： A pRL-SV40载体??? pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。 B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 a pRL-TK载体 pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。 b pRL-null载体 pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。 3.用双报告基因有何优点？一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。 4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点？

检测报告模板

无创产前亲子鉴定遗传咨询报告一．检测结论检测结果支持“韩梅梅”胎儿DNA样品与“李磊”提供的DNA样品之间符合孟德尔遗传定律，即DNA样品的提供双方符合生物学亲子关系。待测样品的累计父权指数（CPI）为5.51E+82，亲权概率为>99.99％。在本报告中，胎儿DNA样品为检测对象，男方提供的为待测样品。二．样品信息检案号：PPT2017070581 委托人：韩梅梅检测对象样品：血液待测样品类型：血液受理日期：2017年6月29日检测日期：2017年7月11日本报告属于实验室科研检测报告，仅对本次送检样本负责，不作为司法鉴定用途。三．检测方法本检测方法使用高通量测序技术，对孕妇外周血中的游离DNA进行测序和

分析，筛选出胎儿特异的SNP位点（在本检测中称为信息位点）并与待测样品的测序结果进行比对，检验两个样品是否符合孟德尔遗传定律。具体方法如下： 1.在高速离心机中分离血液，获得血浆； 2.提取血浆和待测样品中的DNA； 3.采用高通量测序和液相杂交捕获技术对样品进行测序； 4.使用超级计算平台对测序结果进行分析； 5.如果胎儿浓度达到要求，出具报告；如果胎儿浓度过低，需要重新抽取孕妇外周血。四．检测结果 1.待测样品SNP分型清晰，无污染，符合质控标准；

图1. 待测样品SNP分型图。蓝色和红色用于标识不同的染色体。 2.从检测对象中分析筛选出379个信息位点，符合质控标准； 3.与待测样品SNP分型结果比对后，信息位点中有1个位点不符合孟德尔遗传定律，错配率为0.2639%； 4.所有信息位点在22条常染色体上的分布情况，绿色为符合孟德尔遗传定律的信息位点，红色为不符合孟德尔遗传定律的信息位点；

荧光素酶报告基因检测

荧光素酶报告基因检测 ●原则荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。检测步骤如下： 1)加裂解缓冲液裂解转染的细胞。 2)将上述裂解物转移入微孔板或者试管中（根据检测的需要选择所用器材类型）。 3)加入含有所有酶反应成分（必须包括底物荧光素），使化学发光反应开始。 4)用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。 ●特点 ◆敏感度和检测范围：5 fg荧光素酶 ◆发射光的线性范围：10 fg—10 ng ◆确切的检测限依检测仪器而定。 ◆特异性：本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。不适用于对细菌荧光素酶进行检测。 ●器材和试剂 ◆器材在微孔板或试管中，用自动或手动荧光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。 ◆试剂 1)荧光素酶检测试剂：荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些试剂可以启动酶反应。这种荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，- 15℃~- 25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。避免反复冻融。应避光保存，因为荧光素在光照下会发生氧化。 2)裂解缓冲液：下面将加以介绍。 ●基本操作步骤下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。提取物必须立刻检测，否则必须在-15～-25℃储存大约一个月。不要反复冻融以避免酶活性的降低。 1)将荧光素酶报告基因与β-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。 2)彻底吸去培养皿（60mm）中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，无钙和镁离子）小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。10×PBS缓冲液：NaCl 100g，KCl 2.5g，Na2HPO4 14.4g，KH2PO42.5g，用三蒸水定容至1000 ml。 3)加入最小体积的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液盖过细胞，例如60 mm的培养皿用360 μl裂解液，35毫米的培养板用150 μl裂解液。用橡皮刮将细胞刮离培养皿。将裂解物转移到微量离心管中。Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液：1%（v/v）Triton X-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸（p H7.8），15mmol/L MgSO4，4mmol/L EGTA，1mmol/L DTT（临用前加入） 4)在漩涡混合器上轻轻振荡细胞裂解液，以最大速度4℃离心以去除细胞碎片。将上清转移到另一个微量离心管中，置于冰上以备分析。 5)在开始化学发光反应之前，将100 μl的细胞提取物转移到荧光仪或者液闪计数仪所用的检测器皿中（我们建议用96孔板）。加入360 μl荧光素酶分析缓冲液。荧光素酶分析缓冲液：25m

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998

双荧光素酶测试系统及海肾类对照报告基因载体 1.什么是双荧光素酶报告基因测试系统（DLR）？ DLR测试系统灵敏，方便，在一个系统中用于测量两个单独的荧光素酶报告基因，萤火虫荧光素酶及海洋海肾荧光素酶(Renilla reniformis)，DLR测试系统可用于细胞裂解物及无细胞的翻译系统。 2.有哪些海肾荧光素酶载体？海肾荧光素酶载体pRL用于在转染的哺乳细胞中组成性地表达海肾荧光素酶。这类载体还有T7启动子，可用T7RNA聚合物在体外合成海肾荧光素酶，有4个不同的载体： A pRL-SV40载体pRL-SV40载体含SV40增强子及早期启动子区域，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。pRL-SV40载体还含有SV40的复制起始区，可在表达SV40大T抗原的细胞中，如COS-1，COS-7细胞中，瞬时及附加体似地复制。 B pRL-CMV载体pRL-CMV载体含有CMV极早增强子及启动子，可在多种细胞中组成性地高表达海肾荧光素酶。 a pRL-TK载体 pRL-TK载体含HSV胞嘧啶激酶启动子区域，在多种细胞中组成性地弱表达海肾荧光素酶。 b pRL-null载体 pRL-null载体缺真核启动子及增强子，在海肾荧光素酶基因的上游含有多克隆位点。 3.用双报告基因有何优点？一般地说，实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而另一个报告基因作为内对照，以提供实验报告基因测试的归一化。将实验报告基因的活力与内对照报告基因的活力作归一化可消除实验中不同测试间所固有的变化，这些变化减弱实验准确度，其中包括培养细胞的数目及活力的差异，细胞转染及裂解的效率。海肾荧光素酶可用作对照报告基因及实验报告基因。在双荧光素酶报告基因测试中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。 4.相比用CAT或β-半乳糖苷酶对表达数据作归一化，双荧光素酶报告基因测试系统有何优点

基因检测合作协议正式版

The cooperation clause formulated through joint consultation regulates the behavior of the parties to the contract, has legal effect and is protected by the state. 基因检测合作协议正式版

基因检测合作协议正式版下载提示：此协议资料适用于经过共同协商而制定的合作条款，对应条款规范合同当事人的行为，并具有法律效力，受到国家的保护。如果有一方违反合同，或者其他人非法干预合同的履行，则要承担法律责任。文档可以直接使用，也可根据实际需要修订后使用。甲方：_________基因有限公司（以下简称甲方）地址：乙方：（以下简称乙方）地址： _______________基因有限公司（以下称“甲方”）是____________市卫计委批准成立的从事遗传代谢病临床检验的检验机构，主要从基因分析、蛋白质功能（酶的活性）分析和代谢物分析三个层面对遗传代谢病进行全方位检测，目前已推出的__________技术和项目在国内外均处于领

先地位。甲、乙双方本着“互惠互利、长期合作、共同发展”的原则，达成如下战略合作协议：一、协议内容乙方委托甲方作为乙方医学检验标本的定点检验单位，开展乙方所属医院检验标本的有偿检测服务。所开展的检测项目收费金额，由甲乙双方根据市场价格协商确定。二、甲方的责任义务 1、甲方负责乙方实验人员操作培训、临床医生产品知识宣讲等工作。 2、甲方向乙方有偿提供医学检验服务，所设的检验项目为非固定的，内容将

双荧光报告系统

报告基因 Promega中文通讯第2期 2002 荧光素酶双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal 或GUS表达, 不利于准确定量报告基因表达, 胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温

双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明

双荧光素酶报告基因检测试剂盒使用说明产品说明：报告基因检测，是真核基因表达调控研究的常用方法。由于检测光量子的方法非常敏感，采用生物发光(bioluminescent)法，是报告基因检测最常用的有效手段。荧光素酶(luciferase)催化底物荧光素的转化，发射出光子。萤火虫荧光素酶(Firefly luciferase)和海肾荧光素酶(Ranilla luciferase)催化的发光反应，具有相似的光学特征和很好的浓度线性范围(7~8个数量级的线性范围)，酶的检测灵敏度达10-18mol到10-20mol，但两者催化的化学反应底物和最适反应条件完全不同。这两种荧光素酶配合形成了十分有效的双荧光素酶报告基因系统，其中Ranilla luciferase通常作为内参照。本试剂盒提供了一体化形式的双荧光素酶检测系统。采用通用裂解缓冲液，适合于两种荧光素酶活性的保持，且与其他类型的报告基因检测和蛋白含量检测兼容；优化的两种酶反应体系，使每种发光反应持续数十分钟，以便于手工操作多个样品；并保证Firefly luciferase发光及时淬灭，不影响后续Ranilla luciferase的测定；优化的反应体系还使两种荧光素酶活性比值趋于合理的敏感范围，更有利于后续数据的比较。产品内容：名称数量保存条件5x Universal Lysis Buffer(通用裂解液)25ml-20℃ Fassay Buffer I(虫酶缓冲液)10ml-20℃ Fassay Substrate I(虫酶底物)0.5ml-20℃ Rassay Buffer II(海酶缓冲液)10ml-20℃ Rassay Substrate II(海酶底物)0.2ml-20℃可作100次双荧光素酶检测。低温运输，-20℃或-80℃避光保存。有效期6个月。

个体化用药基因检测报告单模板氯吡格雷等

XXXXXXXXXXXXXXX药剂科脱氧核糖核酸（DNA）位点测定报告单姓名：XXX 性别：女年龄：67 身高：体重：民族：科室：心内科病历号：病床号：33 送检医生：XXXX 送检日期：.02.09 临床诊断: 冠状动脉粥样硬化、PCI术后 DNA序列测定结果：（氯吡格雷用药相关基因）序号检测基因检测位点检测结果 1 CYP2C19* 2 681G>A（rs4244285）GG 2 CYP2C19* 3 636G>A（rs4986893）GG CYP2C19*1/*1野生纯合型 4 PON1 576 G > A (rs662) AA：PON1突变纯合型检测结论：该患者CYP2C19酶为正常代谢型，酶活性表达正常，PON1基因型突变纯合型（AA），酶活性表达减弱。该患者PCI术后，行标准氯吡格雷治疗，1年后发生支架血栓的风险，比正常人高11.6倍，因此，从理论上认为该患者使用常规剂量(75mg/d)的氯吡格雷可能无法有效转化为其活性代谢产物，可能导致氯吡格雷抵抗，使得血栓形成风险增加。个体化用药建议： (1)该患者采用氯吡格雷（75mg，qd）抗血小板治疗，可能无法发挥良好的抗血小板作用。因此，建议替代使用新型抗血小板药物替格瑞洛；但应关注替格瑞洛所致呼吸困难。或给予氯吡格雷（75mg/d）、阿司匹林（100mg/d）和西洛他唑三联抗血小板治疗；或者将阿司匹林剂量增加至200~300mg/d；或停用氯吡格雷，换用其他抗血小板药。 (2)调整给药方案后，应检测血小板聚集率或血栓弹力图以评价临床疗效。 (3)治疗期间应密切关注患者有无皮肤黏膜及消化道等部位出血的发生，若出现则应调整给药方案。 (4)在应用氯吡格雷时，应避免使用CYP2C19酶抑制药，如奥美拉唑、兰索拉唑、埃索美拉唑等，因其可抑制CYP2C19酶，导致CYP2C19酶活性进一步减弱，使得氯吡格雷生物转化进一步下降，而降低氯吡格雷疗效。如必须使用，可替代使用其他对氯吡格雷作用影响较弱的药物如雷贝拉唑或H2受体阻断剂如雷尼替丁等。 (5)合并使用他汀类降脂抗炎药物，应避免使用阿托伐他汀、辛伐他汀等药物，体外研究表明，阿托伐他汀及其体内代谢产物阿托伐他汀酯均对氯吡格雷有竞争性抑制作用，可降低氯吡格雷生物转化达90%，并呈浓度依赖性，可能会导致氯吡格雷疗效进一步减弱。可选择对氯吡格雷影响较弱的瑞舒伐他汀钙或氟伐他汀钠。 (6)上述建议仅供临床医生参考，具体使用还应该结合临床实际情况来制定和调整用药方案。说明：氯吡格雷为前体药，主要依赖于CYP2C19代谢生成活性代谢产物，发挥抗血小板疗效。CYP2C19基因存在多态性，其酶有四种不同的代谢类型：快代谢型(RM，*1/*1)；超快代谢型(UM，*1/*17，*17/*17)；中间代谢型(IM，*1/*2，*1/*3，*17/*2，*17/*3)；慢代谢型(PM，*2/*2，*2/*3，*3/*3)。常规剂量的氯吡格雷在慢代谢型患者中产生的活性代谢物减少，抑制血小板聚集作用下降，形成血栓风险增加；在超快代谢型患者中产生活性代谢产物增加，抑制血小板聚集作用增强，出血风险增加。2010年美国FDA修改的氯吡格雷说明书中黑框警示：CYP2C19基因型检测结果应作为医生调整治疗策略的参考。此外，ABCB1-3435C>T为氯吡格雷第二独立风险因素，突变型(TT型)肠道吸收减少，心血管事件发生率明显高于野生型(CC型)。最新研究证实，PON1在氯吡格雷生物转化上起着关键作用，PON1-576G>A基因多态性可影响PON1活性表达，是氯吡格雷疗效重要预测因子。与野生型(GG型)比较，GA型和AA型氯吡格雷抵抗风险增加，其半年后发生支架内血栓风险亦明显增加。

双荧光素酶报告基因检测系统-promega

Dual-Luciferase? Reporter Assay 试剂准备 Luciferase Assay Buffer II 10ml Luciferase Assay Substrate 1vial Stop & Glo? Buffer 10ml Stop & Glo? Substrate, 50X 200ul Passive Lysis Buffer (PLB), 5X 30ml 1.1X PLB: 加1体积的5X Passive Lysis Buffer (PLB)到4体积的dH20中，40C 保存（一个月）。 https://www.wendangku.net/doc/746646433.html,R II：将Luciferase Assay Substrate重悬于10ml Luciferase Assay Buffer II 中（-200C保存1个月，-700C保存1年）。 3.1X Stop & Glo 试剂：1体积50X Stop & Glo? Substrate加入49体积的 Stop & Glo? Buffer中（-200C保存15天）。（每次试验需要100ul）细胞处理 1. 吸除细胞培养液 2. 1X PBS轻柔的冲洗细胞 3. 加入1X PLB（推荐用量） 4.细胞溶解室温条件下，轻摇细胞15min，

瞬时转染和报告基因实验采用脂质体介导技术转染。重组质粒分别为p-629/+100，p-401/+100，p-238/+100，p-80/+100，p-25/+100。pGL3- basic为阴性对照;同时以转染phRL-tk(海肾荧光素酶)作内对照。具体转染方法参照转染(Polifectamine Reaent)说明书进行。 1. 将质粒DNA(3.2μg)与phRL-tk (0.8μg)按1:4混合后为A液，混匀30s， PolyFect(QIAGEN)与无血清无抗生素的DMEM按1:50混匀后为B液，混匀30s; 2. A+B混匀(B加入A)15s，室温下孵育5-10 min; 3. 吸出六孔板中的培养液，用无血清无抗生素的DMEM洗3遍，然后加入AB 混合液，每孔0.8mL; 4. 6h后，加入2mL完全DMEM; 5. 24h后，倒出旧培养液，换为完全DMEM; 6. 100μg H2O2或B(a)P处理lh或24h;（200 μM MMS，24h-溶解于Me2SO, Sigma)；（H2O2不引起OGG1升高）

基因检测报告怎么看.doc

篇一:《各基因检测公司情况搜集及可借鉴经验报告》各基因检测公司情况搜集及可借鉴经验报告我们能从中借鉴到什么？福君基因作为市场的新入者，我们在从业经验、技术积累、资本投入、人才培养、合作单位等各方面都是相对弱势，但我们的优势在于可以借鉴同行们积累的经验，可以规划好我们的运营模式，从而少走一些弯路。那么，我们可以借鉴到哪些经验？以下，初略谈下本人的看法。首先，从短期来看未来的一到二年内，我们做的更多的还是业务销售型的工作，考虑的更多是公司在业内的生存，了解竞争对手的优劣势，确定我们的主营业务（避开竞争激烈的模块，个人建议做新生儿基因检测、高危行业基因检测、美容健康基因检测如皮肤、抗衰老、肥胖等基因检测、妇科问题基因检测）。积累经验，扩大和基因检测行业有关机构（实验室、研究所、高校）的合作面同时利用各种渠道广招技术性、市场型人才如和医学类高校合作招生。参与医展会、基因学术研讨会，增进同行交流，提高我们的研发以及检测水平。直销模式随着竞争的激烈化，代理模式必然会逐渐被淘汰，所以我们直接和福建省内

的医院、体检机构、渠道客户展开合作，确立我们的业务优势后，再考虑省外市场。其次，从中期来看未来的二年到五年内，我们在行业内站住了脚跟，已经有了一定的技术积累、从业经验、人才积淀，更多的是在拓展业务经营范围和覆盖范围的同时，做以下举措开展全国基因研讨会巡讲讲座，邀请各地政府机构、实验室、大学医学专业、医院负责人参与讲座。向社会招收有关基因技术的培训班，扩大营收的同时，提高公司的知名度，还能广纳人才。和IT行业的深度结合，借助IT技术构建基因数据库及基因私有云，和同行共享基因研究成果，进行生物数字化进程，构建。最后，从长期来看要在行业内处于领导者地位，我们必须从业务规模、资本运作（上市）、人才积累、合作单位、技术支持方面都有深厚的积累。这要求我们学习华大基因的运作，必须有以下举措搭建科技平台通过搭建科技平台聚拢了一群从事基因研究的高端人才，同时和各地政府机构、医学类高校合作成立各类实验室、研究所并形成规模。产业集团化通过成立各子公司来分别运作与基因有关的产业模块，如农业基

双荧光素酶报告系统

双荧光素酶报告系统双荧光素酶报告基因测试∶ 结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时 ,通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因(比如CAT,β-Gal,GUS)不够便利,因为各自的测试化学,处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术,结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统,结合pRL载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶,在单管中进行双荧光素酶报告基因测试,快速,灵敏,简便。系统还提供PLB 裂解液,用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞,不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测, 通常一个报告基因作为内对照, 使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子, 研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照, 使测试不被实验条件变化所干扰。通过这种方法, 可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性, 比如, 培养细胞的数目和活力的差别, 细胞转染和裂解的效率。使用萤火虫荧光素酶,结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), β-半乳糖苷酶(β-Gal), 或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因,近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势 , 比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行, 但CAT, β-Gal和GUS测试法, 则在定量前需要长时间的保温。另外,这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围, 必须注意不要超过这些范围, 内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源β-Gal或GUS表达, 不利于准确定量报告基因表达, 胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2), 会降低内源性β-Gal和CAT测试的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双报告基因检测中, 必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因, 如CAT, β-Gal和GUS是不可能的, 由于它们测试化学,处理要求所固有的局限。相反 , 结合萤火虫 ( Photinus pyralis ) 和海洋腔肠 ( Renilla reniformis ) 双荧光素酶， Promega 的双荧光素酶报告基因测试 (DLR) 系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。双荧光素酶报告基因测试化学荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点 , 但它们在进化上的起源不同 , 因此 , 具有不同的酶学结构和底物要求。这些差别用来发展了 DLR 测试化学 , 选择性地区别这两种发光报告基因的活力。萤火虫荧光素酶是一个 61kDa 单亚基蛋白质 , 酶活力不需翻译后修饰 (3,4), 在翻译后即可作为遗传报告基因。在 ATP,Mg 2+ 和 O 2 存在下，通过甲虫荧光素的氧化反应发光 ( 图 1) 。在常规反应条件下 , 荧光素的氧化发生时 , 以荧光素 -AMP 作为中间体 , 转换非常缓慢。结果 , 在底物和酶混合后 , 测试化学产生"闪烁"的光 , 并迅速衰减。专利化的测试试剂 , 定量萤火虫荧光素酶活力 , 掺入了

双报告基因测试技术

双荧光素酶报告基因测试：结合萤火虫和海洋腔肠荧光素酶先进的共报告基因测试技术在用萤火虫荧光素酶定量基因表达时，通常采用第二个报告基因来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因（比如CAT,B -Gal,GUS）不够便利，因为各自的测试化学，处理要求,检测特点存在差异。Promega提供一种先进的双报告基因技术，结合了萤火虫荧光素酶测试和海洋腔肠荧光素酶测试。双荧光素酶报告基因测试系统，结合pRL 载体系统,表达第二个报告基因海洋腔肠荧光素酶，在单管中进行双荧光素酶报告基因测试，快速，灵敏，简便。系统还提供PLB裂解液，用来裂解在多孔板中培养的哺乳细胞，不需操作单个样品。对于正在使用萤火虫荧光素酶报告基因载体的研究人员。双荧光素酶报告基因测试系统将使他们立即体会到该系统的便利。介绍双报告基因用于实验系统中作相关的或成比例的检测，通常一个报告基因作为内对照，使另一个报告基因的检测均一化。检测基因表达时双报告基因通常用来瞬时转染培养细胞，带有实验报告基因的载体共转染带有不同的报告基因作为对照的第二个载体。通常实验报告基因偶联到调控的启动子，研究调控基因的结构和生理基础。报告基因表达活力的相对改变与偶联调控启动子转录活力的改变相关，偶联到组成型启动子的第二个报告基因，提供转录活力的内对照，使测试

不被实验条件变化所干扰。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，比如，培养细胞的数目和活力的差别，细胞转染和裂解的效率。使用萤火虫荧光素酶，结合氯霉素乙酰转移酶(CAT), B -半乳糖苷酶(B -Gal),或葡萄醛酸糖苷酶(GUS)的双报告基因，近几年已普遍使用。但这些双报告基因组合削弱了荧光素酶操作的优势，比如荧光素酶测试和定量可在几秒钟内进行，但CAT, B -Gal和GUS测试法，则在定量前需要长时间的保温。另外，这些报告基因受限于它们的灵敏度和线性应答范围，必须注意不要超过这些范围，内源性细胞活力也会干扰这类报告基因的使用。许多类型的细胞有内源B -Gal 或GUS表达，不利于准确定量报告基因表达，胞内去乙酰酶活力干扰CAT活力测试。尽管在高温下预处理细胞裂解液(1,2),会降低内源性B -Gal和CAT测试的干扰，但这些处理也会快速失活荧光素酶。因此,在此类双报告基因检测中，必须以不同的步骤分别处理共转染的细胞裂解液。理想的双报告基因方法应该使用户能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度,灵敏和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定。这在传统的报告基因，如CAT, B -Gal和GUS是不可能的，由于它们测试化学，处理要求所固有的局限。相反，结合萤火虫(Photinus pyralis )和海洋腔肠(Ren ilia reni formis )双荧光素酶， Promega的双荧光素酶报告基因测试（DLR）系统可满足这些要求，在单管中完成这些测试。双荧光素酶报告基因测试化学

亲子鉴定报告结论

竭诚为您提供优质文档/双击可除亲子鉴定报告结论篇一：亲子鉴定书浙江南方医科大学医学检验中心基因鉴定所DnA检验报告书浙鉴[20XX]物鉴（遗传）第3445号关于张勇与张淼淼的DnA鉴定一、基本情况被鉴定人1姓名：张勇性别：男出生年月：1988年8月9日被鉴定人2姓名：张淼淼别：男出生年月：20XX年7月16日委托鉴定日期：20XX年6月20日委托单位/个人：王辉军委托鉴定事项：亲权关系鉴定样本：张勇与张淼淼的头发各一份二、检验结果三、分析说明根据孟德尔遗传定律，孩子的全部遗传基因分别来源于其亲生父母双方。实验中分析了张淼淼与张勇的15个sTm

基因和meL基因座，综上检验结果分析，张淼淼的基因型符合作为张勇的遗传基因条件。经计算，累积亲权指数（cpI 值）为47271127.1234,亲权概率（Rcp）为99.9999%;张勇的基因型符合作为张淼淼亲生父系的遗传基因条件，经计算，累积亲权指数（cpI值）为1207217.0923，亲权概率（Rcp）为99.9991% 四、鉴定意见依据DnA检测结果，待测父系样本无法排除是待测子女样本亲生父系的可能。基于15个不同基因位点结果的分析，这种生物学亲缘关系成立的可能为99.9999%。这种可能性几率的计算是基于与亚洲任何一个不相关的未测男性相对而言（假设其优选几率为0.5%）。鉴定人：王慧君教授执业证号51000070300398签字王慧君鉴定宣言：我，教授证明：以上父权指数完全符合基因位点报告书所示内容。以上结果完全按照Jhh制定的DnA亲子鉴定标准复核人：刘巾执业证号5370056700234签字：刘巾浙江南方医科大学医学检验中心基因检定所20XX年6月20日篇二：DnA亲子鉴定书范本

基因检测报告材料 (2)

实用文档上海澳斯泰医学检验所基因检测报告患者姓名：样品编号：送检单位：委托人：联系电话：委托日期： 2014年11月21日接收日期： 2014年11月24日报告日期： 2014年11月26日

样本提供者信息样本编号：病理号：病区：床号：19 科室：胸外科姓名：性别：女出生日期：1950年7月22日临床诊断：样本种类：新鲜组织样品数量：1 检测项目内容检测项目1：肿瘤个体化治疗疗效相关融合基因检测 1.检测内容：EML4-ALK融合基因 2.检测方法：实时定量逆转录聚合酶链反应 (QRT-PCR) 3.主要材料：ABI荧光定量试剂盒源奇生物肿瘤相关融合基因检测试剂盒 4.主要设备：ABI 7300荧光定量PCR仪检测项目2：肿瘤个体化治疗疗效相关基因突变检测 1.检测内容：EGFR基因突变 2.检测方法：DNA 测序法、ARMS法

3.主要材料：ABI PCR测序试剂盒，源奇生物荧光+测序相关基因检测试剂盒 4.主要设备：ABI 3730XL DNA测序仪、ABI 7300荧光PCR仪检测项目及结果实验员: 报告人：复核人：报告时间：2014年11月26日注：此检测结果只对本次送检样本负责。由于肿瘤疾病的发生和发展是动态过程，因此若是样品采集一定间隔时间后（3个月以上）的跟踪检测或者进行治疗方案的评估，建议遵医嘱。

注：以上分析仅用于评估个体化用药的适用程度，具体的治疗方案须由临床主治医生决定。如有任何疑问，请联系相关负责人。

检测结果附图及解读一、肿瘤相关融合基因检测结果 ABL-内参 EML4-ALK 融合基因阳性对照阴性对照标本

基因检测报告定稿版

基因检测报告 HUA system office room 【HUA16H-TTMS2A-HUAS8Q8-HUAH1688】

上海澳斯泰医学检验所基因检测报告患者姓名：样品编号：送检单位：委托人：联系电话：委托日期： 2014年11月21日接收日期： 2014年11月24日报告日期： 2014年11月26日样本提供者信息样本编号：病理号：病区：床号：19 科室：胸外科姓名：性别：女出生日期：1950年7月22日临床诊断：样本种类：新鲜组织

样品数量：1 检测项目内容检测项目1：肿瘤个体化治疗疗效相关融合基因检测 1. 检测内容：EML4-ALK融合基因 2. 检测方法：实时定量逆转录聚合酶链反应 (QRT-PCR) 3. 主要材料：ABI荧光定量试剂盒源奇生物肿瘤相关融合基因检测试剂盒 4. 主要设备：ABI 7300荧光定量PCR仪检测项目2：肿瘤个体化治疗疗效相关基因突变检测 1. 检测内容：EGFR基因突变 2. 检测方法：DNA 测序法、ARMS法 3. 主要材料：ABI PCR测序试剂盒，源奇生物荧光+测序相关基因检测试剂盒 4. 主要设备：ABI 3730XL DNA测序仪、ABI 7300荧光PCR仪检测项目及结果实验员: 报告人：复核人：报告时间：2014年11月26日注：此检测结果只对本次送检样本负责。由于肿瘤疾病的发生和发展是动态过程，因此若是样品采集一定间隔时间后（3个月以上）的跟踪检测或者进行治疗方案的评估，建议遵医嘱。

注：以上分析仅用于评估个体化用药的适用程度，具体的治疗方案须由临床主治医生决定。如有任何疑问，请联系相关负责人。

各基因检测公司情况搜集及可借鉴经验报告

我们能从中借鉴到什么？福君基因作为市场的新入者，我们在从业经验、技术积累、资本投入、人才培养、合作单位等各方面都是相对弱势，但我们的优势在于可以借鉴同行们积累的经验，可以规划好我们的运营模式，从而少走一些弯路。那么，我们可以借鉴到哪些经验？以下，初略谈下本人的看法。首先，从短期来看： 1.未来的一到二年内，我们做的更多的还是业务销售型的工作，考虑的更多是公司在业内的生存，了解竞争对手的优劣势，确定我们的主营业务（避开竞争激烈的模块，个人建议做新生儿基因检测、高危行业基因检测、美容健康基因检测如皮肤、抗衰老、肥胖等基因检测、妇科问题基因检测）。

2.积累经验，扩大和基因检测行业有关机构（实验室、研究所、高校）的合作面 3.同时利用各种渠道广招技术性、市场型人才如和医学类高校合作招生。 4.参与医展会、基因学术研讨会，增进同行交流，提高我们的研发以及检测水平。 5.直销模式：随着竞争的激烈化，代理模式必然会逐渐被淘汰，所以我们直接和福建省内的医院、体检机构、渠道客户展开合作，确立我们的业务优势后，再考虑省外市场。其次，从中期来看：未来的二年到五年内，我们在行业内站住了脚跟，已经有了一定的技术积累、从业经验、人才积淀，更多的是在拓展业务经营范围和覆盖范围的同时，做以下举措： 1. 开展全国基因研讨会巡讲讲座，邀请各地政府机构、实验室、大学医学专业、医院负责人参与讲座。 2.向社会招收有关基因技术的培训班，扩大营收的同时，提高公司的知名度，还能广纳人才。 3.和IT行业的深度结合，借助IT技术构建基因数据库及基因私有云，和同行共享基因研究成果，进行生物数字化进程，构建。最后，从长期来看：要在行业内处于领导者地位，我们必须从业务规模、资本运作（上市）、人才积累、合作单位、技术支持方面都有深厚的积累。这要求我们学习华大基因的运作，必须有以下举措： 1.搭建科技平台：通过搭建科技平台聚拢了一群从事基因研究的高端人才，同时和各地政府机构、医学类高校合作成立各类实验室、研究所并形成规模。 2. 产业集团化：通过成立各子公司来分别运作与基因有关的产业模块，如农业基因、微生物技术、水质检测、司法鉴定、基因检测门诊等。

双荧光素酶报告基因检测系统的开发

Dual-luciferase reporter assay kit (1) Promega公司双荧光素酶报告基因(DLR TM)检测系统试剂盒组分： Promega的DLR TM检测试剂盒专利给出了Luciferase assay bufferII和Stop & Glo? buffer的相关组分和浓度范围，没有具体的数值。我在专利和文献中也没有找到针对DLR TM检测试剂盒中的passive lysis buffer的成分。Assay protocol： (2) 文献中用到的几种非商业性双荧光素报告基因检测系统细胞裂解液（cell lysis buffer）配方： (a)源自promega公司的单荧光素酶报告试剂盒： T ris-phosphate（PH7.8）25mM EGTA or EDTA 2mM DTT 2mM BSA 1mg/ml Triton X-100 1% Glycerol 10%

(b) Make the following stock solutions. 1M HEPES pH 8 (室温RT) 1M DTT (4℃) 100mM MgCl2 (RT) 裂解液第二种配方（100ml体系）：来自 https://www.wendangku.net/doc/746646433.html,/cgi-bin/prot/view_cache.cgi?ID=2507 10ml 1M HEPES PH8 0.5ml 1M DTT 2ml 100mM MgCl2 2ml Triton X100 85ml distilled water 反应缓冲液：Firefly Luciferase Assay；Renilla Luciferase Assay Reagent。 a>“A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis”文献作者给出了2种荧光素酶活性检测的反应试剂配方，并与promega公司试剂盒进行了效果比较，检测效率和灵敏度都很高，不逊于promega产品。目前也有很多文献采用了该法。细胞裂解液仍使用promega 的passive lysis buffer。 Firefly Luciferase Assay Reagent： glycylglycine 25mM KxPO4 (pH 8.0) 15mM EGTA 4mM DTT 1mM MgSO415mM ATP 2mM

DNA提取及PCR扩增实验报告

PCR扩增及DNA琼脂糖凝胶电泳刘琳1131428 环境科学一、实验目的 1．学习并掌握PCR扩增的基本原理与实验技术。 2．对扩增后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳试验，并分析相应结果。二、实验原理 1. PCR扩增多聚酶链反应（PCR）技术的原理类似于DNA的天然复制过程。在微量离心管中加入适量缓冲液，加入微量模板DNA、四种脱氧核苷酸（dNTP）、耐热T aq聚合酶及两个合成DNA的引物，而后加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链解链，这是所谓变性阶段。降低溶液温度，使合成引物在低温（55℃）与模板DNA互补退火形成部分双链，这是所谓退火阶段。溶液反应温度升至中温（72℃），在Tap酶作用下，用四种dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链，这是延伸阶段。如此反复，在同一反应体系中可重复高温变性、低温退火和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式扩增。经过30～40个循环，DNA扩增即可完成。 2. DNA琼脂糖凝胶电泳实验 DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。该电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。三、实验材料仪器：PCR扩增仪、0.2ul薄壁管、1.5ml离心管、移液枪、枪头、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、制胶版、紫外透射仪。试剂：TapDNA聚合酶、dNTP、buffer、两种引物、16S全长DNA样本、无菌ddH2O、模板DNA 、TBE、琼脂糖、EB、显色剂。四、实验步骤 1. PCR扩增本次试验选择细菌16S rDNA V3区片段进行扩增。 1.1 根据计算，首先取1.5ml离心管按照 2.5ul 10×Buffer 、1 ul dNTP、0.5 ul 341GC、 0.5 ul 534、0.125 ul Taq、19.375u ddH2O的比例配置足量的PCR反应体系。 1.2 分别向9个薄壁管中分别加入24 ul的反应体系，并分别添加8种不同的模版，并于第9个薄壁管中加入无菌ddH2O作为阴性对照。 1.3 将薄壁管放入PCR扩增仪中，按照预定程序进行PCR扩增。其中循环过程需要达到30~40次。程序如下：预变性：94℃3min 循环：94℃变性30s 55℃退火30s 72℃延伸30s 末次延伸：72℃5min