用分子对接方法研究HIV_1整合酶与病毒DNA的结合模式
Vol.29高等学校化学学报No.7 2008年7月 CHE M I CAL JOURNAL OF CH I N ESE UN I V ERSI TI ES 1432～1437
用分子对接方法研究H I V21整合酶与
病毒D NA的结合模式
胡建平1,2,柯国涛1,常 珊1,陈慰祖1,王存新1
(1.北京工业大学生命科学与生物工程学院,北京100124;2.乐山师范学院化学与生命科学系,乐山614004)
摘要 用分子对接方法研究了H I V21整合酶(I ntegrase,I N)二聚体与3′端加工(3′Pr ocessing,3′2P)前的8
bp及27bp病毒DNA的相互作用,并获得I N与27bp病毒DNA的特异性结合模式.模拟结果表明,I N有特异性DNA结合区和非特异性DNA结合区;I N二聚体B链的K14,R20,K156,K159,K160,K186,K188,
R199和A链的K219,W243,K244,R262,R263是I N结合病毒DNA的关键残基;并从结构上解释了能使
I N发挥活性的病毒DNA的最小长度是15bp.通过分析结合能发现,I N与DNA稳定结合的主要因素是非极
性相互作用,而关键残基与病毒DNA相互识别主要依赖于极性相互作用.模拟结果与实验数据较吻合.
关键词 H I V21整合酶;病毒DNA;分子对接;结合模式;药物分子设计
中图分类号 O641 文献标识码 A 文章编号 025120790(2008)0721432206
H I V21整合酶(I ntegrase,I N)是H I V21病毒生命周期中必不可少的三个酶之一[1],是研究抗H I V 药物的一个重要靶点.I N能介导逆转录病毒DNA整合到宿主细胞DNA中,整合过程包括两步反应:第一步为3′端加工(3′Pr ocessing,3′2P)[2],在宿主细胞浆内,I N切除病毒DNA3′末端的2个核苷酸,暴露出末端为CA碱基的羟基;第二步是链转移(Strand Transfer,ST)[3],在细胞核内,I N交错切割宿主细胞DNA,产生间隔为5个碱基的交错切口,然后病毒DNA的3′末端带自由羟基的CA碱基与宿主DNA的5′端共价连接起来,通过修复连接起一个整合DNA,并随着宿主DNA的复制而复制[2].
H I V21I N含有288个氨基酸残基,折叠成3个结构域,分别是N末端结构域(N2ter m inal domain, NT D)、催化核心结构域(Catalytic core domain,CCD)和C末端结构域(C2ter m inal domain,CT D).实验结果表明,二聚体是I N发挥生物活性的最小结构单位[4,5].光偶联及一系列突变实验[6～9]给出了I N结合病毒DNA的一些关键残基,并指出I N活性是依赖底物病毒DNA长度的.病毒DNA越长,I N活性越大,15bp长度的病毒DNA是I N发挥活性所需要的最小长度.Luca等[5]用分子对接方法分析了3′2 P后的27bp病毒DNA(已切除3′末端2个核苷酸)与I N二聚体的结合模式.生理状态下,病毒DNA 先与I N结合后再发生3′2P反应.随之,I N和病毒DNA的构象将发生一定变化,所以3′2P反应前后的结合模式可能会有所不同[2].
以前的研究没有涉及到病毒DNA与H I V21I N的结合分布区及分布区与DNA长度的相关性等关键问题.本文用分子对接方法研究了3′2P反应前的8bp和27bp的病毒DNA[6,7]与H I V21I N二聚体的相互作用,提出了一个H I V21I N二聚体与3′2P反应前病毒DNA的结合模式,并用能量分解方法分析了关键残基的能量信息.计算结果与实验数据吻合得较好,为基于H I V21I N的药物分子设计提供了一定的结构信息.
1 体系与方法
由于H I V21I N二聚体的晶体结构还没有解析出来,本文通过组装蛋白质数据库(Pr otein data bank,P DB)中I N不同片段的晶体结构获得I N二聚体结构.I N二聚体的模建用Jackal程序包[10]完
收稿日期:2007209221.
基金项目:国家自然科学基金(批准号:30670497,30500429)和北京市自然科学基金(批准号:5072002)资助.
联系人简介:王存新,男,教授,博士生导师,主要从事生物信息学研究.E2mail:cx wang@https://www.wendangku.net/doc/758559486.html,
成.模建过程如下:保留晶体结构1QS4[11]
中A 和B 链的核心结构域,去除其中的配体、结晶水及C
链并把4个缺失残基Ile141,Pr o142,Tyr143和A sn144依据1B I S [12]
中B 链的同源区域补全.将晶体结构中的两个突变残基F158K 和W 131E 替换为天然的残基,得到的野生型核心结构域二聚体的A 和B
链分别包含一个Mg 2+
.
按照包含双金属离子的与H I V 21I N 高度同源的鸟肉瘤病毒I N 结构1VSH [13],将第二个Mg 2+
放置
于A 和B 链相应的位置.将双金属I N 二聚体核心区与P DB 代码为1EX4[4]和1K6Y [14]
的结构依次叠
落以获得全长的I N 二聚体.最后再叠落P DB 代码为1WJD [15]
的结构以补全缺失的47255号残基.用SY BY L 软件
[16]
B i opoly mer 模块搭建8bp 和27bp 双链病毒DNA 结构,序列分别是CT AGCAGT/com 2
p le ment [6]
和T AGT CAGTGTGG AAAATCT CT AGCAGT/comp le ment [7]
.用最陡下降法和共轭梯度法分别对I N 和2个病毒DNA 体系进行10000步的能量优化,将其作为分子对接前的初始模型.
分子对接采用DOT 程序[17]
.对接时不考虑受体和配体分子的柔性,分子间相互作用能包括静电
和范德华项.I N 受体分子的电势场采用AP BS 程序[18]
计算得到,采用的参数为离子浓度150mmol/L,溶剂介电常数为80,蛋白质内部介电常数为1,其它参数均为缺省值.病毒DNA 配体分子的范德华吸引层的宽度设为013n m ,格点数是128×128×128,两个分子通过旋转和平移搜索超过3770亿个构象(128×128×128×180000),所有计算在含有48个I ntel Pentiu m ⅣCP U 节点的PC 集群上完成.能量
分解采用G BS A (Generalized Born /Surface A rea )方法[19,20]
,基本思想是将每个残基的能量贡献近似分
为分子力学方法计算的真空下分子内能,采用广义波恩(Generalized Born,G B )模型[21～23]
计算的极性溶剂化能和LCP O 模型[24,25]
计算的非极性溶剂化能,并且将能量分解到残基的主链原子和侧链原子上.通过能量分解可以考察I N 中主要残基对于与底物DNA 分子结合的贡献.
2 结果与讨论
2.1 结合区域
图1给出了3′2P 反应前8bp 和27bp 病毒DNA 与H I V 21I N 二聚体对接的总能量(包括范德华和静电能)最低的前1000个构象分布.从图1(A )可以看出,8bp 病毒DNA 主要结合到I N 的2个区域.如图1(A )所示,区域1是由B 链的CCD ,NT D 与A 链的CT D 组成的口袋,而区域2是由A 链的NT D
与B 链的CT D 组成的口袋.区域2通常被认为是I N 的非特异性DNA 结合区[5,26].Zhu 等[27]
从CT D 二聚体(P DB 代码1QMC )结构出发,用Aut odock 对接方法研究H I V 21整合酶CT D 区域的二核苷酸小分子DNA 结合位点,结果表明,二核苷酸小分子DNA 结合在两个CT D 二聚体的外侧对称表面,这一点与本文获得的区域2的结果完全一致
.
F i g .1 D ock i n g results of the 8bp seg m en t of v i ra l D NA(A)and its 27bp seg m en t(B)
w ith H I V 21I N,respecti vely
The geometric centers of DNA are shown in gray balls,and the rep resentative confor mati ons of DNA in a certain regi on are shown with the black arr ow model .The gray s olid ribbon model indicates the p r otein model and the t w o Mg 2+are dis p layed with the CPK model .
观察结合到区域1的8bp 病毒DNA 的走向发现,DNA 主轴是垂直于B 链CCD 指向A 链CT D 的方向,目前所报道的实验结果都没有提到这种结合模式,该模式可能与病毒DNA 和I N 二聚体在该区
域有较好的几何匹配有关.从图1(B )可以看出,27bp 病毒DNA 主要结合在区域1,分布在区域2的
3
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胡建平等:用分子对接方法研究H I V 21整合酶与病毒DNA 的结合模式
构象较少.区域1中的27bp 病毒DNA 的走向,除了保持有8bp 病毒DNA 的走向之外,出现了一些与实验结果相吻合的结合模式.Chen 等[4]
认为底物病毒DNA 结合到I N 二聚体中一条沿B 链CCD 到A 链CT D 的狭长正电区域带,参与结合的氨基酸残基是B 链的K159,K186,R187和K188到A 链K211,K215,K219,K243,R263和R264.文献[4]中1EX4体系没有NT D,如果补全NT D,这条正电
荷带还要通过B 链的NT D.
通过结合区分析可知,随着病毒DNA 长度的变大,H I V 21I N 与病毒DNA 的有生物活性的有效结
合出现的可能性在变大,Lee 等[8]
在体外用荧光共振能量转移方法研究H I V 21I N 的实时反应动力学,结果表明,I N 的催化功能依赖于底物病毒DNA 长度,底物越长,活性越大.2.2 结合模式
3′2P 反应前的27bp 病毒DNA 主要结合到I N 的4个位置,即B 链CCD 的α4螺旋区(150～165),B 链CCD 的α5螺旋与α6螺旋区之间的无规卷曲区(186～195),B 链的NT D 的α1螺旋(4～15)和α2螺旋区(19～26),A 链CT D 的W 243和R263之间的β片区
.
F i g .2 Key resi dues i n teracti on s of H I V 21I N w ith the ba ses of the 27bp seg m en ts of
v i ra l D NA a t the four d i fferen t sites[(A)—(D )]
(A )Helix 4regi on of CCD in chain A of H I V 21I N ;(B )the coil regi ons bet w een helix 5and helix 6of CCD in chain A;(C )the helix 1and 2regi ons of NT D in chain A;(D )the βsheet regi ons fr om W243t o R263of CT D in chain B.The contact residues are shown as one letter and the sticks model,and the other residues are shown in the ribbon model .The contact bases are shown with one letter and line model .
图2给出了病毒DNA 与I N 四个结合位置的相互作用.图2(A )列出了3′2P 反应活性部位在病毒DNA 附近014n m 以内的接触残基.由图2(A )可以看出,接触残基有S153,K156,E157和K159,尤其是K156和K159与3′端切除碱基G262T27的互补碱基A282C29以及相邻碱基A25和T30都有相互
作用,这与Es posit o 等[6]
的突变实验所提出的K156和K159参与3′2P 反应一致.A 链CCD 无规卷曲区(186～195)的接触残基有K186,R187,K188,G189,G190,I 191,G192.A 链NT D 与病毒DNA 相互作用的残基有E11,Y15,R20,D25.图2(D )显示了唯一能与病毒DNA 结合的H I V 21I N 的另一条链
4
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上的CT D 残基有W 243,K244,G245,E246,G247,A248和R263.
美国国家癌症研究中心(N I C )基于实验信息搭建了H I V 21I N 四聚体与病毒DNA 结合的复合物结构.并提出,至少K156,K159,K160,R20,W 243,K244,R263和K264都参与和病毒DNA 的结合
[28]
.本文对接得到的复合物结构与其搭建的复合物基本吻合.
实验结果
[9]
表明,病毒DNA 3′末端的15个bp 长度是3′2P 反应所必需的最低限,而且H I V 21I N 催化双股的DNA 比单股的DNA 效率更高.从图2(A )可以看出,H I V 21I N A 链CCD 搭在A25上,而B 链的NT D 端结合的第一个碱基是G11,在结构上有14bp 的间隔,空间距离大约是4176n m.并且DNA 两条链都要参与结合H I V 21I N ,这也部分解释了I N 催化双股的DNA 比单股的DNA 效率更高的
原因.从上面的分析还可以看出,H I V 21I N 的三个结构域都参与了与病毒DNA 结合,H I V 21I N 的二聚体的两个单体也都参与了与病毒DNA 结合.由此可见,完整二聚体是I N 发挥生物活性的结构基础,这些与实验结果一致
[4]
.
值得注意的是,病毒DNA 末端的两个在3′2P 反应中被切除的碱基G262T27与I N 无相互作用.参与到后续的ST 反应的碱基A25与H I V 21I N 的残基K156有相互作用,同时A25的互补碱基T30也与K156有相互作用,可见碱性残基K156是H I V 21I N 结合病毒DNA 的关键残基.与Luca 等[5]
提出的结
合模型相比,发现其结合区域相同,但病毒DNA 刚好绕DNA 主轴旋转90°.本文中的病毒DNA 采用
3′2P 反应前的未切除末端碱基G262T27的结构,而Luca 等[5]
用的是切掉末端碱基的病毒DNA.由此
可见,结合到H I V 21I N 的未切割的病毒DNA 经过3′2P 反应后,DNA 构象发生了一定的旋转.
2.3 氢键及结合能
为了考虑体系柔性对结合模式的影响,通过200p s 的分子动力学(Molecular dyna m ics,MD )模拟对结构进行初步修正,并分析了病毒DNA 与H I V 21I N 之间的氢键信息.模拟采用AMBER 程序[29,30]
,
氢键分析采用几何判据
[31]
,即受体原子2氢原子2供体原子角度不小于135°,受体原子2供体原子间距
离小于0135n m.表1列出了I N 和27bp 病毒DNA 之间的氢键对.B 链R199,R20,K159,K156与病毒DNA 碱基形成较为稳定的氢键.与参与3′2P 反应的A25附近的碱基形成稳定氢键的关键残基有K156和K159.
对比分析表1和图2发现,氢键与接触残基信息有一些变化.R199不属于接触残基,但通过MD 模拟后,R199与A22形成了稳定的氢键,N I C 搭建的模型
[28]
也提出残基R199参与结合病毒DNA.从表1可知,与病毒DNA 形成氢键的残基大部分是碱性残基(除了B 链W 243以外),在I N 二聚体表面形成了一个带正电荷的区域,是带负电荷的病毒DNA 结合的较好位置.由MD 模拟轨迹发现,I N 的B 链残基K160,K186和K188与碱基T21和A22形成的氢键较弱,主要是因为角度的几何判据不符合(角度略小于135°).值得注意的是,R263是碱基T49的接触残基,经过MD 模拟后的R263却与碱基G50形成了氢键,这是由于病毒DNA 在水溶液中有较大柔性所致.
Table 1 Hydrogen bonds for m ed between H I V 21I N and the 27bp segm en ts of v i ra l D NA
Donor a
Accep t or b D istance c /nm Angle d /(°)Freq .
e
(%)
R199′2NH22HH22A222O1P 0.28±0.008155.75±9.7583.17 R20′2NH12HH12A382O2P 0.283±0.008160.16±9.9471.39 K159′2NZ 2HZ1C292O2P 0.278±0.009155.72±13.0959.4 K156′2NZ 2HZ3T302O40.282±0.008159.18±9.9556.44 R199′2NH12HH11A222O1P 0.283±0.009151.40±9.3247.52 W2432NE12HE1G112O3′0.289±0.006159.03±10.4445.73 R2622NH12HH12T102O1P 0.281±0.008159.17±9.4541.58 R2632NH22HH21G502O2P 0.281±0.008149.65±9.1439.72 K1862NZ 2HZ1A222O2P 0.27±0.008148.92±8.3322.77 K160′2NH12HH12
A222N7
0.283±0.005
138.44±7.25
7.85
a .Donor at om s,the apostr ophe in the upper right corner of the number is used t o define B chain of the p r otein;
b .recep t or at om s;
c .the do 2
nor 2recep t or distance;d .the angle of donor 2hydr ogen 2recep t or;e .the occupancy frequency of hydr ogen bond means the p r obability of hydr ogen bond occurring in the MD si m ulati on .
5
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表2列出了I N与病毒DNA结合能(ΔE
tot
)低于-13kJ/mol的残基信息.从表2可知,这些残基
基本上是碱性残基(除W243外),分子内范德华相互作用能(ΔE
VDW )和非极性溶剂化能(ΔE
G B S UR
)都有
利于I N与底物的结合;极性溶剂化能(ΔE
G B
)不利于与底物的结合,但是这些残基的分子内静电相互
作用能(ΔE
LE
)有利于结合底物DNA的趋势超过了极性溶剂化能的不利因素.
总之,关键残基的极性相互作用(ΔE
LE
+ΔE G B)和非极性相互作用(ΔE VDW+ΔE G BS UR)都有利于I N
与病毒DNA的结合,而且极性相互作用是最主要的.I N所有残基与病毒DNA的ΔE
LE
,ΔE VDW,ΔE G B,
ΔE
G B S UR
的总和分别是-8831109,-170167,879412和-23112kJ/mol.可见,I N的极性相互作用
(ΔE
LE
+ΔE G B)和非极性相互作用(ΔE VDW+ΔE G BS UR)都有利于结合病毒DNA,但主要因素是非极性相互作用.关键残基(基本是碱性残基)只有不到20个,而I N二聚体的非极性和酸性残基的个数远远大于碱性残基.占绝大多数的非极性残基和酸性残基的极性相互作用很弱,甚至还不利于结合病毒DNA,所以I N与DNA结合主要是靠非极性相互作用推动.
Table2 Energy deco m positi on of the key resi dues of H I V21I N b i n d i n g w ith the v i ra l D NA Residue aΔE LE bΔE VD W cΔE G B dΔE G BS UR eΔE t ot f
K186′-1293.33-2.551251.3-1.17-45.75
R199′-1290.98 1.171245.48-0.71-45.04
R20′-1359.82-2.631326.28-0.88-37.01
K188′-1347.77-6.521326.7-1.05-28.65
R263-1207.68-6.191187.35-0.84-27.35
R262-1280.78-3.891265.06-0.46-20.07
K159′-951.66-2.8935.35-0.5-19.57
K14′-1217.67-1.091202.79-0.04-16.02
K160′-1256.77-5.351247.7-1.09-15.52
R187′-1083.22-4.181072.52-0.29-15.18
K244-1159.92-3.141149.88-0.38-13.59
K219-1105.14-0.161092.130-13.13
W243-52.78-10.0849.93-1.25-13.02
Total-14607.5-47.3814352.46-8.66-309.89
a.The apostr ophe in the upper right corner of the number is used t o define B chain of the p r otein,and the unit of all the values is in kJ/mol;
b.electr ostatic energy;
c.van derW aals energy;
d.hydr ophilic contributi on t o s olvati on free energy;
e.hydr ophobic contributi on t o s olvati on free energy;
f.ΔE t ot=ΔE LE+ΔE VD W+ΔE G B+ΔE G BS UR.
从表2还可知,A链残基W243也是有利于I N二聚体和病毒的DNA结合,它主要是靠非极性相互作用,这与其侧链(吲哚基)是一个较大的疏水基团有关.以前的研究对B链K14涉及不多,通过分析静电相互作用可知,B链残基K14对于结合病毒DNA也十分重要.
本文用分子对接方法获得了3′2P反应前27bp病毒DNA与H I V21I N得到的实验数据较好地支持了结合模式.从结构的角度解释了实验中H I V21I N只能催化15bp以上的病毒DNA的原因.最后通过能量分析发现,非极性相互作用是I N与DNA结合的主要推动力,但关键残基与DNA之间的相互识别主要依赖极性相互作用.
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Stud i es on the B i n d i n g M odes of H I V 21I n tegra se w ith V i ra l D NA via M olecul ar D ock i n g M ethod
HU J ian 2Ping 1,2
,KE Guo 2Tao 1
,CHANG Shan 1
,CHE N W ei 2Zu 1
,WANG Cun 2Xin
13
(1.College of L ife Science and B iological B ioengineering,B eijing U niversity of Technology,B eijing 100022,China;
2.D epart m ent of Che m istry and L ife Science,L eshan N or m al U niversity,L eshan 614004,China )
Abstract H I V 21integrase (I N )integrates the viral DNA int o the host cell chr omos ome,ho wever,the bind 2ing mode of I N with the viral DNA and the integrati on mechanis m re main unclear .
I n this paper,molecular
docking method was used t o investigate the interacti ons of H I V 21I N di m er with the 8bp and 27bp seg ments of
viral DNA before the 3′p r ocessing (3′2P )reacti on,and the s pecific binding mode bet w een I N and its sub 2strate 27bp seg ments of viral DNA was obtained .The results show that I N has one s pecific DNA 2binding re 2gi on and another non 2s pecific DNA 2binding regi on .The key residues f or I N di m er binding with viral DNA are K14,R20,K156,K159,K160,K186,K188,R199residues in chain B and K219,W 243,K244,R262,R263residues in chain A.The exp lanati on f or the m ini m u m length of 15bp viral DNA t o activate I N was giv 2en on the basis of the docked comp lex structure .Thr ough the analysis of the binding energy,it was f ound that non 2polar interacti ons are the p rinci pal fact or favoring the binding bet w een I N and DNA;whereas,the stable ass ociati on of viral DNA with the key residues are mainly driven by polar interacti ons .The si m ulati on results basically agree with the experi m ental data,which p r ovide us with s ome structural infor mati on f or the drug de 2sign on the basis of the structure of H I V 21I N .
Keywords H I V 21integrase;V iral DNA;Molecular docking;B inding mode;D rug molecule design
(Ed .:Y,I )
7
341 No .7
胡建平等:用分子对接方法研究H I V 21整合酶与病毒DNA 的结合模式
DNA分子标记技术及其应用
DNA分子标记技术及其应用 摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。最后探讨了其进展以及存在的一些问题。 关键词：分子标记；应用 分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。 1DNA分子标记的概念 遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。 2分子遗传标记技术的种类 2.1RFL P标记 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性)标记,是人类遗传学家Botstein等于1980年提出的,是以Southern杂交为核心的第一代分子标记技术。它是用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,用印迹转移杂交的方法检测同源序列酶切片段在长度上的差异。这种差异是由于变异的产生或是由于单个碱基的突变所导致的限制性位点增加或消失,或是由于DNA序列发生 插入、缺失、倒位、易位等变化所引起的结构重排所致。其差异的检测是利用标记的同源序列DNA片段作探针进行分子杂交,再通过放射自显影(或非同位素技术)实现的。 与传统的遗传标记相比,RFL P标记具有下列优点: (1)RF LP标记无表型效应,其检测不受外界条件、性别及发育阶段的影响；
【免费下载】 习题-第四章病毒基因组
第四章病毒基因组 一、A型题： 1. 只含小分子量RNA而不含蛋白质的病毒称（） A. 类病毒（Viroids） B. 卫星（Satellites） C. 类病毒（viroid） D. 朊病毒（Prions） E. 拟病毒（virusoid） 2. 只含蛋白质而不含核酸的的病毒称（） A. 类病毒（Viroids） B. 卫星（Satellites） C. 类病毒（viroid） D. 朊病毒（Prions） E. 拟病毒（virusoid） 3. RNA病毒基因组的帽子结构与第二个核苷酸相连的化学键（） A. 5＇，5＇-三磷酸二酯键 B. 3＇，3＇-三磷酸二酯键 C. 5＇，5＇-磷酸二酯键 D. 3＇，5＇-磷酸二酯键 E. 以上都不是 4. HBV基因组是（） A. 完全双链DNA分子 B. 不完全双链DNA分子 C. 完全双链RNA分子 D. 不完全双链RNA分子 E. 单链DNA分子 5. 具mRNA模板活性的病毒基因组是（） A. 正链DNA病毒 B. 负链DNA病毒 C. 负链RNA病毒 D. 逆转录科的正链RNA病毒 E. 正链RNA病毒（逆转录科的正链RNA 病毒除外） 6. 关于逆转录病毒叙述不正确的是（） A. 迄今发现的RNA肿瘤病毒均属RNA逆转录病毒 B. 嗜肝DNA病毒科属DNA逆转录病毒。 C. 逆转录病毒RNA为正链 D. 病毒颗粒均携带逆转录酶 E. 前病毒DNA可以整合到宿主细胞染色体DNA中 7. 逆转录病毒基因组的结构特点不包括（） A. 5＇端帽子结构 B. 3＇端poly(A)尾 C. 两端各有一个长末端重复序列（LTR） D. 编码逆转录酶 E. 神经酰胺酶 8. 分段基因组（segmented genome）是指病毒基因组（） A. 由数条不同的核酸分子组成 B. 由数条相同的核酸分子组成 C. 由数条互补的核酸分子组成 D. 由可分成不同功能区段的一个核酸 分子组成 E. 以上都不对 9. HBV基因组序列的利用率（编码基因效
DNA分子标记及其优缺点
DNA分子标记种类及相应的优缺点 摘要： 对RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR 等常用的DNA 分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( SNP、EST 等) 的原理、特点进行了综述,并对各自的优缺点进行了探讨。 关键词：DNA分子标记优缺点 分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种较为理想的遗传标记形式,它以蛋白质、核酸分子的突变为基础,检测生物遗传结构与其变异。分子标记技术从本质上讲,都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映生物个体之间的差异。每一种分子标记都有其自身的特点和特定的应用范围,但就一般意义而言,DNA 分子标记与形态标记和生化标记等相比,具有许多独特的优点: ①不受组织类别、发育阶段等影响。植株的任何组织在任何发育时期均可用于分析。 ②不受环境影响。因为环境只影响基因表达(转录与翻译) ,而不改变基因结构即DNA 的核苷酸序列。③标记数量多,遍及整个基因组。④多态性高,自然存在许多等位变异。⑤有许多标记表现为共显性,能够鉴别纯合基因型和杂合基因型, 提供完整的遗传信息。⑥DNA 分子标记技术简单、快速、易于自动化。⑦提取的DNA 样品,在适宜条件下可长期保存,这对于进行追溯性或仲裁性鉴定非常有利。因此,DNA 分子标记可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题,因而在品种鉴定方面展示了广阔的应用前景。 1. 1 第1 代分子标记 1.1. 1 RFLP 标记技术。1980 年Botesin提出的限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphisms ,RFLP) 可以作为遗传标记,开创了直接应用DNA 多态性的新阶段,是最早应用的分子标记技术 。RFLP 是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小,反映DNA 分子上不同酶切位点的分布情况,因此DNA 序列上的微小变化,甚至1 个核苷酸的变化,也能引起限制性内切酶切点的丢失或产生, 导致酶切片段长度的变化。 优点：RFLP 标记的等位基因具有共显性的特点,结果稳定可靠,重复性好,特别适应于构建遗传连锁图。 缺点：在进行RFLP 分析时,需要该位点的DNA片段做探针,用放射性同位素及核酸杂交技术,既不安全又不易自动化。另外,RFLP 对DNA 多态性检出的灵敏度不高,RFLP 连锁图上还有很多大的空间区。 1.1. 2 RAPD 标记技术。为了克服RFLP 技术上的缺点,Williams
第八章 分子标记及其应用
第八章分子标记及其应用 1)分子标记的种类与特点 1. 遗传标记的种类与特点 遗传标记：指可以稳定遗传的、易于识别的特殊遗传多态性形式。Minisatellites：小卫星序列 遗传标记的种类与特点 1）形态标记：肉眼可见的特征性状，简单实用，但数目少，受发育阶段与环境影响。 2）细胞标记：染色体核型与带型，受环境影响小，稳定可靠，但耗时耗力，信息量不足。 3）生化标记：贮藏蛋白、同工酶等，信息量较大，取材方便，但不能反映基因组非编码区信息，仍受发育阶段与环境影响。 4）DNA分子标记：基因组DNA 水平的变异，理想的遗传标记。 2. DNA分子标记 DNA分子标记：简称分子标记，指基因组DNA 水平上的任何差异，来自缺失、插入、置换、颠换、重复等，通常以分子杂交或凝胶电泳图谱的形式体现。 2.1 分子标记的优点 1）数量多，遍及整个基因组，理论上检测位点近乎无限； 2）稳定遗传，不受环境、发育阶段和是否表达等限制; 3）多态性高，自然存在，无须专门创造； 4）表现为“中性”，即不影响性状的表达； 5）许多为共显性，能鉴别杂合与纯合，提供完整的遗传信息。 2.2 分子标记的类型 分三大类: 1)基于核酸分子杂交: 第一代，1980s, RFLP（Restriction fragment length polymorphism ），限制性片段长度多态性 2)基于PCR或限制酶切+PCR: 第二代，1990s ,RAPD、AFLP、SSR、ISSR、
SCAR、STS等 3)基于DNA测序:第三代，近年来SNP和EST,反转录转座子等 第三节分子标记的应用 1. RFLP标记 RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)：限制性片段长度多态性，1980，Botstein。 基本原理：不同基因组DNA经特定限制酶消化后产生大小不等的片段，再经电泳分离、Southern 印迹杂交和检测后，得到特异的RFLP 标记，它反映不同DNA 对所用探针限制性酶切片段长度的多态性，实际是酶切位点的变化和分布情况。关键因素： 限制酶：用一种酶切产生的多态性有限，常用6~8种酶来筛选多态性。 探针：常用单拷贝或低拷贝gDNA或cDNA克隆，否则条带模糊（smear），不易观察。 RFLP标记的优缺点 优点： 1）共显性； 2）存在于整个基因组，位点数不受限制，常可检测到1~4个基因座； 缺点： 1）筛选多态性探针较困难，需一系列探针； 2）DNA样本量要求大，操作较繁杂，耗时费资，同位素污染，现已发展地高辛等标记。 2. RAPD 标记 RAPD (Random amplified polymorphic DNA)：随机扩增多态性DNA。1990年提出。 基本原理: 单引物PCR标记；不同基因组DNA在随机引物Arbitary primer （8~10bp）结合位点以及2个结合位点之间的距离可能不同，导致扩增片段数目和长度不同，经电泳分离显示出来，反映基因组相应区域DNA的多态性。