生物工艺学思考题

第一章到第八章复习题

1、工业化菌种的要求？

(1)原料廉价、生长迅速、繁殖能力强、目的产物产量高。
(2)发酵中产生的泡沫少，易于控制培养条件，酶活性高，发酵周期短。
(3)抗杂菌和噬菌体的能力强。
(4)不产生或少产生与目标产物相近的幅产物。
(5) 菌种遗传性稳定，不易变异和退化
(6)不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证安全生产。


2、自然界分离微生物的一般操作步骤？

样品的采取→预处理→培养→菌落的选择

初筛→复筛→性能的鉴定→菌种保藏


3、什么叫自然选育？自然选育在工艺生产中的意义？

自然选育就是不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程。
自然选育在工业生产上的意义：

自然选育可以有效地用于高性能突变株的分离。

自然选育虽然突变率很低，但却是工厂保证稳产高产的重要措施。

4、什么是诱变育种？常用的诱变剂有哪些？什么是培养基?发酵培养基的特点？

用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种

诱变剂：物理：紫外，X射线，β射线，快中子等

化学：硫酸二乙酯（EDS），亚硝基胍等


5、发酵生产用的碳源有哪些？常用的糖类有哪些，各自有何特点？

碳源:糖类（淀粉、葡萄糖、蔗糖等）、油脂（动、植物油）、有机酸（琥珀酸、柠檬酸、乳酸、乙酸等）和低碳醇（甲醇、乙醇等）。
糖类:葡萄糖，所有的微生物都能利用葡萄糖，但是会引起葡萄糖效应

糖蜜，是制糖生产时的结晶母液，它是制糖工业的副产物。主要含有蔗糖，总糖可达50%～75%。一般糖蜜分甘蔗糖蜜和甜菜糖蜜葡萄糖蜜。

淀粉、糊精，缺点：难利用、发酵液比较稠、一般>2.0%时加入一定的α-淀粉酶。成分比较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等等。优点：来源广泛、价格低，可以解除葡萄糖效应。


6、什么是生理性酸性物质？什么是生理性碱性物质？

无机氮源被菌体作为氮源利用后，培养液中就留下了酸性或碱性物质，这种经微生物生理作用（代谢）后能形成酸性物质的无机氮源叫生理酸性物质，如硫酸胺，若菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。正确使用生理酸碱性物质，对稳定和调节发酵过程的pH有积极作用。


7、常用的无机氮源和有机氮源有哪些？有机氮源在发酵培养基中的作用？

常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉、蛋白胨等；常用的无机氮源有氨水、铵盐和硝酸盐。
有机氮源在发酵培养基中的作用有：作为菌体生长繁殖的营养；有些还是某些产物合成的

前体


8、什么是前体？前体添加的方式？

前体指某些化合物加入到发酵培养基中，能直接彼微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的结构并没有多大变化，但是产物的产量却因加入前体而有较大的提高。前体使用时普遍采用流加的方法。

9，什么是生长因子？生长因子来源？

凡是微生物生长不可缺少而细胞自身不能合成的微量的有机物质，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等均称生长因子。

有机氮源是这些生长因子的重要来源


10、什么是产物促进剂？产物促进剂举例？

是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。如：链霉素生产加巴比妥，赖氨酸生产加红霉素等。如加入微量的“九二O”可以促进某些放线菌的生长，缩短发酵周期，提高抗生素的产量，因此起到生长因素的作用。还有在四环素发酵中加入硫氰化苄，菌体呼吸强，糖代谢快，而抗生素合成受阻，所以降低菌体呼吸，产量就会提高。



11、培养基设计的一般步骤？

1. 生态模拟

2. 查阅文献：直接、间接的信息。

3. 借助优选法或正交试验法精心设计培养基的配方。

4. 试验比较：实验规模一般由定性到定量，由小到大。

摇瓶、反应器培养基研究的两个层次

摇瓶——培养基设计的第一步

反应器—最终的优化的基础配方


12、什么是种子的扩大培养？

种子扩大培养是发酵生产的第一道工序。就是将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接种到试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。


13、种子扩大培养的目的与要求、一般步骤？

（1）目的：其任务是要得到纯而壮的培养物，获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。

（2）种子的要求：

总量及浓度能满足要求

生理状况稳定，个体与群体

活力强，移种至发酵后，能够迅速生长

无杂菌污染

（3）一般步骤：

休眠孢子→母斜面活化→摇瓶种子或茄子瓶斜面或固体培养基孢子→一级种子罐→二级种子罐→发酵罐


14、在大规模发酵的种子制备过程中，为什么包括实验室阶段和生产车间阶段？

实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培养。对于产孢子的微生物，获得一定数量和质量的孢子或一定数量和质量

的菌丝体。

生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。菌丝体比孢子要有利：缩短发酵时间，有利于获得好的发酵结果。


15、什么是接种量？

移入种子的体积

接种量＝ ————————

接种后培养液的体积


16、什么时发酵级数？什么是种子罐种子？发酵级数对发酵有何影响，影响发酵级数的因素有哪些？


17、什么是种龄？种龄确定的依据？

种龄是指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

原则：对数生长期末，细胞活力强，菌体浓度相对较大，但是最终由实验结果定。


18、什么是接种、倒种、双种？

接种：接入种子罐后直接移种到发酵罐。

双种：两个种子罐种子接种到一个发酵罐中。

倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发酵罐。


19、什么是湿热灭菌、分批灭菌、连续灭菌？

湿热灭菌：直接用饱和蒸汽进行灭菌。

分批灭菌：就是将配制好的培养基放在发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行加热灭菌的过程，通常也称为实罐灭菌。

连续灭菌：培养基在发酵罐外经过一套连续灭菌设备，以比分批灭菌高的温度和较短的时间进行快速连续加热灭菌，并快速冷却，再立即输入预先经过空罐灭菌后的发酵罐中。


20、在发酵过程中无菌空气是如何获得的？

除去或杀灭空气中的微生物，

加热灭菌、辐射杀菌、静电除菌、过滤除菌。


21、什么是菌体的比生长速率？产物的比形成速率？基质的比消耗速率？

菌体的比生长速率：单位重量的菌体瞬时增量

μ=（dx/dt）/x；单位为1/h，其中x—菌体浓度（ g/L ）

产物的形成比速：单位时间内单位菌体形成产物（菌体）的量

π=（dp/dt）/x,；单位为1/h，其中p—产物浓度（ g/L ）

基质的比消耗速率:单位时间内单位菌体消耗基质的量

=（ds/dt）/x；单位为1/h，其中s—底物浓度（ g/L ）


22、什么是Monod方程其使用条件如何？各参数的意义与求解？

当培养基中不存在抑制细胞生长的物质时，细胞的生长速率与基质浓度关系（Monod方程式）如下：

μ=μmax S/（Ks+ S）

μ：菌体的生长比速

S：限制性基质浓度

Ks：半饱和常数

μmax: 最大比生长速度

Monod方程的参数求解(双倒数法)：

将Monod方程取倒数可得：

1/μ=1/μmax+ Ks/μmax S或

S/μ= S/μmax+ Ks/μmax

这样通过测定不同限制性基质浓度下，微生物的比生长速度，就可

以通过回归分析计算出Monod方程的两个参数。


23、 什么是一类发酵？二类发酵？三类发酵？

一类发酵：产物形成与底物利用直接相关，为生长联系型，又称简单发酵型，产物直接由碳源代谢而来，产物生成速度的变化与微生物对碳源利用速度的变化是平行的，产物生成与微生物的生长也是平行的。在这些发酵过程中，菌体的生长、基质的消耗、产物的生成三个速度都有一个高峰，三高峰几乎同时出现。

二类发酵：产物形成与底物利用间接相关，为部分生长联系型，又称中间发酵型，产物不是碳源的直接氧化产物，而是菌体代谢的主流产物。它的特点是在发酵的第一时期碳源大量消耗用于菌体的迅速增长而产物的形成很少或全无，第二时期碳源大量消耗用于产物的高速合成及菌体的生长。

三类发酵：产物形成与底物利用不相关，为非生长联系型，又称复杂发酵型，产物的生成在菌体生长和基质消耗完以后才开始，与菌体生长不相关，与基质消耗无直接关系，所形成的产物为次级代谢产物。


24、 什么是连续培养？什么是连续培养的稀释率？

由于新鲜培养基不断补充，所以不会发生营养物的枯竭，另一方面，发酵液不断取出，发酵罐内的微生物始终处于旺盛的指数生长期，罐内细胞浓度X、比生长速率μ、以及t, pH等都保持恒定。

稀释率(D):补料速度与反应器体积的比值(h-1)


25、 为何氧容易成为好氧发酵的限制性因素？

氧是需氧微生物生长所必需的。氧往往容易成为控制因素，是因为氧在水中的溶解度很低，培养基因含有大量的有机和无机物质，氧的溶解度比水中还要更低。在对数生长期即使发酵液中的氧浓度达到饱和，若此时终止供氧，发酵液中的溶氧可在几分钟内全部耗尽，使溶氧成为控制因素。


26、比耗氧速度和呼吸强度的概念？

比耗氧速度：单位质量的细胞（干重）在单位时间内消耗氧的量即比耗氧速率（呼吸强度）来表示：

QO2 =(QO2 ）max × CL /(K0 +CL ）

QO2比耗氧速率(mmol O2/g菌·h)，CL溶解氧浓度， K0氧的米氏常数（ mol/ m3 ），(QO2）max 最大比耗氧速率(mmol O2/g菌·h )



27、 临界溶氧浓度、氧饱和度的概念？

临界氧浓度：CCr临界氧浓度：指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。

氧饱和度：发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度


28、 影响微生物需氧的因素有哪些？

细胞浓度直接影响培养液的摄氧率，在分批发酵中摄氧率变化很大，不同生长阶段需氧不同，对数生长后期达最大值。

培养基的成分和浓度显著影响微生物的摄氧率，碳源种类对细胞的需氧量有很大影响，一般葡

萄糖的利用速度比其他的糖要快。


29、发酵液中的体积氧传递方程？其中Kla的物理意义是什么？

以单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为 a (m2/m3)

OTR=KLα (C* –CL ）

KLα以氧浓度为推动力的容积氧传递系数，反映了设备的供氧能力


30、 如何调节摇瓶发酵的供氧水平？

往复，频率80-120分/次，振幅8cm

旋转，偏心距转速250rpm

装液量，一般取1/10左右：

250ml 15-25 ml

500ml 30 ml

750ml 80 ml


31、 如何调节通气搅拌发酵罐的供氧水平？

一般认为，发酵初期较大的通风和搅拌而产生过大的剪切力，对菌体的生长有时会产生不利的影响，所以有时发酵初期采用小通风，停搅拌，不但有利于降低能耗，而且在工艺上也是必须的。但是通气增大的时间一定要把握好。


32、 氧的供需研究与反应器设计与放大的关系？

发酵过程放大困难的原因就在放大时不可能同时做到几何相似、流体运动学相似和流体动力学相似，当在小试研究时某一个对生产产生影响的重要因素没有被观察到，而这个因素恰恰在放大时成为关键因子时，就会造成整个发酵过程的失败(供氧、混合、剪切）。



33、 发酵过程中溶氧浓度监控的意义？

当OUR(r)与DO反向变化时,表明其限制因素为细胞水平的菌体代谢问题,当OUR(r)与DO同向变化时,表明其限制因素为工程水平的氧传递问题。此时溶氧处于临界氧以下(这一结论)可客观地、动态地把握临界氧水平及氧平衡的制约因素。


34、发酵过程糖代谢、氮代谢有什么规律，为什么？

糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一

氮代谢：氨基酸被利用后产生NH3 ，pH会上升；尿素被分解成NH3，pH上升。

微生物生长和产物合成与糖代谢有密切关系。糖的消耗反映产生菌的生长繁殖情况，反映产物合成的活力。菌体生长旺盛糖耗一定快，残糖也就降低得快通过糖含量的测定，可以控制菌体生长速率，可控制补糖来调节pH，促进产物合成，不致于盲目补糖，造成发酵不正常。

氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。


35、测定菌的生长采取哪些方法？不同种的微生物各采取什么方法合适？


36、 发酵过程为什么要补料？补些什么？

在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克

服营养不足而导致的发酵过早结束的缺点。在这样一种系统中可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；可以通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；还可以利用计算机控制合理的补料速率，稳定最佳生产工艺。

发酵基质和缓冲液等。


37、 补料过多或过少对发酵有什么影响？

投料过多造成菌体细胞大量生长，无法稳定的产生发酵产物，导致菌体生产力下降，同时改变发酵液流变学性质。如果补料过少,则使菌体过早进入衰退期，引起菌体衰老和自，同样使生产力下降。

38、准确判断发酵终点有什么好处？依据哪些参数来判断？


39、 发酵过程中pH会不会发生变化为什么？

发酵过程中pH是不断变化的

（1）糖代谢特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一

（2）氮代谢当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。

（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降

（4）某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。

（5）菌体自溶 pH上升，发酵后期，pH上升

（6）杂菌的污染，pH下降


40、 pH对发酵的影响表现在哪些方面？

（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻。

（2）pH影响微生物细胞膜所带电荷。从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行。

（3）pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。


（4）pH值影响代谢方向。pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。例如黑曲霉在pH2~3时发酵产生柠檬酸，在pH近中性时，则产生草酸。谷氨酸发酵，在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。

（5）pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响。


41、 发酵过程的pH控制可以采取哪些措施？

（1）调节基础培养基的配方。C/N、碳源种类和浓度
（2）补料的控制。①简单的加酸加碱；②补入无机氮源；③同时补入碳氮源。


42、 根据微生物对温度的依赖可分类成哪几类微生物？

不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌适应于0～26℃生长，嗜温菌适应于15～43℃生长，嗜热菌适应于37～65℃生长，嗜高温菌适应于65℃以上生长。


43、 微生物对

温度要求不同的原理是什么？

（1）微生物对温度的要求不同与它们的膜结构物理化学性质有密切关系

根据细胞膜的液体镶嵌模型，细胞在正常生理条件下，膜中的脂质成分应保持液晶状态，只有当细胞膜处于液晶状态，才能维持细胞的正常生理功能，使细胞处于最佳生长状态。微生物的生长温度与细胞膜的液晶温度范围相一致。根据细胞膜脂质成分分析表明，不同最适温度生长的微生物，其膜内磷脂组成有很大区别。嗜热菌只含饱和脂肪酸，而嗜冷菌含有较高的不饱和脂肪酸。

（2）蛋白质结构

通过对嗜冷酶的蛋白质模型和x一射线衍射分析表明，嗜冷酶分子间的作用力减弱，与溶剂的作用加强，酶结构的柔韧性增加，使酶在低温下容易被底物诱导产生催化作用。

（3）蛋白质合成

嗜冷菌具有在0℃合成蛋白质的能力。这是由于其核糖体、酶类以及细胞中的可溶性因子等对低温的适应，蛋白质翻译的错误率最低。许多中温菌不能在O0C合成蛋白质，一方面是由于其核糖体对低温的不适应，翻译过程中不能形成有效的起始复合物，另一方面是由于低温下细胞膜的破坏导致氨基酸等内容物的泄露。

（4）合成冷休克蛋白

低温微生物适应低温的另一机制是合成冷休克蛋白。将大肠杆菌从370C突然转移到100C条件时细胞中会诱导合成一组冷休克蛋白，它们对低温的生理适应过程中发挥着重要作用，检测嗜冷酵母的冷休克反应，发现冷刺激后冷休克蛋白在很短时间内大量产生。耐冷菌由于生活在温度波动的环境中，它们必须忍受温度的快速降低，这与它们产生的冷休克蛋白是密切相关的。


44、 发酵过程的温度会不会变化？为什么？

会。发酵中温度升高的原因有：微生物在生长繁殖过程中，本身产生的大量热及机械搅拌产生的一些热量。包括发酵热、生物热、搅拌热、蒸发热等。


45、 发酵热的定义

所谓发酵热就是发酵过程中释放出来量的净热。


46、 生物热的大小与哪些因素有关？

发酵类型、培养时间、菌数、呼吸作用强度。


47、 温度对发酵有哪些影响？

（1）温度影响反应速率

发酵过程的反应速率实际是酶反应速率，酶反应有一个最适温度。

从阿累尼乌斯方程式可以看到 dlnKr/dt=E/RT2（平方）

（2）温度对微生物细胞生长的影响

温度升高，加快细胞的生长代谢，但过高酶失活的速度也加快。

（3）温度对产物形成的影响

温度对产物的影响因种而异，许多产物的形成速率对温度都很敏感。

（4）影响发酵液的物理性质，从而间接影响微生物的生物合成。

（5）温度影响发酵方向

如金

色链丝菌在低于30℃ 时，合成金霉素的能力强，在高于35℃ 时，合成四环素的能力非常强，金霉素的合成几乎停止。

（6）温度影响氧在基质中的溶解度

氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。


48、 发酵过程温度的选择有什么依据？

（1）根据菌种及生长阶段选择

微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。

如黑曲霉生长温度为370C，

谷氨酸产生菌棒状杆菌的生长温度为30～320C，

青霉菌生长温度为300C。

在发酵前期由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；

在中期菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可以推迟衰老。因为在稍低温度下氨基酸合成蛋白质和核酸的正常途径关闭得比较严密有利于产物合成。

发酵后期，产物合成能力降低，延长发酵周期没有必要，就又提高温度，刺激产物合成到放罐。

（2）根据培养条件选择

温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。

通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。

培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。

（3）菌生长快，维持在较高温度时间要短些；菌生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。

总的来说，温度的选择根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。

选择最适的发酵温度，包括微生物生长的最适温度和产物合成的最适温度，不同菌种、菌种的不同生长阶段以及不同的培养条件，最适温度都会不同。最适温度的选择是相对的，还应根据其他发酵条件进行合理的调整，需要考虑的因素包括菌种、培养基成分和浓度、菌体生长阶段和培养条件等。


49、 常用的通风发酵罐有哪几种类型？

（1）通用式发酵罐（通风、搅拌式发酵罐）

（2）气升式发酵罐

（3）自吸式发酵罐

（4）伍式发酵罐


50、 简述通用试发酵罐的结构
通用式发酵罐：具有通气和搅拌装置的立式圆筒形发酵罐。是目前大生产中最常用的发酵罐。其容积可从几升到几百吨不等。包括罐体、搅拌系统、传热系统、通气系统。
（1）罐体

（2）搅拌系统包括：驱动电机、搅拌轴；涡轮搅拌器、搅拌叶；挡板；轴封（端面轴封）

（3）传热系统包括夹层传热、蛇管传热（一般有4组、6组、8

组）。

（4）通气系统包括单孔管、多孔环管