miRNeasy Mini Kit中文版

miRNeasy Mini kit

实验前注意事项：

1、这个实验方法是为了从组织（和/或）细胞中提取总RNA，包括小分子RNA。

2、有必要的话，可以加热使Buffer RWT中的沉淀溶解。

3、除了步骤5中的液相分离，其他操作均应该在室温下进行（15-25℃），动作

要迅速。

4、Buffer RWT and Buffer RPE原液在使用前应加入（96-100%）的乙醇（根据标

签上的体积添加）。

5、在开始第一步之前，根据miRNeasy Mini Kit Handbook中的建议选择合适的

打碎组织细胞的方法。

实验步骤：

1、向组织或细胞中添加700μL的QIAzol裂解液，（组织的话，可以称取大概50mg，

加入1ml裂解液，最后吸取700μL）选择合适的方法裂解细胞或组织。（组织一般选用匀浆机，每一个组织大概研磨3-4次）。

2、室温（15-25℃）下孵育匀浆5分钟。

3、每管中加入140μL的氯仿（三氯甲烷），并盖紧盖，大力晃动15s。

4、室温下孵育2-3分钟。

5、4℃离心15分钟（12000g）。

6、将上层清液转移到一个新的EP管中，注意避免不要混入下层液相，加入1.5

倍体积（通常是525μL）的无水乙醇，然后混匀。

7、吸取700μL的样本转移到RNeasy? Mini 柱内，并放入2ml的收集管中。室

温离心8000g，15秒。弃掉收集管中的液体。

8、重复步骤7，收集将剩余的样本。

9、选做：根据手册附录B中的说明进行DNA酶消化（不需要使用miScript PCR

system进行miRNA的鉴定）。

10、向离心柱内加入700μL的Buffer RWT，8000g离心，15s，弃滤液。

如果用的样本是细胞，这一步是选做的。

11、吸取500μL的Buffer RPE于离心柱内，8000g离心，15s，弃滤液。

12、吸取500μL的Buffer RPE于离心柱内，8000g离心，2min，弃滤液。

13、选做：将RNeasy Mini 柱移入一个新的2ml收集管内，最大转速离心1min。

14、将Neasy Mini 柱转移到新的1.5ml的EP管内。于柱内加入30-50μL的

DEPC水。8000g离心1min。

15、如果期望RNA产量大于30μg，可以加入额外的30-50μLDEPC水，或者

使用第14步中收集到的液体（如果需要一个较高的RNA浓度），再次进行离心，收集滤液。