视网膜组织块培养方法综述
胚胎视网膜组织块三维培养方法的研究进
展
杨千惠，刘冕，张琰，李筱荣
基金项目：教育部博士点基金(20121202120005)；教育部留学回国基金（第45批）；天津医科大学眼科医院引进人才启动基金（基金号：TJEC20101110）
作者简介：杨千惠 （1989-），女，博士研究生，视网膜和玻璃体疾病
通信联系人：张琰 （1972-），男，研究员，硕士生导师，视网膜生物学和疾病干预. E-mail:
yanzhang9927@https://www.wendangku.net/doc/7c10795253.html,
（天津医科大学眼科医院，天津医科大学眼科研究所，天津医科大学眼视光学院） 5 摘要：胚胎视网膜组织块培养是介于原代细胞培养和在体动物之间的实验模式，是研究视网膜神经和血管发育的重要实验方法。这种方法既具有体外实验的操作简便，处理条件固定，动物用量少，实验周期短的优点，又保持同体内视网膜相似的三维组织结构；它不仅可用于研究未分化的视网膜神经上皮细胞向成熟视网膜各层细胞分化发育的调控机制，而且能够对10 生理性和病理性视网膜新生血管生成及其信号通路的调节进行研究，从而为研究视网膜神经和血管相关疾病的发病机制和干预手段提供可靠的实验平台。本文就胚胎视网膜组织块培养的研究进展、面临问题以及潜在的临床应用价值进行综述。
关键词：胚胎视网膜;组织块培养;三维体外培养;视网膜疾病;发育
中图分类号：R77
15
Recent advances of DNA and Recent advances in the
methods of 3-dimensional embryonic retinal explants
cultures
YANG Qianhui, LIU Mian, ZHAMG Yan, LI Xiaorong
20 (Tianjin Medical University Eye Hospital, Tianjin Medical University Eye Institute, College of
Optometry and Ophthalmology)
Abstract: Embryonic retinal explant culture is an experimental paradigm that lies between primary cell culture and animal model, and is an important approach to study neural and vascular development in retina. This approach possesses the advantages of in vitro experiments, such as 25 easy manipulation, fixed treatment condition, reduced usage of animals, and short experiment turnover. Moreover, the retinal explant cultures maintain the 3-dimensional structures similar to the retina in embryo. The retinal explants can be used to study the regulatory mechanisms underlying the development from the undifferentiated neuroepithelial cells to the mature cells in retinal layers. The explants can also be utilized to study the processes of physiological 30 angiogenesis and pathological neovascularization in retina and their regulatory signaling pathways, thereby providing a reliable experimental platform where the pathogenesis of and intervention to neural and vascular retinopathies can be investigated. This review summarizes the recent advances, current difficulties, and potential clinical applications of the embryonic retinal explant cultures. Key words: embryonic retina; explant culture; 3-D in vitro culture; retinal diseases; development 35
0 引言
随着社会经济的发展和医疗技术水平的不断进步，传统意义上的致盲性眼病如白内障和眼表感染性疾病等得到了较好的控制和治疗；然而随着人口老龄化和生活方式的改变，年龄相关性视网膜病变[1]和糖尿病视网膜病变[2]等视网膜疾病的发病率不断攀升。如何有效防治和早期干预视网膜疾病是一个值得研究的问题。另外，视网膜组织具有易获得、层次结构清晰、
40 细胞类型固定的特点，是研究中枢神经系统发育的理想模型[3]，因此进行视网膜组织块三维
体外培养，对探索视网膜疾病的发病机制，筛选有效的干预手段，以及研究中枢神经系统各亚系的发育具有重要意义。胚胎视网膜组织块培养有多种方法并可来源于不同动物种属[4-7]，本文对鸡胚、大鼠及小鼠视网膜组织块培养的常用方法、用途，存在问题和可能的临床应用45
加以综述。
1鸡胚视网膜组织块的培养方法
鸡的眼部组织在胚胎发育过程中，与身体其它组织相比，相对比例较大，因而鸡胚视网膜组织块模型具有取材方便，易于制作，培养、处理条件固定的优点，又保持着与体内视网膜相似的完整组织结构，与基因、化学、和机械处理相结合可制作各种视网膜退行性病变模50
型[8]。另外，鸡胚视网膜无血管[9]，可去除血管来源因子的混杂因素，适于研究并筛选新型药物的神经保护作用及其在视网膜的分子、细胞作用机制。
1.1有支撑物的鸡胚视网膜组织块培养
早期的鸡胚视网膜组织块培养是将第4-17天的鸡胚从种蛋中取出，在含有Earle’s平衡盐溶液的无菌培养皿中，在解剖显微镜下用线状刀片沿角膜缘把眼球切开。切面沿角膜缘要完55
整，这样不易损伤周边视网膜，保护视网膜的完整性[10]。实验中应剪除视网膜边缘剩余的睫状体部分，然后把视网膜展平，将展平的视网膜切成1×1 mm的组织块（较小的组织块更利于从外界获取营养物质），平展放于18×18 mm盖玻片上的血块上面，血块既可作为组织的支撑物，又可提供组织发育所需的营养物质，但血块中的一些物质也可能对视网膜组织发育产生不良影响[10]。此外，放有视网膜组织块的培养皿中可加入培养基（含20%胎牛血清60
的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培养基），把培养皿放于38℃、5% CO2和98%湿度孵箱里培养，每周换液3次，从而为视网膜组织块的分化发育提供更好的生存环境。
从形态学角度讲，鸡胚视网膜组织块体外血块培养法第1天就可以观察到有清晰细胞质和细胞核的大细胞，细胞质较少的小圆细胞，以及刷状和丛状细胞带。培养8-11天后可以观察到光感受器细胞、神经胶质细胞、神经节细胞的发育[10]。视网膜各层在体外的成功分化发65
育说明该实验方法可为研究视网膜相关疾病提供模型，还可用于研究视网膜分化发育的动力学，例如研究哪种细胞器会导致光感受器细胞一侧发育成轴突而另一侧发育成外节膜盘，或研究水平细胞与视网膜其它结构间形成的突触的性质及功能。
随着实验方法的不断发展，支撑物拓展到插入式半透膜[5, 6]、硝酸纤维素膜+聚酰胺网[11]，不仅为组织块提供支撑，还为视网膜组织提供了气体界面，利于组织对培养基中营养物质的70
充分吸收。在我们的研究中，从第9天的鸡胚中取双侧眼球，在解剖显微镜下从眼球的后极部正中开始剥离巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮层，剥离后的组织包括晶体、玻璃体和视网膜。遂将其转移至带有插入式半透膜（孔径0.45 μm）和培养基（10%或15%胎牛血清+高糖DMEM+1%谷氨酰胺+各100单位的青、链霉素）的35 mm组织培养皿中，去除晶体和玻璃体，用眼科剪在视网膜周边剪4个缺口，使视网膜平展在插入式半透膜上，节细胞层朝上，75
感光细胞层朝下，这种解剖神经视网膜的方法能够较好地保持视网膜的完整性，减少周边视网膜的损伤[5]。在体外培养的不同时点经组织学检测，可见视网膜各层结构保存完整，与在体视网膜相似[5]。此外，鸡胚组织块培养的不同时期以不同类型的细胞发育为主，这就为进一步研究视网膜各种类型细胞提供了便利条件。
1.2悬浮培养法
80
德国Layer研究组[12]近期发展了一种新的鸡胚视网膜组织块培养方法，即悬浮培养法。
将第6天（E6）的鸡胚眼睛取出放入无钙离子的Hank’s平衡盐溶液里。选择E6鸡胚进行研究有以下3方面的优点：①E6鸡胚视网膜未完全成熟，可以用来观察各层细胞的分化、视网膜发育及与体内形态进行对比。②E6鸡胚视网膜感光细胞刚刚诞生，这便于对感光细胞生长发育的研究。③E6鸡胚的RPE层没有完全发育，容易与神经视网膜分离。在制备视网85
膜组织块时，用剪刀沿锯齿缘将晶状体剪除，用尖头镊子将玻璃体去除，将剩余的中央视网膜去除RPE层，使整个神经节细胞层朝上平放，用显微剪将整个视网膜组织平分成两份放入35 mm的无菌培养皿中，培养皿中加入DMEM培养基（含10%胎牛血清+2%鸡血清+1%谷氨酰胺+0.15%抗生素），将培养皿放在以72 rpm的恒定速度旋转的摇床上（95%空气+5% CO2，37℃恒温环境）进行培养[12]。结果显示，悬浮培养的视网膜在体外至少可以维持2-3 90
周。体外培养3天后，内丛状层出现；体外培养第4天，外核层、外丛状层从内核层分出，还可以观察到神经纤维层以及光感受器细胞的分化，说明悬浮培养法可以较长时间、较好地进行视网膜组织块体外培养[12]。另外，在组织块悬浮培养中所观察到的Müller细胞和光感受器细胞提前分化的现象证明了两种细胞类型在发育过程中有相互协调、促进的作用[13]。
此种悬浮培养法由于不停地旋转，并且培养皿中的视网膜组织未贴附于任何支撑物，使视网95
膜组织块一直悬浮在培养基中，为视网膜的发育分化提供了有利的三维环境。但是，由于视网膜不同类型细胞的大量增殖和极性分化，悬浮培养易造成视网膜组织块的折叠。此外，研究还发现E6、E10的鸡胚视网膜用这种培养方法进行培养可以维持组织结构3周，而E15的鸡胚视网膜只能维持1周，这为鸡胚视网膜组织块培养最佳时点的选择提供了依据[12]。
总之，鸡胚视网膜的悬浮培养法为研究生长因子和外源性物质对视网膜发育的长期影响提供100
了良好的模型。
2胚胎大鼠的视网膜组织块培养方法
鸡胚视网膜组织块培养是利用脊椎动物进行实验研究，在神经视网膜发育研究中发挥着重要作用；而啮齿类动物大鼠和小鼠也是进行视网膜研究必不可少的一部分。胚胎大鼠视网膜组织块培养可以选用E17、E20的大鼠眼球，用镊子把神经视网膜层与视网膜色素上皮层105
在显微镜下分离。把分离出的神经视网膜放在插入式半透膜中进行培养（孔径0.45 μm），光感受器细胞层朝下放置，然后将培养皿放于37℃、95%湿度和5% CO2的环境里培养[14]。
E17大鼠视网膜组织块体外培养7天出现折叠，贴近半透膜的组织可分层，其余部分出现玫瑰花结，与在体发育相应时点（出生后第2天，P2）相比，无内层视网膜的分化发育，并且组织形态较疏松。E20大鼠视网膜组织块体外培养7天，分层明显，未见玫瑰花结；与在体110
相应时点（P5）相比，除未见外核层外，其余各层发育正常，但各层厚度与在体视网膜相比变薄。这提示E20的胚胎大鼠视网膜组织块较E17视网膜组织块发育良好，以及胚胎大鼠视网膜组织块培养在垂直时间上的变化[14]。体外培养14天的E17大鼠视网膜组织块可见外核层发育，但未见视网膜其它各层。E20大鼠视网膜组织块体外培养14天，出现折叠和组织形态退化，视网膜组织块明显薄于体内相应时点（P12），可见外核层和未发育的外丛状115
层以及少数内核层细胞胞体[14]。总之，该体外培养方法可出现部分视网膜细胞类型的发育，但内层视网膜结构严重缺乏。因此，研究外层视网膜病变可以选择胚胎大鼠作为实验模型
[14]。
另有研究表明，胚胎大鼠视网膜在E15时神经节细胞出现轴突，形成视神经，视网膜各层细胞出现表型分化[15]，而光感受器细胞直到出生后1-2周才分化完全[16]。因为大鼠出生120
后有较长的视网膜发育阶段，所以成年大鼠目前成为实验研究的主要对象[17-19]，而关于胚胎
大鼠视网膜组织块体外培养的实验描述较少[20]。另外，成年大鼠视网膜组织块内层视网膜的发育较胚胎大鼠好[18, 19]，所以更适于进行与内层视网膜有关的研究。
此外，胚胎大鼠视网膜组织块培养还可用于视网膜移植的研究[21, 22]，但在组织块处理时应小心操作，以免牵拉组织形成玫瑰花结而影响移植效果。
3胚胎小鼠的视网膜组织块培养方法
125
多数胚胎小鼠视网膜组织块培养选取E15.5的小鼠眼球，因为在这时神经视网膜比较容易从眼球中分离[23]。在显微镜下用镊子从角膜缘剥离、撕掉角膜、巩膜和色素上皮层，取出神经视网膜。制作视网膜组织块培养标本的过程应迅速，否则易导致组织变薄，并与体内视网膜结构和发育不一致。这种胚胎小鼠视网膜组织块在体外持续培养2周后，视网膜组织130
从离体时的两层结构分化发育成三层结构，即神经节细胞层、内核层、外核层；视网膜组织块持续培养3周后，未见明显的细胞死亡[23]，提示这种视网膜组织块培养体系可为视网膜体外发育提供较长的适合生长的环境，加以小鼠遗传学方面的优势[24]，小鼠视网膜组织块培养体系不仅可用来研究视网膜发育及分化的调控因素[25]，还可为视网膜退行性病变[26-29]和血管病变[30-32]提供模型。
135
此外，可以根据不同的实验目的，在视网膜组织块培养基中加入添加剂，包括维生素E 和A、谷胱甘肽、丙酮酸、亚麻酸等。有些实验为了延长胚胎小鼠视网膜组织块中神经元的存活时间，在培养基中加入促神经生长因子如N-2、B27、CNTF等[33-35]。另一方面，视网膜组织块培养板的选择也值得考虑。在培养中除了可选用插入式半透膜，还可采用多聚赖氨酸包被的培养皿，使组织更好地贴附于培养皿，有利于神经视网膜组织的生长发育。
4组织块培养的历史、现状与临床价值
140
4.1组织块培养实的进展历程
最早的组织块培养是把整个鸡胚眼球放在血块上进行培养[36]。Tansley[37]在1933年改进了实验方法，把实验研究对象扩展到哺乳类动物组织，将大鼠视网膜从眼杯里分离出来，进行视网膜体外培养。在20世纪前半叶，视网膜组织块培养主要是把组织贴附在盖玻片上的145
血块或胶原蛋白基质上，然后使盖玻片持续、缓慢地旋转。这种实验方法经过改良后仍被继续应用[38, 39]。Trowell[40]及其同事在1958年发明了膜培养法，把组织放在像滤纸等渗透膜上，将渗透膜放于电网格上，保持有气体基质的接触面。Caffé[41]等人把膜培养和旋转培养结合起来又发明了一种实验方法，即将硝化纤维膜和聚酰胺纱网格放于震荡装置上，进行组织块的体外培养。近年来，视网膜组织块培养多采用插入式半透膜，既为组织块提供了支撑物，150
又可使组织接触气体基质。而Layer研究组最近发明的无支撑物悬浮培养法，可对视网膜组织块进行较长时间的体外培养[12]。
4.2组织块培养与细胞培养的比较
视网膜组织块培养可以观察不同类型细胞的发育阶段，而细胞培养只可观察单一细胞类型的发育分化过程。视网膜组织块培养相对于单层细胞的培养更类似于体内视网膜的发育环155
境，因此可以作为研究视网膜各层结构发育和分化的理想模型[12]。另外，组织发育过程中的信息传递需要多种细胞间联系，如缝隙连接[42]，紧密连接[43]，以及神经元之间的突触连接[44]，组织块培养可以提供这个条件，而细胞培养缺乏多种细胞间联系，不利于细胞的正常发育、分化。但是，组织块培养中可贴附的支撑物可能会使组织细胞变形，不利于细胞结
构的保持，而细胞培养可以使细胞结构受较少的外力影响，保护细胞结构免受破坏。因此，160
组织块和细胞培养方法各有优点和局限性，我们可以根据不同的研究目的，选择适合的培养方法。
4.3胚胎视网膜组织块培养面临的问题
胚胎视网膜组织块培养虽然可以较成功地进行视网膜体外培养，但毕竟与体内环境不同，易造成体外培养的组织块出现玫瑰花结，为实验研究增加困难。此外，视网膜的离体导致促165
进组织发育的生长因子的丢失，从而使视网膜组织块在体外的长期存活成为另一问题。这些问题的解决，如利用悬浮培养法尽量减少组织块中玫瑰花结的形成[12]，使视网膜组织块的形态与体内相似；在培养基中增加营养因子来维持组织块较长时间的存活[33]，会使胚胎视网膜组织块培养更好地为病程较长的视网膜病变提供模型，从而对临床疾病的研究发挥更大的价值。
4.4胚胎视网膜组织块培养的潜在临床应用价值
170
胚胎视网膜组织块培养对于视网膜疾病的研究具有重要意义。视网膜组织块中各层细胞之间的相互结构和生物活性关系更接近于在体条件，实验结果较细胞培养更具说服力，可以为临床常见的视网膜疾病，如糖尿病视网膜病变[45]、新生血管性视网膜疾病[46, 47]、视网膜退行性病变[28, 29]、以及光刺激[48, 49]和兴奋性神经递质[26]造成的视网膜损伤提供可靠的实验175
模型，并为视网膜疾病的发病机制和干预治疗提供新的思路和理论依据。
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18知识讲解植物的组织培养技术
植物的组织培养技术 【学习目标】 1、指导植物组织培养技术的基本原理和基本技术。 2、掌握植物培养过程中使用的无菌技术（重点）。 3、掌握植物知识培养的基本过程及操作。 4、说出被子植物花粉发育的过程及花药例题培养产生花粉植株的两种途径。 5、说出花药离体培养的因素，学习话要例题培养的基本技术。 【要点梳理】 要点一、植物组织培养的基础知识【高清课堂：植物的组织培养技术 高清未发布 课题1：基础知识】 1、植物组织培养的基本过程： 离体的植物器官、组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。愈伤组织的细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化（去分化）。脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫再分化。再分化形成的试管苗移栽到地里，可以发育成完整的植物体。植物组织培养的过程可以简要归纳为： 离体的植物器官、组织或细胞（外植体）???→脱分化愈伤组织???→再分化根、芽—→植物体。 2、植物组织培养的理论基础：细胞的全能性 要点诠释： 细胞的全能性与植物组织培养间的关系 ①细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。 植物组织培养的理论基础是细胞的全能性。植物细胞只有脱离了植物体，在一定的外部因素作用下，经过细胞分裂形成愈伤组织，才能表现出全能性，由愈伤组织发育、分化出新的植物体。 ②高度分化的植物细胞仍具有全能性的原因是所有体细胞均来自受精卵的有丝分裂，均有和受精卵相同的一整套遗传信息。 ③植物体的组织、器官的形成，是基因选择性表达的结果，其细胞的全能性受到限制，在离体状态下，其全能性才容易得以表达，表达的过程须经过脱分化和再分化。 ④容易进行营养繁殖的植物细胞，其全能性容易表达，易进行植物组织培养。 要点二、影响植物组织培养的因素 1、无机营养 （1）大量元素：除碳（C ）、氢（H ）、氧（O ）外，还有氮（N ）、磷（P ）、钾（K ）、钙（Ca ）、镁（Mg ）、硫（S ）等元素。 （2）微量元素：包括铁（Fe ）、铜（Cu ）、钼（Mo ）、锌（Zn ）、锰（Mn ）、钴（Co ）、硼（B ）和碘（I ）等。 2、有机营养 （1）维生素类：植物组织培养中经常使用维生素C 、维生素B 1（盐酸硫胺素）、维生素B 6（盐酸吡哆醇）、维生素H （生物素）、叶酸和烟酸等，一般使用浓度为0.1～10 mol ／L 。 （2）氨基酸：有甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白（CH ）和水解乳蛋白（LH ）等，是重要的有机氮源。 （3）有机添加物：是一些成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等的复杂化合物，它们对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用。 3、植物生长调节物质 植物生长调节物质是培养基中的关键物质，对植物组织培养起着重要、明显的调节作用。植物生长调节物质包括生长素、细胞分裂素及赤霉素等。
植物组织培养的一般流程
植物组织培养的一般流程 一个完整的植物组织培养过程一般包括以下几个步骤： （1）准备阶段 查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制订出切实可行的培养方案。然后根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。 （2）外植体选择与消毒 选择合适的部位作为外植体，采回后经过适当的预处理，然后进行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖，挑出花药，接种到初代培养基上。（3）初代培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。然后将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。 （4）继代培养 分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的继代培养基经多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的需提前进行病毒检测。 （5）生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低细胞分裂素浓度或不加，提高生长素浓度，促进小苗生根，提高其健壮度。 （6）炼苗移栽 选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗，待苗适应外部环境后，再移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫，防止病虫危害。当组培苗完全成活并生长一定大小后，即可移向大田用于生产。 二、单项选择题 1. 在衡量杂种优势（H ）时，超中优势的计算方法为（P 1 、P 2 分别表示两亲本的性状平均值，F 1 为杂种一代的性状平均值）：A. H ＝[F 1 -(P 1 +P 2 )/2]/(P 1 -P 2 )/2 B. H ＝(F 1 -P 1 )/P 1 C. H ＝[F 1 -(P 1 +P 2 )/2]/(P 1 +P 2 )/2 D. H ＝ (F 1 -P 2 )/P 2 2. 根据植物梢端组织发生层学说，如果L II 层细胞发生突变，则下列器官或组织会发生变异的是： A ．表皮B. 种子C. 不定根D. 中柱 3. 对于孢子体型自交不亲和而言，下列基因型的杂交组合能产生后代的是： A ．S 1 S 2 ×S 1 S 2 B ．S 1 S 2 ×S 1 S 3 C ．S 1 S 2 ×S 2 S 3 D ．S 1 S 2 ×S 3 S 4
2010-2014植物组织培养高考题汇编(含详解)汇总
1.（2014广东卷）（16分）铁皮石斛是我国名贵中药，生物碱是其有效成分之一，应用组织培养技术培养铁皮石斛拟原球茎（简称PLBs，类似愈伤组织）生产生物碱的实验流程如下： 在固体培养基上，PLBs的重量、生物碱含量随增殖培养时间的变化如图17所示，请回答下列问题： ⑴选用新生营养芽为外植体的原因是，诱导外植体形成PLBs的过程称。 ⑵与黑暗条件下相比，PLBs在光照条件下生长的优势体现在，，。 ⑶脱落酸（ABA）能提高生物碱含量，但会抑制PLBs的生长。若采用液体培养，推测添加适量的ABA可提高生物碱产量。同学们拟开展探究实验验证该推测，在设计实验方案是探讨了以下问题： ①ABA的浓度梯度设置和添加方式：设4个ABA处理组，1个空白对照组，3次重复。因ABA受热易分解，故一定浓度的无菌ABA母液应在各组液体培养基后按比例加入。②实验进程和取样：实验50天完成，每10天取样，将样品（PLBs）称重（g/瓶）后再测定生物碱含量。如初始（第0天）数据已知，实验过程中还需测定的样品数为。 ③依所测定数据确定适宜的ABA浓度和培养时间：当某3个样品（重复样）的时，其对应的ABA浓度为适宜浓度，对应的培养时间是适宜培养时间。
【答案】（1）细胞分化程度低，容易诱导形成PLBs（2分）；细胞的脱分化（2分）（2）生长起始快（2分），快速生长时间较长（2分）；PLBs产量较高（2分）；（3）①灭菌、冷却（2分）；②75（2分）；③PLBs重量和生物碱含量乘积的平均值最大（3分） 【解析】（1）新生营养芽分裂能力强，全能性容易表达；根据题干可知，PLBs类似愈伤组织，外植体形成愈伤组织的过程是脱分化。（2）据图分析，光照下PLBs的重量高于黑暗条件下，原因可能是光照有利于细胞增殖、叶绿体的形成和进行光合作用制造有机物。（3）①由于ABA受热易分解，所以各种液体培养基灭菌后，冷却，再加入不同浓度的ABA ②根据题干可知，实验50天完成，每10天取样，需要取样5次，4个ABA处理组，1个空白对照组，3次重复，因此每次取样需要记录15个样品中的数据，共需要测定样品数75 ③适量的ABA可提高生物碱产量，当样品的平均值最大时，所对应的ABA浓度和时间为最适。 2.（2014江苏卷）（9分）为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。请回答下列问题： （1）外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为。 （2）在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如右图所示。细胞干重在12d后下降的原因有；培养液中蔗糖的作用是、。 （3）多倍体愈伤组织细胞产生的次生代谢产物量常高于二倍体。二倍体愈伤组织细胞经处理，会产生染色体加倍的细胞。为检测愈伤组织细胞染色体数目，压片前常采用纤维素酶和酶解离愈伤组织。若愈伤组织细胞（2n）经诱导处理后，观察到染色体数为8n的细胞，合理的解释是、。 （4）为了更好地获得次生代谢产物，生产中采用植物细胞的固定化技术，其原理与酵母细胞固定化类似。下列说法正确的有（填序号）。 ①选取旺盛生长的愈伤组织细胞包埋②必须在光照条件下培养
植物组织培养及应用研究概况
学号：20095071124 学院生命科学学院 专业生物科学 年级2009级 姓名张阿欠 论文（设计）题目植物组织培养及其应用研究概况指导教师张伟职称讲师 成绩 2012 年 6 月 9 日
目录 摘要 (2) 关键字 (2) Abstract (2) Keywords (2) 前言 (3) 1.植物组织培养的基本概念、原理和试验步骤 (4) 1．1植物组织培养的基本概念 (4) 1．2植物组织培养的基本原理 (4) 1．3植物组织培养的试验步骤 (4) 1．3．1选择和配制培养基 (4) 1．3．2灭茵 (4) 1．3．3接种 (5) l. 3．4培养 (5) 2. 植物组织培养的应用 (5) 2．1植物快速繁殖和无病毒种苗生产 (5) 2．2植物花药培养和单倍体育种 (5) 2．3植物胚胎培养 (6) 2．4植物愈伤组织或细胞悬浮培养 (6) 2．5细胞融合与原生质体培养 (6) 2．6植物细胞突变体筛选 (6) 2．7植物体细胞胚胎和人工种子 (7) 2．8 植物组织细胞培养物的超低温保存与种质库建立 (7) 2．9 植物组织培养与转基因技术的应用 (7)
3 .发展前景展望 (7) 参考文献： (8) 植物组织培养及其应用研究概况 学生姓名：张阿欠学号：20095071124 信阳师范学院生物科学专业 指导教师：张伟职称：讲师 摘要：主要讲了植物组织培养的基本概念，原理和实验步骤，在此基础上，讲了植物组织培养在植物快速繁殖和无病毒种苗生产、植物花药培养和单倍体育种、植物胚胎培养、植物愈伤组织或细胞悬浮培养、细胞融合与原生质体培养等方面的应用，最后展望了植物组织培养的发展方向。 关键字：植物组织培养；概念；原理；实验步骤；应用；发展前景 Abstrac t：About the basic concepts, principles and experimental procedures of plant tissue culture, on this basis, said plant tissue culture in plant rapid propagation and virus-free seed production, plant anther culture and haploid breeding, plant embryo culture, plantscallus or cell suspension culture, cell fusion and protoplast culture in the application, Finally, the future direction of development of plant tissue culture. Keywords:Plant Tissue Culture; concept; principle; experimental steps; applications; development prospects 前言 在世界各国科学家的不断努力下，近几十年来，植物组织培养技术迅速发展。利用组织培养，不仅可以大量生产优良无性系，获得人类需要的多种代谢物质，还可获得单倍体、三倍体、多倍体及非整倍体。通过细胞融合可以打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲合性，在植物新品种的培育和种性的改良中发挥了巨大作用。组织培养的植物细胞是在细胞水平上分析研究的理想材料，从植物快繁、花药培养发展到细胞器培养、原生质融合以及DNA重组技术等，植物组织培养技术广泛应用于植物科学的各个领域及农业、林业、工业、医药等多种行业，已经成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。
植物组织培养在花卉生产上的应用
…………号… 座………………线………… 号… 学………………………封级 班…………………………别… 系…密………………名… 姓………植物组织培养在花卉生产上的应用 摘要： 植物栽培技术虽然发展比较晚，但是在经过20世纪后的几十年，经过众多科学家的努力与奋斗，这项技术越来越完善，越来越成熟。尤其近40年以来，植物组培技术已渗透到植物生理学、病理学、遗传学、药学、育种以及生物化学等各个研究领域，为快速繁育优良品种，培育无毒苗木，进行突变筛选培育，药用植物工厂化生产，种质保存和基因库建立等方面开辟了新途径，成为生物学科中的重要研究技术和手段之一。现如今，植物组织培养技术具有保持花卉优良性状、培育脱毒苗木、保存种质资源等优质，根据这些优势，植物栽培技术也被广泛应用于花卉的种苗繁殖与生产之中。 关键字： 植物组织培养；快繁；花卉 1花卉产业介绍 在我国随着人民生活水平和文化素养提高，花卉消费这一时尚已逐步进入家庭，这是一个巨大的消费市场。全国各地兴起许多花卉交易市场，对这种发展趋势又起着推波助澜的作用。组培苗具有无杂菌、优质、均匀、分蘖性强、繁殖率高、批量生产、周年供应、便于运输等优点。 2花卉领域中组织栽培优势
2.1脱毒及快繁 植物生长在自然环境下，十分容易受到病毒的感染。植物感染病毒后，虽然未必死忙，但却会引起产量下降，品质变劣，观赏价值下降。采用无性繁殖的植物，在繁殖过程中病毒可通过营养体进行传递，逐代积累，使病毒病的危害更为严重。 为保持植物体原有的优良晶质和经济价值，达到无病源菌化，其前提就是使无病无菌植物体再生。最有效的方法就是使用植物组织培养法之一的茎尖生长点培养法。这种培养技术最先应用于花卉。宿根性茬卉有康乃馨、菊、大丁草、丝石竹、补血草;球根性花卉有百合、小苍兰、唐葛蒲、茸尾、柱顶红;还有花木类的蔷薇、杜鹃花等都已广泛应用。 作为无病无菌植物体再生的手段，主要有两方面: (1)培养茎尖生长点，获得一顶一芽一株植物体; (2)由茎尖长成愈伤组织再分化形成大量植物体。 由于后者有出现植物体变异的可能性，不应考虑克隆。茎尖生长点就是芽顶端直径为 0.6一 0.1毫米的半球形组织。在这部分，病源体(病毒、病菌)含有的浓度比其他任何部位都低。无病毒植物体和无病无菌植物休再生的优点在于可以避免因病害造成的生产量和品质的损失.，提高经济效益，具体表现在: (1)花卉色泽鲜艳; (2)每一花茎的着花数增加; (3)植株生长的速度和能力增加; (4)栽培管理的劳动量减少;伍)单位面积产量增加等等。这些优点在受到病害的植物体是不存在的，因此很有价值。 2.2大量快速繁殖
多肉植物组织培养
多肉植物是指植物营养器官的某一部分，具有发达的薄壁组织用以贮藏水分，在外形上显得肥厚多汁的一类植物。常见的有仙人掌科的仙人掌、仙人球、昙花、蟹爪兰、金琥；番杏科的生石花、肉锥花；百合科的康平寿、玉露、卧牛；大戟科的虎刺梅、彩春锋；景天科的石莲花、长寿花、虹之玉；龙舌兰科的金边龙舌兰、虎尾兰；菊科的翡翠珠等。 肉植物耐干旱，净化空气，具有外观小巧玲珑，植株肥厚多汁，造型特异等特点，是近年来逐渐流行的一类观赏植物。组织培养技术，对保存多肉植物优良的种质资源、繁殖名优珍稀品种、快速繁殖出口需要和园林绿化需要的优良品种。 传统多肉植物可依靠分株、扦插繁殖，分株繁殖如芦荟、仙人球、虎尾兰；扦插繁殖如蟹爪兰、长寿花、落地生根，仙人掌则是分株和扦插繁殖都可以。值得一提的事，生石花在生长中有一个脱皮、分裂的过程。通常在冬末春初，植株中缝逐渐开裂，在开裂处有一个或两三个新的植株逐渐长大，而原有的植株逐渐枯萎，为新株所取代。这个由新植株替代老植株的过程，就是脱皮生长和分裂繁殖过程。 外植体的选择 取优良母株新萌发的幼嫩侧芽、幼嫩枝条；一些没有侧芽的珍稀名贵品种的母株则可等待植株开花期间取其较充实的花梗作为外植体。夏季休眠期，多肉植物外植体在培养基中对激素常反应迟钝，生长静止，不易培养成功。 1.????????? 消毒灭菌 2.1选择合适的培养基的，配置好、调节适当的激素浓度。 2.2制作好的培养基须立即放入高压灭菌锅灭菌，备用。， 2.3外植体材料的消毒：切取多肉植物幼嫩的侧芽或花梗→肥皂水或洗洁精洗涤→在自来水下冲洗→超净工作台中用 75%酒精浸泡数秒→ 0.1%升汞处理 10～30min，→无菌水冲洗 6 遍，→消毒滤纸吸干水分 3.接种 无菌条件下操作→手术刀切取所需的培养材料→无菌操作植入初代诱导培养基中培养。 3.培养
植物组织培养的应用及发展前景修订稿
植物组织培养的应用及 发展前景 集团档案编码：[YTTR-YTPT28-YTNTL98-UYTYNN08]
植物组织培养技术应用及进展 摘要：本文综述了植物组织培养理论的发展，重点论述其再脱毒、快繁、育种与有机化合物工业生产以及种质资源的保存等方面的应用，并对应用的前景作简单的展望。 关键词:植物组织培养；应用；进展 中图分类号： 1.理论起源 19世纪30年代，德国家施莱登和德国动物学家创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特在的理论是植物组织培养的理论基础。1958年，一个振奋人心的消息从传向世界各地，美国植物学家斯等人，用韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。 植物组织培养的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。 植物组织培养的大致过程是：在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工上进行培养，这些器官或组织就会进行，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。 植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及,在无菌和适宜的人工培养基及光照、温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科 2.植物组织培养发展简史 植物组织培养是20世纪30年代初期发展起来的一项生物技术。它是在人工配制的培养基上，于无菌状态下培养植物器官、组织、细胞、原生质体等材料的方法。 植物细胞的全能性是植物组织培养的理论基础。20世纪初，曾有人提出能否将植物的薄壁细胞培养成完整植株研究者从胡萝卜根的韧皮部取下一块组织，并在液体培养基中培养，使其分化出了愈伤组织，从愈伤组织又得到胚状体，胚状体转移到固体培养基上继续培养后，获得了完整的胡萝卜试管植株。经过栽培，此植株能够正常生长并开花结果，其种子繁衍出来的后代与正常植株的种子所繁衍出的后代别无二致。根据此实验可以得出以下结论：即不经过有性生殖过程也能将植物的薄壁细胞培养出与母体一样的完整植株。由于植物的每个有核细胞都携带着母体的全部基因，故在一定条件下，它们均能发育成完整植株，这就是所谓的植物细胞全能性。
植物组织培养步骤
植物组织培养概念(广义)乂叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念(狭义)指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养,愈伤组织再经过再分化形成再生植物。 组织培养的步骤 一、培养基配制 配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品， 按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS B5等。 自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由丁药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS 培养基为例介绍配置培养基的主要过程。 1、配制几种母液 (1) 配制MSfc!元素母液 一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。 分别称取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g CaCl2? 2H2O 44g MgSO4 7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放丁冰箱中。 (2) 配制MSa量元素母液 一般将微量元素配制成100倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na2MoO4 - 2H2O 0. 025g H3BO3 0.62g CuSO4 5H2O 0.0025g MnSO4 H2O 1.69g CoCl2 - 6H2O 0.0025g ZnSO4 7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放丁冰箱中。 CuSO4 5H2O和CoCl2?6H2。由丁称取量很小，如果天平精确度没有 达到万分之一，可先配成调整液。 分别称取 CuSO4 5H2O 0.05g CoCl2 - 6H2O 0.05g 各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。
植物组织培养知识点总结
植物组织培养知识点总结第一、二章 1植物组织培养概念、分类、应用、创始人、奠基人 2实验室各分室名称、主要设备、主要功能 3无菌操作技术流程 4表面消毒剂种类及作用效果 5培养基成分及各成分的作用 6植物组织培养三大难题 7那些成分要抽滤灭菌 第三、四章 8植物细胞全能性原理 9名词解释：愈伤组织、脱分化、体细胞胚、人工种子 10体细胞胚的特点 11愈伤组织形成发育的三个时期，两种类型，良好愈伤组织的特点 12植物离体微繁，一般过程，各阶段注意事项 13褐变，影响褐变的因素，克服褐变的措施；玻璃化，无糖培养技术第五、六、七章 14植物脱毒方法、原理 15脱毒率包括两种方面含义 16人工诱导单倍体的三种途径 17花药培养得到的再生植株倍性如何，为什么 18花药培养的应用，花药培养力，一般培养过程。 19离体幼胚培养，胚发育有几种类型各有何特点 20离体授粉离体受精 21简述胚乳培养的意义
第八、九章 22原生质体概念，两种分离方法，纯化方法。 23酶法分离植物原生质体的酶液组成及作用 24简述植物原生质体培养基的特点 25原生质体融合，融合的主要方法 26体细胞杂交过程 27融合产物的种类及特点 28植物细胞无性系变异，特点 29提高植物细胞无性系变异频率的方法 30细胞突变体的类型及对应的筛选方法 植物组织培养知识点总结 第一、二章 1植物组织培养概念、分类、应用、创始人、奠基人 概念：是一种将植物的器官、组织或细胞在适当的培养基上进行无菌培养，并重新再生细胞或植株的技术。 分类：（1）按外植体来源和特性分：植株培养胚胎培养器官培养组织或愈伤组织培养细胞或原生质体培养；（2）按培养方法分：固体培养液体培养固体液体两相培养 应用：（1）克服远缘杂交中杂种不育性，种子无活力或配发育不全的植物获得后代，一年多代育种（2）培育三倍体（3）单倍体育种（4）提高突变频率，筛选变异类型（5）经过细胞融合得到体细胞杂种（6）种质资源保存 2实验室各分室名称、主要设备、主要功能 化学实验室（准备室）
多肉植物组织培养那点事
偶尔就能听到关于多肉植物组培的各种传言，组培苗是什么一回事？组培苗到底好不好？为什么有那么多组培苗?如何鉴别组培苗？等等关于多肉植物组培苗的那点事，你都可以在面这篇文章里看到（文字较多，耐心观看），lansemeiyan 什么是组培苗？ 组织培养技术，指代的是利用植物体的某个部分，通过无性营养繁殖来获得新苗（克隆苗）的过程，又叫植物克隆。从广义上来说，利用多肉植物的侧芽、叶插、根插、砍头进行繁殖，都属于组织培养范畴。组培这个概念，很多人一开始可能都误解了。 那么导致市场动荡的“组织培养”到底是指代什么呢？确切的说应该是“离体快速繁殖”，即组织培养技术的一个分支——离体快速繁殖，简称“快繁”。这门技术是从叶插、根插技术演变来的，我们用土壤做叶插和根插，“快繁”则是用人工合成的基质来做，这种人工基质看上去很像果冻，而容器也由花盆变更为玻璃瓶。这就是后来大家在电视上看到的植物组织培养工厂。 为什么在玻璃瓶里的培养基可以实现快速繁殖呢？原因在于优越的外环境和植物激素的作用。快繁实验室的温度、光照和湿度都是恒定的，“培养基”里含有足够的营养和强大的植物激素。这些激素可以按照人为意愿调整植物的生长状态，让它出根还是让它出芽（但这也取决与操作者的学术水平和经验，能够从容操作激素的人在国内是有限的）。 我们平时做叶插和砍头的时候，也会取巧的使用一些激素，其实往叶插和砍头株上滴加激素的行为和“快速繁殖”的性质和道理是一样的，所获得苗也是完全一样的。很多人并没有意识到这点，而觉得不同繁殖方式获得的苗性状会不同，其实差异只在于营养富集度，就是苗的饱满度而已，叶插的总是比砍头的弱一些，
性状呈现晚一些，这是所在部位的内源激素和营养导致的，但是基因组完全一致，不会出现性状漂移。只有嵌合性性状，比如斑锦，才可能在叶插和砍头之间存在“概率学”上的差异。 回头再说大众眼中的“组织培养”（实际上是离体快速繁殖），由于人为操控植物激素的动态变化，使得离体的植物组织可以按照人的意愿出芽，一个两个无数个，因为植物的无性繁殖被认为是无限的，所以在组织培养的“快速繁殖”模式中可以无限的扩增该品种种苗，这也是“危害”市场最致命的地方。不过，必须指出的是，组培苗的无限繁殖也是有成本的，不是像刘谦的魔术一样天上掉下来的，很多人认为组培无成本或低成本，一文不值等等言论，其实都是不了解组培。 如果想获得上万株的种苗，必须有专门的组织培养实验室或工厂，这个运行成本相当巨大，可以说一般的生产商是做不到的。迄今为止，大型的组培工厂都是ZF出资建立的，换句话说大多数搞组培苗生产的人，成本是国家掏腰包的。真正自己掏钱搞组培工厂，是玩不起的。 组培技术早在70年代就出现在欧美，广泛用于种苗繁育和小体型植物的生产。温度、光照、湿度、水、肥等的人工合成、调控技术的成熟，特别是高效植物补光灯的出现推动了组培快速发展。原来只能单层平面日光棚内养植的植物，现在可以在室内人造光环境中，使用多层立体组合栽培方式进行植物的繁育和生产。 “组织培养”（离体快速繁殖）到底好不好呢？ 快繁苗，由于几乎完全是激素调控获得的，这就导致一个问题，操控激素的人是否理解植物的特性、是否熟悉激素的理论和植物生理、是否有足够的经验来
植物组织培养知识点归纳教学提纲
第一章 1、植物组织培养：是指在离体条件下，利用人工培养基对植物的器官、组织、细胞、原 生质体等进行培养，使其长成完整植株 2、外植体：在植物组织培养中，由活体（in vivo）植物上提取下来的、接种在培养基上的 无菌细胞、组织、器官等均称为外植体。 3、愈伤组织：指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 4、应用 一、农业上的应用 1. 种苗快速繁殖(rapid propagation) 2.无病毒苗(virus free)的培养 3.在育种上的应用(breeding) （1）倍性育种，缩短育种年限，杂种优势明显； （2）克服远缘杂交的不亲合性和不孕性（胚培养）； （3）保存种质 （4）创造变异 二、在遗传学、分子生物学、细胞生物学、组织学、胚胎学、基因工程、生物工程等方面的应用。用于基因工程技术创造植物新种质。用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。 三、利用组织培养材料作为植物生物反应器 第二章 1、细胞全能性（Totipotency）：指任何具有完整的细胞核的植物细胞都拥有形成一个完整植 株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 2、细胞分化（cell differentiation）：指导致细胞形成不同结构，引起功能或潜在的发育方式 改变的过程。 3、脱分化（Dedifferentiation）：指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构 和功能而恢复分生状态，形成无组织结构细胞团或愈伤组织 的过程。 4、再分化（Redifferentiation）：指脱分化的细胞重新恢复分化能力，形成具有特定结构和功 能的细胞、组织、器官甚至植株的过程。 5、植物组织培养中常遇到的问题以及解决措施 一、污染及防治： 1、真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉。但若是细菌污染，只 要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可使用。 2、用抗生素等杀菌药剂的处理，会影响植物材料正常生长。 二、褐变及防止 （1）选择合适的外植体 （2）合适的培养条件 （3）使用抗氧化剂 （4）连续转移 三、玻璃化问题及其防止
植物组织培养14179复习过程
植物组织培养14179
植物组织培养：是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用人工培养基，对离体的植物胚胎、器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术。又称为植物离体培养 离体生态学：是指研究离体培养环境条件控制的科学，其研究对象是培养基、植物材料和人工环境条件外植体：用于离体培养的那部分植物器官、组织或细胞 愈伤组织（callus）：是指外植体因受伤或在离体培养时，其细胞进行活跃的分裂增殖而形成的一种无特定结构和功能的组织 植物组织培养的特点 1.组培技术是无菌操作技术。 2.组培材料处于完全的异养状态。 3.组培材料可以是离体状态的器官、组织、细胞或原生质体。 4.组织培养物可以形成克隆（clone，无性繁殖系），也可以进行茎芽增殖或生根 5.组培容器内的气体和环境气体可通过封口材料进行交换，相对湿度通常是几乎100％，因此，组培苗叶片表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。 6.组培的环境温度、光照强度和时间都是人为设定的，其参数可调 植物组织培养的研究类型 组织培养 器官培养 胚胎培养 细胞培养 原生质体培养 植物组织培养的研究任务 研究离体培养条件下，细胞、组织或器官所需营养条件和环境条件，细胞、组织或器官的形态发生和代谢规律，植物脱毒方法和机理，植物特别是一些难繁植物的大量快速繁殖方法，细胞融合方法和机理，再生个体的遗传和变异，种质资源的离体保存机理和方法等 德国植物学家Schleiden和动物学家Schwann于1838-1839年提出的细胞学说 德国植物学家Haberlandt于1902年提出了植物细胞具有全能性
植物组织培养实验基本步骤。。
植物组织培养实验基本步骤 一、母液的配置 1、MS大量元素母液的配制 将大量元素配制成10倍的母液，使用时再稀释10倍。按照配方表中用量依次分别称取扩大10倍的：NH4NO3 、KNO3 、KH2PO4 、 MgSO4·7H2O 、CaCl2·2H2O ，所有药品称取完毕后用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，最后定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 2、MS微量元素母液的配制 将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别依次称取：MnSO4· 4H2O 、ZnSO4·7H2O 、 H3BO3 、KI 、CuSO4·5H2O 、CoCl2·6H2O ，用蒸馏水逐个溶解，待全部溶解后，用容量瓶定容至500ml，转入500ml细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 3、MS铁盐母液配制 将铁盐配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：称
FeSO4·7H2O 和Na2·EDTA ，把FeSO4·7H2O和Na2·EDTA·2H2O分别置于200ml蒸馏水中，加热并不断搅拌使之溶解（磁力搅拌器，边加热，边搅拌）。保持加热，把FeSO4溶液慢慢倒入Na2·EDTA溶液中并不断搅拌，接近沸腾时停止加热，待溶液冷却后加蒸馏水到最终容积500ml，置于棕色细口瓶中，用力振荡1～2min，贴上标签，注明母液名称、放大倍数、配制日期、配制人姓名。在室温下避光保存一段时间令其充分反应后，再置于4℃冰箱中保存备用。 4、MS有机化合物母液的配制 将有机化合物配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍。按照配方表中用量分别称取扩大100倍的：肌醇、维生素B1 、烟酸、甘氨酸、维生素B6 、蔗糖，用蒸馏水依次溶解并定容至500ml后，转入500ml 细口试剂瓶中，贴上标签，注明母液名称、配制日期、配制人姓名，置于4℃冰箱中保存备用。 二、植物激素的配置 常见激素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）、激动素（6-糠氨基嘌呤、 KT）、6－苄氨基嘌呤（6－BA）、赤霉素（GA3）、 1、生长素类： （1）、生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织
植物组织培养重点
器官培养：即离体器官的培养。植株培养：对完整植株材料的培养。 组织或愈伤组织培养:是对植物体的各部分组织进行培养或对由植物器官培养产生的愈伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形成植株. 细胞培养:是对由愈伤组织等进行液体振荡培养所得到的能保持较好分散性的离体单细胞或花粉单细胞或很小的细胞团的培养. 原生质体培养:是用酶及物理方法除去细胞壁的原生质体的培养。 初代培养：芽、茎段、叶片、花器等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程植物组织培养：是指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。 愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在植物体切面上产生。 外植体：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料。 植物细胞全能型：任何具有完成细胞核的植物细胞，能拥有形成一个完整植株所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。 脱分化:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分生组织状态的过程。 再分化:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。胚状体：在离体过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。 褐变现象：指在接种后，其表面开始褐变，有事甚至会使整个培养基褐变的现象。 继代培养材料的玻璃化：当植物材料不断的进行离体繁殖时，有些培养物的嫩芽，叶片往往会呈半透明水迹状，这种现象通常成为玻璃化。 人工种子：通过植物组织培养的方法获得的具有正常发育能力的材料，外被有特定的物质，在适宜的条件下可以发芽成苗的植株幼体。 植板密度：形成的细胞团数/植板的细胞总数×100% 对称融合：双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息。 非对称融合：指一方亲本的全部原生质与另一方亲本的部分核物质及细胞质物质重组产生不对称杂种。 继代培养：是初代培养之后的连续数代的扩繁培养过程。目的：繁殖出相当数量的无菌苗，最后达到边繁殖边生根的目的。 细胞悬浮培养：将游离的植物细胞按一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。根据培养基的类型分为: 固体培养（琼脂、卡拉胶等固化），半液半固体培养(固液双层)，液体培养（震荡、旋转或静置培养）。 液体培养的优点：不使用凝固剂，节约生产成本，营养吸收充分；操作过程简化。 组织培养按培养对象可分为：植株培养，器官培养，组织培养，细胞培养，原生质体培养。 植物组织培养一般过程:初代培养，继代培养，生根培养，驯化移栽。 植物组织培养的特点：培养条件可以人为控制，生长周期短，繁殖率高，管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。 组织培养技术在农业生产上的应用主要体现于以下几个方面：快速繁殖优良苗木；获得脱毒苗；育种上应用；工厂化育苗。 1902年，德国著名的植物生理学家和植物学家哈伯兰特提出了高等植物细胞全能性。1958年，美国植物学家斯图尔德等人，用胡萝卜根韧皮部的细胞进行培养，得到了完整植株，证明了细胞全能性。 怀特于1943年发表了《植物组织培养手册》专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。 腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一，这一比例高时，产生芽，这一比例低时，则形成根，相等则不分化。 标准的组培实验室包括：1、洗涤室，器具的洗涤，干燥和消毒，2、配置室，进行药品的保存，配置，消毒，分装等，3、灭菌室，培养基及使用器具的消毒与灭菌，4、接种室，进行材料的接种，内置超净工作
植物组织培养步骤
植物组织培养概念（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。植物组织培养概念（狭义）指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。 组织培养的步骤 一、培养基配制 配制培养基有两种方法可以选择，一是购买培养基中所有化学药品，按照需要自己配制；二是购买商品的混合好的培养基基本成分粉剂，如MS、B5等。 自己配制可以节约费用，但浪费时间、人力、且有时由于药品的质量问题，给实验带来麻烦。就目前国内的情况看，大部分还是自己配制。为了方便起见，现以MS培养基为例介绍配置培养基的主要过程。 1、配制几种母液 （1）配制MS大量元素母液 一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。 分别称取 NH4NO3 165g KH2PO4 17g KNO3 190g CaCl2·2H2O 44g MgSO4·7H2O 37g 各自配成1L的母液。倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 （2）配制MS微量元素母液 一般将微量元素配制成100倍母液。 依次称取 KI 0.083g Na2MoO4·2H2O 0.025g H3BO3 0.62g CuSO4·5H2O 0.0025g MnSO4·H2O 1.69g CoCl2·6H2O 0.0025g ZnSO4·7H2O 0.86g 配成1L母液，倒入1L试剂瓶中，存放于冰箱中。 CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。 分别称取 CuSO4·5H2O 0.05g CoCl2·6H2O 0.05g 各自配成100ml的调整液，然后取5ml就还有0.0025g的量。 （3）配制MS有机母液
植物组织培养研究进展
植物组织培养研究进展 摘要 植物组织培养技术作为一种科研手段,发展异常迅猛。从组织培养的原理、培养过程中遇到的问题以及前景和展望这3方面综述了我国近几年植物组织培养的新研究。 关键词: 组织培养；存在问题；措施；发展 20 世纪后半叶，植物组织培养发展十分迅速，利用组织培养，不仅可以生产大量的优良无性系，并可获得人类需要的多种代谢物质；细胞融合可打破种属间的界限，克服远缘杂交不亲和性障碍，在植物新品种的培育和种性的改良中有着巨大的潜力；还可获得单倍体、三倍体及其它多倍体、非整倍体；组织培养的植物细胞也成为在细胞水平上分析研究的理想材料[1]。因此，植物组织培养广泛应用于植物科学的各个分支，如植物学、植物生理学、遗传学、育种学、栽培学、胚胎学、解剖学、病理学等，并广泛应用在农业、林业、医药业等多种行业，产生了巨大的经济效益和社会效益，被认为是一项很有潜力的高新技术。 1组织培养的基本原理 1.1植物组织培养的概念 植物组织培养技术是指在无菌条件下，将离体的植物器官(如根尖、茎尖、叶、花、未成熟的果实、种子等)、组织(如形成层、花药组织、胚乳、皮层等)、细胞(如体细胞、生殖细胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生质体培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱发产生愈伤组织或潜伏芽等，或长成完整的植株的技术[2]。 1.2植物组织培养的依据 植物组织培养的依据是植物细胞“全能性”及植物的“再生作用”。1902年，德国著名植物学家GHaberlanclt根据细胞学理论[3]，大胆地提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直到单个细胞，即植物体细胞在适当的条件下具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜力的观点。1943年，美国人White在烟草愈伤组织培养中, 偶然发现形成一个芽, 证实了GHaberlanclt的论点[4]。在许多科学家的努力下，植物组织培养技术得到了迅速发展，其理论和方法趋于完善和成熟，并广泛应用产生了巨大的经济效益和社会效益。 1.3培养基的选择 组织培养的基础培养基有MT、MS、SH、White等[5]。由于不同植物所需要的生长条件有所不同，会对培养基做一些不同的处理，一般采用较多的是MS。组织培养采用固体培养基的较多，但只有在植物周围的营养物和激素被吸收，如果其他残留的培养基也能被利用，对工厂化生产的成本减少方面有很大的帮助。董雁等[6]利用回收转换后废弃的继代培养基，加入原继代培养基30 %浓度母液的培养基，培养效果与原继代培养基的基本相同，说明继代培养基再利用是可行的，这为规模化组培育苗开辟了新的途径。杜勤[7]等在无外源激素条件下，研究液体和固体培养基对黄瓜子叶培养器官分化的影响，结果用液体培养基直接诱导花芽率更高，分化高峰期出现的时间也更早，说明液体培养基对外植体的生长更有利，只是固体培养基更易操作而被较广泛应用。 2植物组织培养过程中存在的问题 2.1 污染问题 组织培养过程中的污染包括内因污染和外因污染。内因污染指由于外植体的表面或者内部带菌而引起的污染；外因污染则是主要由环境污染和操作不当引起，是指在接种或培养过程中病菌入侵，例如培养基、接种工具和接种室消毒不严格以及操作不规范等[8]。 针对植物组织培养中污染产生的原因，应从以下2个方而着手来控制污染。一是控制外植体自身带菌，外植体的表而带菌可以经过一系列的杀菌处理来减少；而外植体的内部带菌是不
水稻转基因组织培养步骤的具体事宜
农杆菌介导的转化 一．试剂 1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-5898 2 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-0753 3 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-0640 4 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-5148 5 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-8407 6 Kanamycin USB Cat No. 17924 7 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-7290 8 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-010 9 Cn (Carbenicillin) 国产分装 10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-0765 11 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-8666 12 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-3902 13 Inositol Sigma Cat No. I-3011 14 Phytagel Sigma Cat No. P-8169 15 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-5879 16 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-3783 17 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG 二．溶液 1.MS max NH4NO316.5g KNO319.0g KH2PO4 1.7g MgSO4?7H2O 3.7g CaCl2?2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g 逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。 2.MS min母液(100×) KI 0.083g H3BO30.62g MnSO4?4H2O 2.23g 或MnSO4? H2O 1.69g ZnSO4?7H2O 0.86g Na2MoO4? 2H2O 0.025g CuSO4? 5H2O 0.0025g CoCl2? 6H2O 0.0025g 注意：Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合。 加dH2O定容到1000ml室温保存。 3.N6max母液(10×)