吉玛RNA手册

THE RNAi COMPANY

RNAi 产品使用手册

上海吉玛制药技术有限公司

Shanghai GenePharma Co.,Ltd.

Ⅰ. RNAi 简介 1

A.RNAi 实验原理

B.RNAi 实验流程

C.RNAi 实验所需试剂

D.上海吉玛 RNAi 相关产品

Ⅱ. siRNA 设计7

A. 哺乳动物siRNA 设计

B. 上海吉玛 siRNA 产品特性

C. siRNA oligo 技术数据

Ⅲ. siRNA 对照9

A.普通阴性对照

B.荧光标记的阴性对照

C.siRNA 阳性对照

D. 转染试剂对照

E. 避免off-target 对照

Ⅳ. siRNA 转染10

A.siRNA 转染的方法

B.RNAi-Mate 转染试剂

C.RNAi-Mate 适用的细胞类型

D.转染前细胞培养

E.RNAi-Mate：siRNA/DNA 比例

F.贴壁细胞转染程序

G.悬浮细胞siRNA 转染程序

H.DNA 和siRNA 共转染细胞程序

I.体内siRNA 导入方法

J.siRNA 转染常见问题与建议

Ⅴ. mRNA 水平RNAi 效果监测15

A.siRNA 细胞转染条件优化

B.Real-Time PCR RNAi 效果检测

C.Real-Time PCR 结果分析

Ⅵ. 蛋白质水平RNAi 效果监测20

A.western-blot 原理

B.western-blot 操作步骤

C.western-blot 上样液的制备

D.western-blot 常用试剂的配制

Ⅶ. RNAi 实验常见问题解答22Ⅰ. RNAi 简介

A. RNAi 实验原理

RNA 干扰（RNA interfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III 家族成员之一的，dsRNA 特异性的核酸酶Dicer 将dsRNA 裂解成由21-25 个核苷酸组成的小干扰RNA (small interfering RNA，siRNA)，随后siRNA 作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

B. RNAi 实验流程

C. RNAi 实验所需试剂

D. 上海吉玛RNAi相关产品

普通siRNA Oligo 上海吉玛siRNA Oligo 是在ISO9000 质量标准下

生产并经过了反复优化和严格测试；产品质量高

度稳定，以退火双链RNA 冻干粉的产品形式提

交给用户。

化学修饰siRNA Oligo 上海吉玛化学修饰siRNA Oligo 不仅增强了

siRNA 在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同

时与标准siRNA 作用时间相比，上海吉玛化学修

饰siRNA Oligo 的作用时间可延长一倍左右。

荧光标记siRNA Oligo 荧光标记siRNA oligo 可用荧光显微镜、流式细

胞仪、激光共聚焦显微镜等观察到，可直观地观

察siRNA 转染效率，优化转染条件；荧光标记的

siRNA oligo siRNA 还可用于siRNA 细胞定位及双标实验（配合标记抗体）来追踪转染过程中导入了siRNA 的细胞，将转染与靶蛋白表达结合起来。

siRNA 阴性对照上海吉玛 RNAi negative control与哺乳动物基因无

同源性，作为实验的阴性对照，同时通过标记荧

光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染的效率，

有利于优化转染条件。荧光容易拍摄，它有很好的

pH 耐受性，因而在活细胞中更稳定。

siRNA 阳性对照上海吉玛RNAi positive control 用于确定实验中转

染、RNA提取和检测方法的可靠性。上海吉玛提供

的阳性对照包括LaminA/C、GFP22、Luciferase

GL2、MAPK1、Beta-Actin、Vimentin、P53、

GAPDH、Cyclophilin B 等。

siRNA 转染RNAi 转染试剂RNAi 转染试剂是一种基于脂质的转染试剂，专门

用于转染，确保没有RNAse活性，细胞毒性低。适

用细胞广泛；可在含有抗生素的完全培养基中转

染；即用型试剂，不必更换培养基，操作简便易

行，重复性好，可在半小时内完成操作；介导

siRNA高转染细胞和体内高效导入，即使在含血清

培养基中

也能表现高转染效率；4℃下可长期保存。

RNAi 表达载体法shRNA 表达载体上海吉玛shRNA 表达载体的特点是：克隆载体具

有两种形式的克隆酶切位点BamH1 和Bbs1，可

形成非对称互补粘末端，保证插入片断的方向正

确，有效避免载体自体连接；多种筛选标记确定稳

定转染细胞系；GFP 报告基因帮助评价转染效率

并指示RNAi 发生位点。上海吉玛现可提供8 种

shRNA 表达载体，详见公司总目录C-6 页。Ezol RNA Extraction

Reagent

Ezol试剂是用于总RNA 抽提的试剂，适用于人

类、动物、植物、细菌等组织或细胞的总RNA 提

取；无论是小量的细胞（5×106）或组织（50-

100mg）还是大量的细胞（107）或组织（>1g）都

可得到出

核酸抽提

色的结果；操作简便，可实现RNA 的快速抽提。Enzol RNA Extraction

Reagent

Enzol试剂是用于哺乳动物基因组DNA 抽提的试

剂，适用于组织、单层或悬浮细胞的基因组DNA

提取。通常使用本试剂，从20 毫克组织可以抽提

到约40 微克基因组DNA，从106-107Hela 细胞

可以抽提到约25 微克基因组DNA，是一种简

单、快速、高效、经济的方法。

RNAi-Startup GAPDH

Control Kit

本试剂盒可以用来优化siRNA 转染条件，也可作

为RNAi 实验的内参使用。荧光标记的dsRNA

可直观地观察细胞转染情况；包含GAPDH

siRNA 阳性对照和阴性对照；应用Real-Time

PCR 方法准确评价转染前后GAPDH 基因的

RNAi 抑制情况；为优化转染条件提供直观依据。RNAi-Startup GAPDH

Basic Control Kit

荧光标记的dsRNA 可直观地观察细胞转染情况；

包含GAPDH siRNA 阳性对照和阴性对照；应用

Real-Time PCR 评价转染前后GAPDH 基因活性

时, 本试剂盒适用于Real-time PCR Core Reagent

（目录号QSG-070）。

RNAi Gene-Knockdown Easy Kit 使用本试剂盒可以完成从“向细胞中导入siRNA 及转染效率评价”到“实时RT-PCR 验证RNAi Knockdown 效果”的全部过程

；荧光标记的

dsRNA 可直观的观察细胞转染情况；内含

GAPDH siRNA

基因表

达检测

阳性对照和阴性对照及PCR 扩增引物和探针，可

应用定量PCR 方法直观评价转染效率及验证

GAPDH 的RNAi 抑制效果；可作为RNAi 实验

的阳性和阴性对照使用。

RNAi-Startup IFN

Response Basic Control Kit

哺乳动物细胞中长链的双链RNA（dsRNA）能够

诱导干扰素效应，引起非特异性的转录抑制。如

果您不确定您的siRNA 序列是否会诱发非特异性

的IFN 效应，则可用本试剂盒进行验证；应用

Real-Time PCR 检测非特异性IFN 效应时，本试

剂盒适用于Real-time PCR Core Reagent（目录

号

QSG-070）。

RNAi-Startup IFN

Response Control Kit

如果您不确定您的siRNA 序列是否会诱发非特异

性的IFN 效应，则可用本试剂盒进行Realtime

PCR 验证；同时检测PKR, OAS-1 和 hStat1 三个

IFN 效应基因并提供GAPDH 管家基因对照；检

测灵敏度高，结果直观且易于判断。

常备的RNAi 管家基因Control

试剂盒

上海吉玛制备了一些常用管家基因的RNAi 实验

Control Kits，以方便广大科研工作者开展RNAi

实验。详见上海吉玛产品目录荧光定量PCR 分册

C8 页。

Ⅱ. siRNA 设计

A. 哺乳动物siRNA 设计

哺乳动物siRNA 设计需要注意的几个方面

基因抑制的有效性很大程度取决于目的基因1．从转录本（mRNA）的AUG 起始密码开始，寻找“AA”二连序列，序列的选择。目的序列可以随机选择也可以并记下其3'端的19 个碱基序列，作为潜在的siRNA 靶位点。正义链通过在目的基因的不同区域上测试不同的序和反义链都采用这19 个碱基(不包括AA 重复)来设计。

列以决定何种序列是最有效的。

2．避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。

3．siRNA 序列的GC 含量应为30%-60%左右。

4．在设计siRNA 时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated

regions，

UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些

UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP 核酸内切酶

复合物结合mRNA 从而影响siRNA 的效果。

5．将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没

有同源性。

6．将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进

行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用

BLAST（https://www.wendangku.net/doc/7011642803.html,/BLAST/）。

7．选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的

siRNA，以找到最有效的siRNA 序列。

8．阴性对照:一个完整的siRNA 实验应该有阴性对照，作为阴性对照

的siRNA 应该和选中的siRNA 序列有相同的组成，但是和

mRNA 没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA 序列打

乱，同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。

9．有结果显示，UU 结尾和dTdT 结尾的siRNA 在效果上没有区别，

因为这个突出端无需和靶序列互补。合成siRNA 时可直接提供以AA

打头的21 个碱基序列。

B. 上海吉玛 siRNA 产品特点

上海吉玛拥有处于国际领先水平的siRNA 化学合成的全部核心技术，包括RNA 单体合成、普通siRNA 合成、化学修饰siRNA 合成、荧光标记siRNA 合成等。siRNA oligo 合成是在ISO9001 质量标准及严格控制的流程和条件下完成的，确保了产品质量的高度稳定。化学合成siRNA 有操作简便、转染效率高、对细胞的或者组织的毒副作用小、可大规模制备等优点，特别适用于基因靶位点不确定情况下，进行siRNA 有效片段的筛选。化学修饰的siRNA Oligo 不仅增强了siRNA 在血清、体内及细胞培养中的稳定性，同时也延长了siRNA 的作用时间。

C. siRNA oligo 技术数据

与siRNA 相关的一些技术数据及注意事项

1．siRNA 的平均分子量13,300。

2．siRNA oligo 的OD、nmol 和质量间有相应的公式可以计算；

一般情况下，对于一个21 bp 的siRNA oligo，有如下简单关

系：1 OD duplex＝3.0 nmols＝40 ug

3．1 OD 的siRNA 欲溶解为20 uM 的样品，可用150 uL DEPC

H2O 去重悬1 OD 的siRNA，溶解后为20 uM 的样品。

4.由于Oligo RNA 呈很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以

打开管子前先离心，然后再慢慢打开管盖，溶解时请加足量DEPC 水

后盖上管盖，振荡溶解。

5．荧光标记的RNA，如FAM、HEX、TAMRA 等标记的Oligo

因为对光敏感，必须避光保存。

Ⅲ. siRNA 对照A．普通阴性对照

上海吉玛可提供与目的基因序列无同源性的通用阴性对照和将选中的siRNA 序列打乱（scrambled）的普通阴性对照。1．siRNA 实验应该有阴性对照；

2．通用阴性对照为与目的基因的序列无同源性的普通阴性对照；

3．Scrambled 阴性对照和选中的siRNA 序列有相同的组成，但是和mRNA 没有明显的同源性；

4．阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因没有同源性。

B．荧光标记阴性对照

上海吉玛可提供与目的基因序列无同源性的荧

光标记（6-FAM）通用阴性对照。

1．上海吉玛 RNAi negative control 与哺乳动物基因无同源性；

2．通过标记荧光，可以方便地在荧光显微镜下观察转染情况；

3．可用于优化转染条件和评价转染效率；

4．具备很好的pH 耐受性，在活细胞中更稳定。C．siRNA 阳性对照

阳性对照作为一个实验系统检查是很重上海吉玛可提供的siRNA 阳性对照要的。您可以利用阳性对照来确认 RNAi

LaminA/C

实验中转染、RNA提取和基因表达检测方GFP22 法是可靠的。

D．转染试剂对照1

2

3Luciferase GL2 4MAPK1

Beta-Actin

5

6Vimentin

7P53

8GAPDH

9Cyclophilin B

对于一个完善的对照系统，转染试剂对照(Mock transfection )是不可缺的。转染

试剂对照可以检测转染试剂对细胞的毒性、细胞的

Ⅳ. siRNA 转染

A ．siRNA 转染的方法

哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene 、机械法（例如,显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。

应用脂质体型转染试剂进行转染需要注重的几个方面：

1． 转染试剂的用量

2． siRNA 的用量

3． 转染时的细胞密度

4． 转染时的操作顺序

5． 细胞与转染试剂/siRNA 复合物的温浴的时间

B ．Lipofectamin2000 转染试

剂

Lipofectamin2000的应用领域：

成活率等细胞转染的各个因素影响。

E ．避免 Off-target 对照

对于 RNAi 研究来说，在哺乳动物中，off-target 效应是一个十分

关注的问题。有大量的报道，一个 siRNA 影响多个基因的表

达。因此，大量研究关注于用针对同一个基因的不同区域的多个 siRNA 进行实验，然后分析各自对基因表达效果的影响。理想的结果是针对不同区域的 siRNA 对同一个靶基因产生相似的干扰效果。上海吉玛公司的技术人员为您针对同一个靶基因设计多对 siRNA oligos,为您解决 off-target 的难题。

选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子。Lipofectamin2000适用于核

酸的体内和体外操作，可应用于DNA、RNA、反义寡核苷酸、siRNA的转染，也可应用于

DNA/siRNA的共转染操作；是一种新型的高效siRNA转染试剂。□ 原代培养细胞和转化细胞株的基因转染

□ siRNA高通量转染试验

□ DNA转染；DNA和siRNA的共转染

□ 核酸（siRNA、DNA、RNA）的体内导入试验

□贴壁细胞和悬浮细胞转染

Lipofectamin2000 的特点：

□ 不必更换培养基，操作简便易行，可在半小时内完成操作□ 在含血清培养基中也能表现高转染效率

□ 细胞毒性低；适用细胞广泛

□ 即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染

□ 基于脂质的转染试剂，确保没有RNAse活性

□可介导siRNA高转染细胞及体内siRNA的高效导入

C．Lipofectamin2000 适用的细胞类型

Lipofectamin2000转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和siRNA转染如：HeLa(人颈部癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-

k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5 DNA转化的人胚胎肾细胞),SVRbag4细胞等。

D．转染前细胞培养

在细胞板上培养细胞时，应使细胞汇合在24小时内达到

70-90%。

1.5×104-5.0×104

48孔板100 3.0×104-1.0×105200μL

24孔板200 8.0×104-2.0×105500μL

12孔板401 1.6×105-4.0×105 1.0 mL

6孔板962 3.0×105-8.0×105 2.0 mL

35 mm 962 3.0×105-8.0×105 2.0 mL

60 mm 2827 1.0×106-2.5×106 6.0 mL

E．合适的lipofectamin2000 用量

合适的siRNA(DNA)：lipofetamin2000 比例对核酸的高效

转染有重要影响；我们推荐的DNA：lipofetamin2000 为

1：

0.5—1：5（ug:ul），siRNA：lipofectamin2000 为1：

0.01-1：

0.1（pmol：ul）一般情况下，此范围内都可获得高的转

染效率。

24孔板20pmol/0.8μg 500μL 1μl /2μl

12孔板40 pmol /1.6μg 1 mL 2μl /4μl

6孔板100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl

35 mm 100 pmol /4.0μg 2 mL 5μl /10μl

60 mm 600 pmol /8.0μg 5 mL 10μl /20μl

F．贴壁细胞转染程序

1．转染前一天，4-5×104细胞接种在24 孔板上， 0.5mL 含FBS 基。和抗生素的DMEM（或Opti-MEM，其他培养基）细胞培养

选用生理状态良好的细胞对提高转染效率很2．选择用于初期接种的细胞数量，应能在24 小时内使细胞汇合

重要。siRNA(DNA)和lipofectamin 的用量和达到70-90%。

两者的比例可在推荐范围内适当调整。 3.在50μl 的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无

血清培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混

匀；

4.混匀lipofectamin 试剂，用50μl 无血清的DMEM 或Opti-

MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin 试

剂（DNA 转染时，则加入2μllipofectamin 试剂），轻轻混

匀，室温放置 5 分钟；

5.将稀释好的siRNA 和RNAi-Mate 试剂混合；轻柔混匀，室温

放置20 分钟, 以便形成siRNA/lipofectamin （或

DNA/lipofectamin）复合物。

6.将100μl siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物

加到含有细胞和培养基的培养板的孔中，来回轻柔摇晃细胞培

养板板。

7．细胞在CO2 培养箱中37℃温育24h-48h 后，进行转染后

的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6 小时后，除

去复合物，更换培养基。

G．悬浮细胞转染程序

1．转染的当天，收集细胞离心，用含FBS 的培养基重悬。

2．在50μl 的DMEM（或Opti-MEM，或其他无血清培养基）无

血清的培养基加入20pmol siRNA(或0.8μg DNA)，柔和混匀；

3．混匀lipofectamin 试剂，用50μl 无血清的DMEM 或Opti-MEM，或其他无血清培养基）稀释1μl lipofectamin 试

剂（DNA 转染时，则加入2μl lipofectamin 试剂），轻轻混

匀，室温放置 5 分钟；

4．将稀释好的siRNA 和lipofectamin 试剂混合；轻柔混匀，室温放置20 分钟, 以便形成siRNA/lipofectamin

（或

DNA/lipofectamin）复合物。

5．再加入400μL 细胞悬浮液（细胞数量决定于细胞类型和

转染后分析测试的时间）。

6．细胞在CO2 培养箱中37℃温育24h-48h 后，进行转染后

的其它检测步骤。如果细胞株比较敏感，孵育4-6 小时后，除

去复合物，更换培养基。

H．DNA 和siRNA 共转染细胞

1．在转染的前一天，4-5×104细胞接种在24 孔板上，0.5 mL 含

FBS 和抗生素的细胞培养基。

2．选择用于初期接种的细胞密度，应能在24 小时内使细胞汇合

达到70-90%。

3．在100μL 的无血清的培养基中稀释20pmol siRNA 和0.2μg

DNA，加入2μl lipofectamin 试剂，充分混合，放置20 分钟,

以便形成siRNA/ DNA/lipofectamin 复合物。

4．将siRNA/ DNA/lipofectamin 复合物加入培养基中，轻轻混匀。

5．细胞在37℃温育24h-48h 后，进行转染后的其它步骤。I．siRNA 体内导入方法

1．适量的siRNA 或DNA 溶于不含RNA 酶的无菌水中，轻轻混

匀，因为注射液体积有限，建议采用高浓度的siRNA 或DNA，

一般DNA 为2μg /μL、siRNA 为10μg /μL。

2．取适量的DNA、siRNA 或siRNA\DNA 复合物与

lipofectamin 混合。例如，在1#管中加入0.5μL 的DNA

（1μg）和0.5μ

L 的siRNA（5μg），在2#管中加入0.55μL 的

lipofectamin （24μg）和0.45μL 不含RNA 酶的无菌水中，

将1#管中的溶液加入2# 管中，在室温下温育30 分钟，以

形成siRNA/DNA-lipofectamin 复合物。

3．制备的siRNA/DNA-lipofectamine 复合物可用于体内导入

siRNA、DNA 或siRNA\DNA。

J．siRNA 转染常见问题与建议

RNAi-Mate：siRNA(DNA)未优化

我们推荐的DNA：lipofetamin2000为1：0.5—1：5

（ug:ul）， siRNA：lipofectamin2000为1：0.01-1：0.1

（pmol：ul）

siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物浓度低可适当提高siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物的浓度

细胞生长状态不好非最佳状态的细胞会降低转染效率，建议细胞接种后在24 小时

内达到70-90%，并在24 小时内完成转染。

DNA 或siRNA 的纯度太低使用高质量的DNA 或siRNA，最好使用柱纯化的DNA 和

HPP 级的siRNA

稀释DNA 或siRNA 的培养基中含有血清一般情况下，血清不会明显降低siRNA/lipofectamin （或

DNA/lipofectamin）复合物的形成，建议使用不含血清的培养基

稀释DNA 或siRNA

细胞汇合情况不一致使用相同数量的种细胞，接种后的培养时间、培养条件一致

细胞传代次数太多使用传代次数较低的细胞

与细胞生存相关的关键基因被关闭重新设计实验

细胞状态欠佳使用传代次数较低的细胞；细胞接种后在24小时内达到70-

90%，并在24 小时内完成转染。

siRNA/RNAi-Mate（或DNA/lipofectamin）复合物浓度过高siRNA/lipofectamin（或DNA/lipofectamin）复合物一般不会影响细胞生长，当浓度过高时，有时也会产生毒性。

表达载体设计不对或siRNA 设计不正确重新设计

转染后的培养时间过短基因需要一定时间表达，适当延长培养时间

Ⅴ. mRNA 水平RNAi效果监测

A. siRNA细胞转染条件优化

证实siRNA的作用效果和优化转染条件的最佳方法就是：

特异基因的siRNA处理的细胞与阴性对照siRNA处理的

细胞，通过qRT-PCR监测靶基因转录水平。

1. 细胞转染条件优化实验流程（RNAi-Startup GAPDH Control Kit）

细胞培养siRNA推

荐量

siRNA

优化范围

培养基最终

体积

Lipofectamin

推荐量

Lipofectamin

优化范围

96孔板5pmo 2.5-10pmol 100μL 0.25μl 0.1-0.5μL 24孔板20pmol 10-40pmol 500μL 1μl 0. 5-2μL 12孔板40 pmol 20-80pmol 1 mL 2μl 1-4μL 6孔板100 pmol 50-200pmol 2 mL 5μl 2.5-10μL 35 mm 100 pmol 50-200pmol 2 mL 5μl 2.5-10μL 60 mm 600 pmol 0.3-1.2nmol 5 mL 10μl / 5-20μL

1.2

1

0.8 0.6 0.4 0.2 0

2. RNAi-Startup GAPDH Control Kit 试剂盒组成

本试剂盒可完成20次siRNA 转染条件

的优化，也可作为RNAi 实验的内参使用。荧光标记的

检测

定量PCR 是在传统PCR 反应体系的基础上添加了具有荧光标记的探针，并通过检测PCR 反应管内荧光信号的变化情况

来实时监测PCR 反应进行的情况。应用定量PCR 检测RNAi 效果只需要总RNA 抽提及qRT-PCR 两步。有关Real-Time PCR 的原理请参阅上海吉玛 目录荧光定量PCR 分册。

1. 细胞总RNA 的抽提（Ezol Total RNA Extraction Reagent ）

□EZOL 试剂是用于总RNA 抽提的试剂，适用于人类、动 20 毫克组织或 106-107个细胞/ml Ezol 物、植物、细菌等组织或细胞的总RNA 提取。样本经 混匀后室温搁置 15min

EZOL 充分裂解后加入氯仿离心，形成上清层、中间层和有机层， 收集上清层用异丙醇沉淀RNA 。

按 200ul 氯仿/ml Ezol 加入氯仿，振荡混匀，冰上放置 10 分钟

□产品特点

4℃ 12,000 rpm 15min 可获得高纯度、高产率的 RNA 。 适用于多种细胞或组织总RNA 的

提取。 无论是小量的细胞（5×106）或组织（50-100mg ）还 是大量的细胞（107）或组织（>1g ）都可得到出色的 取上层水相移入 0.5 ml EP 管内，加入等体积预冷的异丙醇 结果。 颠倒混匀，室温搁置 10～15 分钟

G A P D H/ β - act in

操作简便，可实现RNA的快速抽提。

4℃ 12,000 rpm 10min，

轻倒上清，吸水纸上沾干，

按1ml 乙醇/ml 抽提液加入75％冰乙醇轻旋颠倒洗涤

4 ℃ 12,000 rpm 5min

轻倒上清，吸水纸上倒扣沾干，适度干燥

DEPC H2O或TE溶液溶解RNA

2．RT 反应获得cDNA

RT 反应混合物的配置过程应在冰上完成；各试剂使用前最好振荡混匀。

表. RT反应体系组成

PCR 分册F9 页。

对于疑存在二级结构的RNA模板，可提高RT温度至42°C。

□ 37°C 孵育30分钟，进行RT反应；

□ 85°C 10分钟灭活逆转录酶；

□ 如RT产物不及时使用，请于–20°C保存；

3. Real-Time PCR 反应

* Custom Real-Time PCR Gene Detection Assay （

使用TaqMan 探针或SYBR Green1检测

时，荧光信号采集在PCR 的延伸阶段； 使用Beacon 探针检测时，应在PCR 退 Real-Time PCR 反应条件：

火阶段采集荧光。 94_℃ for 2 min ，94_℃ for 20 s ， 60℃30 s 40 cycles

C. Real-Time PCR 结果分析

对于 RNAi 实验而言，我们通常需要知道的是某一特定细胞在导入 siRNA 前后某一特定基因的表达变化情况来判断 siRNA 起到了 Gene Knockdown 作用。应用荧光定量 PCR 的方法，可以通过两种途径来实现上述判断，一是测定特定细胞在导入 siRNA 前后某一特定基因 mRNA 数量的变化，即为绝对定量；二是通过检测特定基因与某一管家基因在在导入 siRNA 前后相对表达情况的变化，即为相对定量。通常采用相对定量的方法来检测 siRNA 的 Gene Knockdown 作用。

1．Real-Time PCR 实验设计

Real-Time PCR 实验设计时应包括实验组（导入siRNA ），阴性对照（Negative Control ）和Mock

Transfaction 三组。每组至少三个重复。各组同时检测

RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法

RNA干扰的作用机制及小干扰RNA的合成方法 RNA干扰（RNA interference，缩写为RNAi）是指一种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默[1]。与其它基因沉默现象不同的是，在植物和线虫中，RNAi 具有传递性，可在细胞之间传播，此现象被称作系统性RNA干扰(systemic RNAi)[2,3]。在秀丽隐杆线虫上实验时还可使子一代产生基因突变，甚到于可用喂食细菌给线虫的方式让线虫得以产生RNA干扰现象。RNAi现象在生物中普遍存在。 1.RNAi的作用机制 目前关于基因沉默的假说认为，转录后水平的基因沉默，主要包括起始阶段、效应阶段和倍增阶段。 1.1起始阶段 外源性导入或由转基因、转座子、病毒感染等多种方式引入双链核糖核酸(dsRNA)，在细胞内特异性与RNA酶Ⅲ(RNAaseⅢ核酸内切酶) Dicer结合，dsRNA被切割成21~23nt 长度的带有3′端单链尾巴及磷酸化的5′端的短链dsRNA，即小干扰RNA(siRNA)。 1.2效应阶段 双链siRNA可以与含Argonauto（Ago）蛋白的核酶复合物结合形成RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）并被激活。在A TP供能情况下，激活的RISC 将siRNA的双链分开，RISC中核心组分核酸内切酶Ago负责催化siRNA其中一条链去寻找互补的mRNA链，然后对其进行切割。反义链先与同源mRNA配对结合，然后RISC在距离siRNA 3'端12个碱基的位置将mRNA切断降解，从而阻止靶基因表达，使基因沉默[1]。 1.3 倍增阶段 siRNA在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的作用下，以mRNA为模板，siRNA为引物，扩增产生足够数量的dsRNA作为底物提供给Dicer酶，产生更多的siRNA，可再次形成RISC，并继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。并作用于靶mRNA。如此反复倍增，从而使RNAi的作用进一步放大。因此少量的siRNA就可以产生高效的基因沉默效果[4]。2.RNAi的设计及合成

RNA干扰设计

什么是siRNA和RNAi 双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA,这些小片段一旦与信使RNA(mRNA)中的同源序列互补结合，会导致mRNA失去功能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因“沉默”了。 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA引发的转录后基因静默机制，它通过生物体内siRNA介导识别，特定RNA水解酶参与，并靶向切割同源性靶mRNA。实现RNA干扰现象是真核生物中普遍存在的抵抗病毒等外来入侵、抑制转座子活动、调控基因表达的监控机制。目前RNA干扰技术已成功用于基因功能和信号转导系统上下游分子相互关系的研究。随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐明，大量的论文被发表，成百上千的专利被授权或递交申请，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工具以及新药开发的诱人前景，RNAi也越来越为人们所重视。 RNAi技术发展历程 1998：植物基因中基因沉默现象的发现 2000：哺乳动物细胞中基因沉默的实现 2001：被《科学》评为当年十大科技突破之一 2003：动物体内观察到RNA干扰作用 2004：在恒河猴上的SARS病毒研究取得进展 2004：Acuity Pharmaceutical 第一个RNA干扰药物申请IND 2004：siRNA Therapeutics 第一个RNA干扰药物申请IND 2005：第一个RNA干扰药物进入一期临床，取得良好的效果 2005：化学修饰的siRNA oligo 体内系统给药取得突破 2006：诺贝尔医学奖授予两美国RNAi技术专家 2007：美国卫生研究院（NIH）组建首个RNAi委员会，旨在为NIH 的科学主管给出有关如何尽可能改善他们对RNAi 技术的评估 截止2008年：已有七项核酸干扰药物项目在美国进入临床试验，其中，有一项药物已经推入到第III期临床试验 RNAi 2006诺贝尔医学奖述评 ——年轻的获奖者—— 2006年10月2日，现年47岁的Andrew Z. Fire和45岁的Craig C. Mello由于在RNAi(RNA interference，RNAi)及基因沉默现象研究领域的杰出贡献而今年诺贝尔医学奖获得者，且获奖日期距其研究发表仅8年时间，获奖速度之快亦令人叹为观止。颁奖委员会评价：“他们发现了控制基因信息流通的基本机制，解释了困惑这一研究者们许久的难题。”“像在清晨突然打开窗帘，然后一切都一目了然了”。 —— RNAi的殊荣—— 2001年，随着人类基因组测序的完成，针对其它多种生物的基因组测序计划也相继开展起来。在未来的一段时间内，科学界将不会出现比人类基因组测序更瞩目的技术。有人将人类基因组测序称为“21世纪科学发展史上的里程碑”、“生物学领域最重要的成就之一”。然而时隔不久，同一年在哺乳动物中发现的RNAI掀起了一场风暴，而且愈演愈烈。《Science》杂志将RNAi称为“2002年的重大突破”(Couzin，2002)。然而，更加令人吃惊和兴奋的是，4年以后的今天，Andrew Fire和Craig Mello就因此获得2006年诺贝尔医学奖。一项全新的技术在提出后短短几年就得到诺贝尔奖的青睐和肯定，此前是绝无仅有的，这也足见RNAi在医学领域的开创性意义和极大的应用前景。 —— RNAi的机制——

RNA干扰综述

RNAi研究及其进展 公光业M110107259 前言 RNAi是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA 启动的序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。1998年，Andrew Fire等首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中。由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力。RNAi被《Science》杂志评为2010年十大科学成就之一，2002年又名列《Science》杂志十大科学成就之首，成为分子生物学研究的热点。本文综述了该研究的最新进展。正文 RNAi的发现： 上世纪90年代，科学家们在进行生物遗传改良的研究中，发现靶生物体内产生了一种非期望的表型。最早报道的是在1990年美国科学家Jorgensen等,他们在增强矮牵牛花紫色的转基因研究中，得到的结果是转基因植株部分或完全开白花，表明色素合成途径被关闭而不是被加强。他们将这一现象称为共抑制(cosuppresion)，后来的研究者称之为转录后基因沉默。此后不久，科学家们开展了真菌中的RNAi 的研究。1994年，意大利的Cogoni在野生型粗糙链抱霉(Neurospora crassa)的转基因研究中，把抑自身和相应内源基因表达的基因沉默现

象称为消除作用(quelling或基因压制)。 1995年，Guo等利用反义RNA技术阻断线虫的par-1基因表达，发现无论是给线虫注射正义RN A还是反义RN A，都可以抑制特异基因（par-1）的表达，结果与反义RNA技术的传统机制正好相反。这种出乎意料的发现引起了各国科学家的注意，从此展开了RNAi在动物体内的研究。1998年，Frei在研究秀丽隐杆线虫基因沉默时，首次揭开了Guo遇到的悬疑：Guo遇到的正义RNA抑制基因表达现象，是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起的，并且还发现双链RNA能够比反义RN A或正义RNA更有效地关闭基因的表达，抑制基因表达的效率比单链RNA至少高2个数量级，他们称这种现象为RNAi。从此，一个新的基因功能研究领域诞生了，人们已在不同种属的生物中进行了广泛而深人的研究，结果不仅证实R- NAi现象存在于秀丽小杆线虫、植物、真菌、果蝇、锥虫、涡虫、水媳、斑马鱼、小鼠乃至人类等多种生物中，而且对RNAi的分子机制逐渐有了比较清晰的认识，植物中的“共抑制”和真菌中的“压制”，与动物中双链RNA诱导的RNAi具有高度保守的相似机制。 RNAi作用机制: 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA （大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作

RNA干扰技术的原理及应用

RNA干扰技术的原理与应用 RNA干扰( RNAinterference , RNAi )是通过小干扰RNA ( small interference RNA, siRNA ) 造成目的mRNA特异性降解, 从而使基因转录后沉默的一种现象。这一现象广泛存在于自然界, 是生物体进化过程中抵御外来基因侵害的一种机制, 为稳定基因组发挥了重要作用。由于RNAi可以作为一种简单、有效的代替基因剔除的遗传工具,正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命, 并将加快这个领域的研究步伐。 1 RNAi现象的发现及发展 1995年, Guo等用反义RNA阻断秀丽新小杆线虫的part 1基因的实验中发现, 正义和反义RNA都阻断了该基因的表达,这与传统上对反义RNA技术的解释相反。1998年2月卡耐基研究院的F i re 等将双链RNA ( double stranded RNA, ds RNA)转入细胞内,发现靶基因的mRNA发生了降解,证实高度纯化的ds RNA 可以高效特异的阻断相应的基因表达,而且效率比单链RNA至少高2个数量级,首次揭示了Guo等遇到的现象,即为RNAi。 随后研究发现, RNAi现象广泛存在于各种生物中,是一种古老的重要保护机制, RNAi技术作为一种重要的研究手段大大加速了基因组学的研究进程,现已成为基因功能研究和基因治疗研究的热点。 在短短几年中,对RNAi的研究取得了突飞猛进的发展, 许多令人振奋的报道相继出现, 2001年首次报道了在哺乳动物细胞培养中成功

应用RNAi技术抑制基因表达, 开创了RNAi技术应用于高等生物基因功能研究的先河; 2002年, K ay研究小组首次报道了应用RNAi 技术在哺乳动物整体水平进行基因表达沉默的实验研究;2004年哺乳动物全基因组范围RNAi研究也取得了重要进展,先后报道了用酶法构建全基因组siRNA文库新技术和应用基因组siRNA文库,从全基因组水平对高等动物基因功能进行高通量RNAi研究。这些研究成果愈来愈表明, 生物体基因转化的最终产物不仅仅是蛋白质,还包括相当一部分RNA。 2 RNAi的作用机制 细胞中ds RNA 的存在是RNAi形成的先决条件。ds RNA可以通过多种途径在细胞核或细胞质中产生。通过对RNAi所进行的遗传学和生物化学的研究,现已初步阐明了其作用机制。RNAi的作用机制可分为三个阶段:起始阶段、效应阶段和级联放大阶段。起始阶段:由RNA 病毒入侵,转座子转录,基因组中反向重复序列转录等所产生的ds RNA分子在细胞内被一双链RNA酶!型内切酶也叫Dicer酶或Dicer核酸酶同源物剪成21~ 23 nt siRNA, 3’ 端带有2个碱基突出的黏性末端, 5’ 为磷酸基团,此结构对于siRNA行使其功能非常关键。剪切位点一般在U处, 具特异性。效应阶段: RNAi特异性的核酸外切酶、核酸内切酶、解旋酶、辅助识别同源序列蛋白和其他一些蛋白与siRNA结合成RNA诱导沉默复合体R I SC ( RNA inducing silence complex , R I SC)识别靶mRNA,其中的反义

RNA干扰作用机制

RNA干扰机制主要分为两个阶段： 1：RNA干扰的启动阶段，即RNA核酸酶与双链RNA结合，并把它酶切成为多段大小为21~25个碱基对的小RNA片段（siRNA）。 2：RNA干扰的效应阶段，即siRNA与一种多聚核酸酶复合物，RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合，并通过驾驭RISC到相应的mRNA位点，随即RISC执行RNA干扰的效应功能，酶切降解mRNA，使转录的基因表达终止。 第一步：双链RNA加工成为siRNA 参与该反应的酶是Dicer蛋白复合物，具有结合和酶切双链RNA的活性，与双链RNA结合的区域位于Dicer的羧基末端 第二步：siRNA的扩增 siRNA能通过细胞内的RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）的作用，以RNA干扰起源的双链RNA分子，或者以目标mRNA分子作为模板，合成出新的双链RNA分子，再通过Dicer的加工作用，产生出大量的siRNA，补充细胞内消耗和降解的siRNA分子。这种现象称为siRNA的扩增。 第三步：降解目标mRNA 在这一阶段，从双链RNA切割下来的siRNA与一种RNA干扰的特异蛋白复合物结合，形成RNA诱导的基因沉默复合物（RISC）。该复合物在A TP存在的条件下被激活，siRNA解链，留下反义链导向RISC与目标RNA互补结合，并酶切目标RNA分子，完成RNA干扰的过程。酶切位置常常在siRNA双链的中间部位，故，若siRNA链中间的碱基与目标不符，则会影响siRNA的沉默效应。 siRNA与RISC复合形成一种小干扰核糖蛋白粒子（siRNP） RISC与Dicer的异同点 两者都具有RNA酶活性，但是它们的作用底物不同，前者常常针对单链RNA分子，而后者则是针对双链RNA分子；另一方面，它们的酶切方式和产物也不同，前者属于RNA 的外切酶，而后者则是RNA的内切酶 另外，一些RNA干扰效应阶段的mRNA降解物，反过来可以作为RdRP的模板，合成双链RNA分子，加入到RNA干扰的启动阶段，从而放大RNA干扰的作用。

百度百科RNA干扰

RNA干扰 科技名词定义 中文名称：RNA干扰 英文名称：RNA interference;RNAi 定义1：与靶基因同源的双链RNA诱导的特异转录后基因沉默现象。其作用机制是双链RNA 被特异的核酸酶降解，产生干扰小RNA(siRNA)，这些siRNA与同源的靶RNA互补结合，特异性酶降解靶RNA，从而抑制、下调基因表达。已经发展成为基因治疗、基因结构功能研究的快速而有效的方法。 所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；核酸与基因（二级学科） 定义2：引起基因沉默的一种技术，将根据基因序列制备的双链RNA注入体内，可引起该基因编码的mRNA降解，从而抑制了该基因的功能。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科） 定义3：双链RNA有效地阻断靶基因表达的现象。 所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科） 本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 百科名片 RNA干扰模式图 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA （double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 目录

简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 简介 发现 作用机制 特点 制备方法 应用 相关知识 展开 编辑本段简介 近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。 编辑本段发现 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 RNAi实验图片 中发现的，由dsRNA介导的同源RNA降解过程。1995年，Guo等发现注射正义RNA（sense RNA）和反义RNA均能 有效并特异性地抑制秀丽新小杆线虫par-1基因的表达，该结果不能使用反义RNA技术的理论做出合理解释。直到1998年，Fire等证实Guo等发现的正义RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的RNA中污染了微量dsRNA而引发，并将这一现象命名为RNAi。

RNA干扰

RNA干扰 RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由双链RNA(doublestrandedRNAs，dsRNAs)引发的植物RNA沉默，主要有转录水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录;PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。 RNAi是在研究秀丽新小杆线虫（C. elegans）反义RNA（antisense RNA）的过程 1.作用机制 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应， 其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA 结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi 的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。 RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。 怀特黑德生物医学研究所的本杰明·刘易斯等研究人员发现小RNA能通过阻断蛋白质合成的方式调控基因表达。他们借助一个计算模型来确定小RNA和对应的基因，发现了miRNA控制很大一部分生命功能的证据。 研究人员比较了人类和狗、鸡、鼠的基因组，对这几个物种共有的蛋白质合成基因与miRNA寻求对应关系。结果发现，尽管这几个物种在3.1亿年前就开始“分家”各自进化，但它们基因组中受miRNA调控的基因都占三分之一左右，而且这些基因在进化过程中都得以保存而未发生变化。刘易斯说，随着更多的基因组数据发布以及实验技术的进步，还可能发现更多的基因是由小RNA调控的。 RNA干扰现象的机理[8] RNA干扰作用是通过一类较稳定的中间介质实现的。对植物的研究证明，双链RNA 复合体先降解成为35nt左右的小RNA分子，然后他们通过序列互补与mRNA结合，从而导致mRNA降解[9][10]。对果蝇的研究证明，长度为21～23nt的小RNA分

RNA干扰iRNA技术及其应用

RNA干扰iRNA技术及其应用 摘要：RNA干扰(interference RNA，iRNA)是正常生物体内抑制特定基因表达的一种现象，它是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默。RNA具有特异性和有效性。iRNA技术作为功能基因组学强有力的研究工具，可以特异地使特定基因沉默，获得功能丧失或降低突变。随着对现代分子生物学研究的发展，该技术的应用领域逐步扩展到医学，农业，林业，渔业，畜牧等多个领域，具有巨大的科研，经济和社会价值，本文主要论述RNA干扰技术在医学领域方面的应用。 关键字：RNA干扰转录后基因沉默RNA 诱导的沉默复合物 正文：今年来，对RNA干扰技术的研究已经成为热点，预测未来10年间最后可能出重要成果的领域之一，并被《Science》评选为2002年度最重要科技突破的首位。RNA干扰技术之所以有如此重要的地位，与其运用到的领域有关。21世纪初，人类完成了基因组计划，破译人类全部的遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面认识自我。因此，很多疾病的病因也将揭开神秘的面纱，这位这些疾病的基因诊断和基因治疗奠定了基础。因此，利用RNA干扰技术抑制基因组的基因表达的技术手段，有可能在基因治疗方面开辟一条心的途径，克服医学上许多疑难杂症，例如，病毒性疾病，肿瘤心血管疾病和遗传性疾病。 1.RNA干扰的发现:首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditis elegans的研究。1995年，康乃尔大学的Su Guo博士在试图阻断秀丽新小杆线虫(C.elegans)的par-1基因时，发现了一个意想不到的现象。她们本想利用反义RNA技术特异性地阻断上述基因的表达，而同时在对照实验中给线虫注射正义RNA以期观察到基因表达的增强，但得到的结果是二者都同样地切断了par-1基因的表达途径。这是与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。该研究小组一直未能给这个意外以合理解释。这个奇怪的现象直到3年后才被解开。1998年2月，华盛顿卡耐基研究院的Andrew Fire和马萨诸塞大学癌症中心的Craig Mello才首次揭开这个悬疑之谜。通过大量艰苦的工作，他们证实，Su Guo博士遇到的正义RNA抑制基因表达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的阻断，都是由于体外转录所得RNA中污染了微量双链RNA而引起。当他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时发现，基因抑制效应变得十分微弱，而经过纯化的双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基因的表达。实际上每个细胞只要很少几个分子的双链RNA已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫中注入双链RNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因沉默，该小组将这一现象称为RNA干扰。现在RNA干扰现象广泛存在于从植物、真菌、线虫、昆虫、蛙类、鸟类、大鼠、小鼠、猴一直到人类的几乎所有的真核生物中细胞，这种情况揭示了iRNA现象很可能出现于生命进化的早期阶段。后来在果蝇细胞中的实验进一步揭

RNA干扰实验技术相关探讨

文章编号： 06-（2004）063002101-10 中图分类号：Q344 中国生命科学论坛分子生物学版精华 RNA干扰(RNAi)实验技术相关探讨 马志杰 (maziwise) 编写小瘪修改 (中国生命科学论坛分子生物学版第1版主 ) [责任编辑：TILS007] 摘要：RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA所引起的序列特异性基因沉默。它是真核生物中基因转录后沉默作用的重要机制之一。RNAi技术作为新兴的基因阻抑方法，在功能基因组学、微生物学、基因表达调控机理研究等领域得到了广泛应用。本文就其作用机制、基本实验程序及注意事项作了较详细的综述，对其存在的相关问题和前景亦做了展望。 关键词：RNAi；siRNA；转染 小RNA作用与应用研究继2001，2002连续两年被美国Science杂志评为年度10大突破技术以来，近年来继续热度高涨，名列前矛。其核心技术RNA干扰（RNAi），即用20多个核苷酸组成的短的双链RNA（siRNA）代替传统反义核酸进行转录后基因沉默，已经迅速而广泛地应用到基因功能，基因表达调控机制研究等热门领域，不仅如此，它还为基因治疗开辟了新的途径。此外，RNAi沉默机制的探索也取得了相当的进展。目前，在大致勾画出生物体内源性小RNA的重要作用框架后，进一步阐述其作用细节、探索小RNA对细胞行为的调控、如何利用RNAi进行疾病防治等等都成为生物学家研究的一大热点。 1、RNAi的作用机制

通过生化和遗传学研究表明，RNA干扰包括起始阶段和效应阶段(inititation and effector steps)。在起始阶段，加入的小分子RNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA 片段(small interfering RNAs， siRNAs)。证据表明;一个称为Dicer的酶，是RNase III家族 中特 图1、RNAi的作用机制 异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片段的3’端都有2个碱基突出。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段，这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化，从而使启动子失去功能，使其下游基因沉默。其基本原理见（图1）： 2、RNAi基本试验程序及注意事项 2.1、siRNA的设计 2.1.1、目标序列的筛选