天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建
西北农业学报 2006,15(6):170～173
A cta A g riculturae
B oreali2occi dentalis S inica
天山雪莲叶片全长cD NA文库的构建
祝建波1,3,刘海亮2,王 重1,周 鹏33
(1.石河子大学兵团绿洲生态农业重点实验室,新疆石河子 832003;2.石河子大学生命科学学院,新疆石河子 832003;
3.中国热带农业科学院热带作物生物技术国家重点实验室,海南海口 571101)
摘 要:以天山雪莲(S aussurea invol ucrata Kar.et K ir)幼嫩叶片为研究材料,利用Creator TM SMAR T TM cD2 NA Library Construction技术构建了天山雪莲叶片全长cDNA文库,原始文库滴度达3.93×105cf u/mL,文库插入片段多在1000bp左右。随机挑取10个克隆进行测序,通过生物信息学初步分析表明,100%为全长cDNA,大部分可以在GenBank中找到同源序列。天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建为雪莲基因资源保存和植物抗寒机理的研究奠定了基础。
关键词:天山雪莲;试管苗;全长cDNA文库
中图分类号:Q785 文献标识码:A 文章编号:100421389(2006)0620170204
Construction of Full2cD NA Library from the
Sa ussurea i nvol ucr at a K ar.et Kir Laminae
ZHU Jian2bo1,3,L IU Hai2liang2,WAN G Zhong2and ZHOU Peng33
(1.Key Laboratory of Oasis Ecology Agriculture of Xinjiang Bing tuan,Shihezi Xinjiang 832003,China;2.Biology College of Shihezi University,Xinjiang 832003,China;3.National Key Biotechnology Laboratory for Tropical Crops,CA TAS,Haikou 571101,China)
Abstract:A f ull2lengt h cDNA Library from t he S auss urea i nvol ucrat a Kar.et K ir laminae was con2 structed by using Creator TM SMAR T TM cDNA Library Const ruction Protocol.The titer of cDNA library was estimated as3.93×105cf u/mL,which was about500times coverage of gene expressional p rofile,and t he inserted fragment s in t he library are about1000bp lengt h.Ten clones were randomly selected to sequence and bioinformatics analysis was carried out,all of t he sequences were f ull2lengt h cDNA,and mo st of t he sequences were homologous to t he genes known in GenBank.This f ull2lengt h cDNA Library p rovides a important tool for t he st udy of t he cold resistence mechanisms of t he S aus2 s urea i nvol ucrat a Kar.et K ir.
K ey w ords:S aussurea i nvol ucrat a Kar.et K ir;Plantlet;Full2lengt h cDNA library
天山雪莲(S aussurea i nvol ucrat a Kar.et Kir.)是典型的耐极端低温的珍贵高等植物。在新疆天山,它主要生长于海拔2400～4100m 处,最高月平均温度3～5℃,最低月平均温度-19～-21℃。与一般抗寒植物不同,雪莲在极端低温下通过积极的生命活动来适应严寒,在雪中能旺盛生长并且开花[1,2]。这就是说,雪莲可能富积了特异的抗寒或耐寒基因,从而产生了适应极端低温环境条件的生存机制。本研究旨在利用所获得的天山雪莲试管苗,建立富含叶片全长cDNA的文库[3～5],为研究雪莲植物的抗寒机理及获得有效的抗寒基因奠定基础。
收稿日期:2006204206 修回日期:2006204220
基金项目:兵团科技攻关资助项目(N K B025DXN K01SW)。
作者简介:祝建波,男,副研究员,作物遗传育种博士生。E2mail:z2j2b@https://www.wendangku.net/doc/7c12891526.html,,通讯地址:新疆石河子大学生物技术中心,邮编:832003
3通讯作者。
1 材料与方法
1.1 材料
天山雪莲(S auss urea i nvol ucrat a Kar.et Kir)为本实验室无菌苗。试剂和菌种的文库构建试剂盒Creator TM SMAR T TM cDNA Library Const ruction Kit(Catlog#:K105321)是CLO2 TEC H公司产品。RNA提取试剂盒RNeasy Plant Mini K it(Cat.No.74904)购于Q IA GEN公司。
1.2 方法
1.2.1 材料处理 对天山雪莲无菌苗进行低温梯度处理,起始18℃培养,然后4℃处理1d,0℃处理2d。
1.2.2 天山雪莲叶片总RNA的提取 按照RNeasy Plant Mini K it中的方法提取天山雪莲叶片总RNA。
1.2.3 天山雪莲叶片cDNA的合成与纯化回收 按CLO TEC H公司Creator TM SMAR T TM cD2 NA Library Const ruction K it说明书上的操作。取2.0μL(约1.5μg)总RNA进行反转录合成cDNA第一链,反应体系10μL,反应结束取2μL 运用LD PCR扩增cDNA,共100μL,取5μL用1.1%TA E琼脂糖凝胶电泳检测。取50μL LD PCR产物,加入2μL蛋白酶K(20μg/μL),于45℃温育20min消化残存的Taq酶。纯化回收cDNA,用Sfi I于50℃酶切2h,产生粘性末端。酶切产物100μL与2μL二甲苯胺(xylene cya2 nol FF)过C HROMA SPIN2400柱,每管过柱收集物取3μL电泳检测,混合500bp以上的cD2 NA片段。剩下的45μL LD PCR产物贮于-80℃冻存备用。
1.2.4 cDNA文库的构建 T4DNA Ligase连接已经用Sfi I酶处理的cDNA和pDNR2L IB载体,连接产物电击转化D H10B感受态细菌。转化产物经含氯霉素的固体LB培养基扩增后,用LB和甘油,终浓度25%刮菌,-80℃冻存;留出5管1mL以备以后检测使用,部分平板4℃保存备用。
1.2.5 插入片段的检测 从文库中随机挑取10个斑,碱裂解法提取质粒,以M13正向和反向引物做PCR,检测插入片段的大小并估计文库的重组率。扩增条件:94℃30s1个循环,94℃30s, 68℃2min30循环,68℃延伸5min。1.2.6 序列测定 对于随机挑取的克隆经插入片段检测后,片段大于700bp的克隆送至公司测序。
1.2.7 序列分析 分别运用BL ASTn和BL ASTx,对已测定的序列在National Center for Biotechnology Information(NCBI)的核苷酸和蛋白质数据库中进行相似性分析。
2 结果与分析
2.1 天山雪莲冷诱导叶片总RNA的提取
经RNeasy Plant Mini K it提取总RNA,取出5μL在37℃水浴中温浴1h与未经处理的RNA一起在1.1%的普通琼脂糖凝胶中电泳检测,在提取的RNA中有清晰可见的28S和18S 两条rRNA条带,而且经温育处理后的RNA与未处理并无差异,说明组织总的RNA稳定性良好,达到建库要求
。
1:Total RNA treated in37℃for one hour
2:Total RNA unt reated
图1 总RNA琼脂糖凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of total
RNA
1:Maker V I,2:LD2PCR product
图2 LD2PCR产物琼脂糖凝胶电泳
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of LD2PCR product
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6期 祝建波等:天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建
2.2 cD NA 的合成与纯化回收
LD PCR 产物主要集中在0.5kb
～5kb 之
间,在接近1kb 附近有非常明亮清晰的带,因为植物的mRNA 相对较短,在这段区域内cDNA 是比较完整的。经C HROMA SPIN 2400柱过后,cDNA 片段主要就集中在第6到9管,从第10管
开始片段就小于500bp ,混合6到9管的过柱产物,约140μL ,最后得到7μL 的双链cDNA ,用作连接反应。2.3 天山雪莲叶片全长cD NA 文库的构建和鉴
定
取1μL 纯化回收的cDNA 用于连接反应,
反应体系5μL ,全部转化,总体积1.5mL ,37℃摇1h ,分别取2μL 、3μL 体积转化液涂布平板,剩下的转化液可用于总文库的保存和总文库质粒的提取。第2天对培养过夜的平板进行单菌落记数,分别为:503个和820个,由此可推算得到全长cDNA 文库的克隆数为:{[(503×750)+(820×500)]}/2=3.93×105。文库插入片段在0.5kb 到1.8kb 左右,文库重组率达90%(图4)
。
1215.cDNA fragment s after fractionation ;M1.Maker VI ;M2.DL2000Maker
图3 分级后cDNA 片段琼脂糖凝胶电泳
Fig.3 Agarose gel electrophoresis of cDNA segments after fractionation
表1 天山雪莲叶片全长cDNA 比对分析
T able 1 B last analysis of the full 2length from the full 2length cDNA library of S.invol ucrata K ar.et Kir 克隆(编号)
Clone 插入的cDNA 大小
Size of inserted cDNA (bp )
E 值E value Genebank 提交序列号Genebank accession No.
比对结果
Putative identification
SIK05070310445e 218DQ338537similar to SGT1protein ,a component of t he SCF ubiquitin ligase
SIK0523019857e 272
DQ338538RpiA ,Ribose 52phosphate isomerase SIK050701904DQ338539
unknown protein
SIK0505076593e 231unsubmit Auxin _repressed ,Dormancy/auxin associated protein
SIK050002864unsubmit
unknown protein
SIK0500037002e 214unsubmit Alpha Amylase Inhibitor ,Lipid Transfer and Seed Storage proteins SIK0500057403e 239unsubmit unknown protein
SIK0505066598e 214unsubmit water stress 2induced protein ,cold acclimation re 2sponsive protein
SIK0505105260.0unsubmit chloroplast inversion region
SIK050702
1061
1e 268
unsubmit
protein tyrosine phosphatase Dual specificity phosphatases (DSP );Ser/Thr and Tyr protein phosphatases
2.4 天山雪莲叶片全长cD NA 的序列测定与分
析
从文库中随机挑取10个克隆进行测序,测序结果显示,随机挑取的克隆均为全长cDNA ,而且也有与抗寒相关基因,这说明经冷诱构建的天山
雪莲幼嫩叶片的全长cDNA 文库是成功的,并且已向Genebank 登陆3个基因,登陆号分别为:DQ338537;DQ338538;DQ338539,与抗寒相关基因的功能验证正在进行。
?271?西 北 农 业 学 报 15卷
M1.Marker VI;1210.PCR product s of inserted fragment s;M2.DL2000Marker 图4 cDNA文库随机插入片段PCR检测
Fig.4 PCR analysis of randomly inserted fragments in cDNA library
3 讨论
3.1 通常,所提取总RNA的完整性直接影响构建的cDNA文库的好坏,本试验所提取的总的RNA经琼脂糖凝胶电泳显示28SrRNA和18srRNA条带清晰,且28SrRNA的亮度高于18srRNA的2倍多,表明所提取的RNA完整性较好。
3.2 真核生物表达mRNA约占生物基因的15%,其含量低于14拷贝/细胞的低丰度mRNA 种类约占30%,根据公式:N=In(1-P)/In(1-1/n)(N为所需的克隆数,P为保证系数,一般为0.99,1/n为所需克隆对应的mRNA占总mRNA 的比例),由此可知,要使低丰度的mRNA被筛选到的保证系数达到99%,需要的克隆数为2.07×105[7,8],而得到的克隆数为3.93×105,基本上能够保证从这个文库中筛选到低拷贝的基因。
3.3 从图3可以看到从第6管开始有大于500 bp的cDNA,这与操作手册上从第1管开始有不太相同之处[6],也许是由于植物mRNA大部分较小,没有哺乳动物的大的原因。这也与图2相吻合,LD2PCR产物在接近1000bp处有明亮带,说明1000bp左右的mRNA在天山雪莲中含量较为丰富。
3.4 由于当前基因数据库中对天山雪莲的序列记载几乎为零,这明显不利于对天山雪莲的分子生物学方面的研究,本试验构建的天山雪莲叶片全长cDNA文库,经10个克隆的随机测序,生物信息学分析,全长序列达100%,大部分序列可在Genebank中找到有一定同源性的序列,也有许多未知的,同时筛到了可能与天山雪莲抗寒特性有关的基因,基因功能正在验证之中。
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6期 祝建波等:天山雪莲叶片全长cDNA文库的构建
全长cDNA酶切和连接体系
用测序时所构建的各片段重组质粒作模板，用新合成的加有连接酶切位点的引物扩增出需要连接的各片段。LF1在扩增时，由于片段比较长，故分为两步进行扩增，第一步扩增后，连接到pMD-18T载体上，再用此作模板进行第二次扩增。得到所需的加有酶切位点和启动子序列的目的片段，再将其克隆到pMD-18T载体上。使用时每次从载体上切取目的片段进行连接。 F5、F6和F7片段的连接，F5(Not I/ Fsp I)、F6(Fsp I/Csp45 I)、F7(Csp45 I/Sal I)分别进行酶切，将载体pGEM5zf同时进行Not I/Sal I双酶切，分别将各酶切产物进行纯化回收。由于F5片段和载体pMD18-T大小相近，故无法回收酶切后的目的片段，所以F5片段直接采用 酶切buffer F5用buffer D、F6用buffer B、F7用buffer D F21和F22的连接，将F21和F22 PCR测序片段分别用Nhe I酶切后，回收目的条带，将二者用T4 DNA酶连接后，克隆到T-easy载体上。即为连接全长所用的F2片段。连接时，直接用设计时的两端酶切位点。 LF3和LF4同样用Acc III酶切后，用T4 DNA连接酶连接，再克隆到pMD-18T载体上，用于5’半长的连接。 F21、F22连接酶切体系： Nhe I 1μl；10×M buffer 2μl；DNA 17μl； F3、F4连接酶切体系： Acc III 1μl；10×F buffer 2μl；BSA 0.2μl；DNA 16.8μl。 37℃3h酶切。纯化回收时，注意各种限制性酶的灭活(65℃,10min)。 连接体系： T4 DNA连接酶buffer 2μl；T-easy(F2) or pMD-18T(F34) 2μl；回收DNA片段15μl；T4 DNA连接酶1μl。16℃6h，再4℃过夜。转化感受态JM109。
cDNA文库
cDNA文库 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的c DNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。 [编辑本段] cDNA文库 真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难. 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mR NA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多. 定义: (cDNA Library) 某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组,储存于某种受体菌中,该群体就称该生物基因组的cDNA文库. 原理 :将带poly(A)的mRNA经酶促反应转变为双链DNA,再与原核载体连接. 一,制备用于克隆cDNA的mRNA 1,mRNA的制备 动物细胞mRNA的制备 植物细胞mRNA的制备 2,mRNA的来源 选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等方法提高mRNA的含量 3,mRNA完整性的检测 1)mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(C ell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统". 无细胞提取物的制备: 用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.
构建全长cDNA文库
构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA 后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA 相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。 二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。 三、反转录后至包装到噬菌体外壳蛋白之前的诸多步骤的操作相对容易，但其中的层析柱cDNA分级很关键。这一步稍不注意会影响成功性或影响获得的cDNA的片段分布特点。这一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通过反复悬浮和试滴保证柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。获得的每一级的cDNA量很少，检测时带型很暗，所以要用新鲜做的透明薄胶检测，根据检测结果一定要舍弃太短的cDNA（一般400bp以下就不要了，因为短片段太多会严重影响后面的连接转化效果及文库质量）。 四、噬菌体文库或质粒文库均对载体与cDNA的连接效率要求很高，也对连接产物转染或转化大肠杆菌的效率要求很高。连接效率高低直接关系到文库构建是否成功，更要注意的是文库连接与一般的片段克隆的连接不一样。一般的片段克隆连接是固定长度的载体与固定长度的目的DNA连接，而文库连接是固定长度的载体与非固定长度的目的DNA连接，目的基因cDNA长的有10kb以上，短的只有500bp或更短。一系列长度不等的cDNA与载体在一起连接的结果，不同长度cDNA的连接效率就不一样。有的专家的经验是，根据分级结果，有意识地将长度不同的cDNA群分别与载体连接，再分别转化或转染大肠杆菌，分别完成滴度检测，最后将不同长度级别的文库混合在一起供杂交筛选。
cDNA文库构建原理以及技术路线
CDNA文库 1. CDNA文库中重组DNA片断得原始供体来源与细胞中表达出得mRNA,将某一特定类型细胞表达得mrna经反转录酶催化形成与之互补得CDNA，重组克隆后得到得CDNA文库有各自不同得适合范围。CDNA文库在研究具体某类特定细胞中基因组得表达状态以及表达基因得功能鉴定方面具有特殊得优势，从而使它在个体发育，细胞分化，细胞周期调控 2. CDNA文库得质量 （1）文库的代表性 CDNA文库的代表性是指文库中包含得重组CDNA分子是否能完整地反映出来原细胞中表达地全部信息（即mrna种类），它是体现文库质量地最重要标本。文库地库容量，它是指构建建出地原始CDNA文库中包含地独立地重组子克隆数。具备完全好代表性地CDNA文库需要满足地库容量取决与来源细胞中表达出地基因序列地总复杂程度。具体来就是来源细胞中表达出地mrna种类和每种MRNA序列地拷贝数 N=ln(1-p)/ln(1-n/t)，P为文库中包含细胞中任何一种mrna序列信息地概率，通常设为99％，N为文库中P概率出现细胞中任何一种mrna序列理论上应具有地最少重组克隆数，n为细胞中最稀少地mrna序列地拷贝数，t为细胞中表达出地所有mrna地总拷贝数，以人类细胞为列，人类基因组携带地遗传基因总数约为100000种，具体到某一特定类型地细胞中，表达出地基因种类仅为基因组全部基因地15％。因此对于巨大部分地人类细胞，每个细胞内具体表达地mrna种类约为15000种，全体mrna序列地总拷贝约为500000个，而细胞中稀少地mrna种类地拷贝数平均为8个。因此，用人类细胞来构建CDNA文库时候，要以99％概率保证文库中包含有细胞表达地任何一种mrna地序列信息，构建出地原始CDNA文库理论上应具有地最少独立克隆数为 N=ln(1_99%)/ln(1-8/500000)=2.9*10(5) 一个具有完好代表性地CDNA文库至少具有10（6）以上的库容量 3．MRNA是由5‘端非编码区，中间地编码序列和3’端非翻译区。非翻译区地序列特征对基因地表达具有重要地调控作用，其中编码产生地蛋白质产物都具有在结构上相对独立地结构域，存在与同一分子上地结构域对体现出蛋白产物在细胞中所行使地生物学功能。因此要从CDNA文库中分离获得目的基因完整地序列信息和功能信息，要求文库中地重组CDNA片断应尽可能完整获得目的基因结构 4．构建文库的载体系统 （1）入噬菌体载体系统是在CDNA文库构建中最早使用地载体系统，在载体本身地设计方面已经相当成熟，其主要优点是插入片断地装载容量大，适合与全长CDNA地克隆。重组子经专门地体外包装系统包装成有感染力地噬菌体颗粒，对宿主大肠杆菌地转染效率高，通常1ugCNDA构建出地CDNA文库，转染宿主菌后，都可以得到10（6）－10（7）以上地原始库容量，同时对重组克隆是否含有CDNA文库地插入片断地实际情况，有较好地质量控制指标，因此用这类载体地系统构建地CDNA文库质量高，代表性好，此外这类载体系统构建出地CDNA文库以重组噬菌体颗粒形式存在，这些重组噬菌体颗粒地感染活性在4度环境比较稳定，非常适合长期保存，但是可以采用地文库筛选方法很有限，文库中地CDNA 片断在宿主细胞无法功能性表达。 （2）质粒载体系统 可以功能性筛选：利用基因在体内体现其生物学活性所依据地生化基础，从文库中分离鉴定
简述cDNA文库构建的方法
简述cDNＡ文库构建的方法 1．１ mＲNA纯化 构建一个cＤNＡ文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mＲＮA。ｍRNA仅占细胞总RNＡ的1%～5％,因而需要另外的纯化技术来富集ｍＲNA。从细胞总RＮA中分离mRＮＡ是根据实际上所有真核细胞mＲNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为ｐolｙ(A)尾巴，是mRNＡ分子特有的而其他主要RNA 没有，pｏly(Ａ)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸(oligo(ｄT)）杂交。正是这种特性使得mRＮA从ＲNＡ分子的混合物中分离出来。 方法有三种： ·寡脱氧胸苷酸亲和层析:即分离mRＮA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~１8碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总ＲNA混合物上样后,mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非pｏlｙ(A)ＲNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交:本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱,而是将基质直接加到总ＲNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有ＲＮA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠:本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总ＲNA退火,然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠,用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液,并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下,寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 １.2ｃＤＮA的合成与克隆 1.2.1 cＤNA第一条链的合成 所有合成cＤNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是ｍＲNA模板,另一个反转录酶。 目前商业化的反转录酶主要有两种:一种是禽源反转录酶（reｖeｒse tranｓcripｔａse)，另一种是鼠源反转录酶。两种酶都无3’-5’外切酶活性，但禽源反转录酶有很强的RNAase H酶活性,鼠源的具有相对较弱的RNＡａｓeH酶活性。RＮAasｅ H酶活性在反应中起负作用,可降解mRＮA分子末端的polｙ(Ａ)序列和cDNA-ＲNA杂交分子中的RＮA。因此一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。ＧIBCO-BＲL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERＳCRIPT反转录酶,缺少C-末端18０个氨基酸,完全去除了其 ＲNAａｓe H酶活性，保持完整的DＮＡ聚合酶活性。 1.2．２ cDNA第二条链的合成 合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”,即将第一条链合成过种中形成的cDNA/ＲNＡ杂交分子变性,降解RNA，则单链cＤＮA分子的3’末端自身环化,形成发卡结构。以此为引物,在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链ｃDNA，在其相当于ｍRＮA５’端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该环,得到可供克隆的双链cDＮA分子。由于SI酶的消化反应难以控制，不可避免地导致对应于mＲNＡ5’的序列出现缺失和重排,并造成克隆效率偏低,故该法基本上己被一些改进的方法所代替。主要的改进之处是在合成第一条链的反应体系中加入4ｍmol/L的焦磷酸钠,以抑制发卡结构的形成,这样便避免了使用SI 核酸酶。然后再用其他方法合成第二条链的引物。 1.2．3 cDNA的克隆 dscDNA（双链cDNA)合成后，将此ＤＮA与载体(质粒或噬菌体)组成重组分子,然后转化到受体菌中进行扩增。cDNA文库可用质粒载体或噬菌体载体构建。质粒文库
cDNA文库的筛选
CDNA文库筛选 2007-12-23 01:15:00| 分类：分子生物学方法| 标签：|字号大中小订阅 （一）λgt11 cDNA文库铺平板 宿主细菌制备 1．用一个E.coli宿主菌株单菌落分别接种2×5ml LB培养基（Y1088用于噬菌斑杂交，Y1090用于免疫筛选），于37℃振荡培养过夜。 2．将过夜培养物以3000×g离心5min。 3．分别用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4; 高压灭菌）重 悬细胞沉淀。 4．细胞悬液可用于4℃贮存至一周。 预制噬菌体悬液铺平板 以已知滴度（如，已知每ml噬菌体颗粒数）的cDNA文库或其他噬菌体悬液开始，用λ－dil稀释以达到所需每平板噬菌体数。每个90mm直径平皿5×103个噬菌体/100μl 开始筛选。 铺平板 1．将所需数量的LB平板置42℃温箱预热。 2．LB顶层琼脂（每平板最少2.5ml）用微波炉熔化，然后置49℃水浴中。 3．为温箱内的每一个平板准备一个12ml带螺旋盖试管，于室温，放在合适的架 子上。 4．用移液器每管加100μlλ－dil稀释的宿主细胞悬液。 5．每管加100μl稀释的噬菌体悬液与细菌于漩涡器上简短混合。 6．含细菌和噬菌体（感染混合物）的试管于37℃温育25min，然后室温放置。 7．用一支消毒的10ml 玻璃移液管在本生灯火焰上稍稍预热，取2.5ml保存在49℃的熔化顶层琼脂加到 一支含感染混合物的试管内。 8．立即在手掌之间滚动混合管内混合物，然后均匀地倒入一个预热的LB平板上。 9．倒好的平板于室温置水平面上直至顶层琼脂凝固（至少5min）。 10．重复步骤7至9，直至所有的细菌和噬菌体混合物都铺平板。 11．平板置42℃温箱（对λgt11）直至噬菌斑长出。
全长cDNA文库的构建—SMART技术
【共享】全长cDNA文库的构建—SMART技术 全长cDNA文库的构建—SMART技术 真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA 的末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。 常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。 SMART技术的出现是一个新的里程碑。这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA 单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5'帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。 这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA 库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。 我们在这里分别介绍几个采用SMART技术的产品： 一、SMART PCR cDNA Synthesis Kit 这个试剂盒是采用SMART技术将少至25ng的mRNA或者50ng的Total
全长CDNA克隆方法
全长CDNA克隆方法 以MITF基因为例,简述全长CDNA克隆的方法. 方法分三步: 1.克隆中间片段 2.克隆3’片段 3. 克隆5’片段,然后再将3者重复序列删除,拼接起来. 1.中间序列克隆 提取锦鲤的皮肤组织的mRNA,然后跑胶检测。如果有2根带,则显示mRNA 提取成功. 然后反转录成CDNA，检测B-actin。 首先在NCBI上查找mitf基因,获取该基因的序列,CDS区,基因编号.并且保存,以备以后比对序列用.选取斑马鱼的mitf a 为模板. 引物合成:用Primer 5设计 a.引物长度:长度一般在18-30个碱基。一般都是18-24个左右。 b.GC含量：一般引物GC含量为40%-60%，一对引物的GC含量和TM值要协调。 如果引物存在严重的GC或者AT倾向，可以在引物最后加适当A.T.C.G尾巴c.退火温度：退火温度需要比解链温度低5度。适当提高引物退火温度可以使 PCR的特异性增加。一般设计一对引物的TM值应该要比较接近，一般在0-4度以内，不会影响PCR的产率。温度在55-75度之间。 d.避免扩增模板的二级结构区域，一对引物之间不应该存在4个连续碱基的同 源性或者互补性。选取时尽量选取分高的组合。 设计引物时，尽量增加克隆的中间片段长度，为避免5‘和3’克隆出现长片段。 引物设计好以后，根据引物的TM值，首先设计温度，做梯度PCR. 比如TM为65度，设计梯度时可以设计63,64,65,66. 4个梯度。然后根据跑胶结果确定大体系的TM值，如有目的带，直接胶回收。然后进行链接，转化。送公司测序。 测序结果出来后，用Chmas软件打开，并将其转化为TXT格式的碱基序列。 用Jellyfish里面，找特异性的正向，反向引物。找完正向后，将序列反过来再找反向引物。只有都能找到2个引物的序列才能算测序成功。将特异性引物两端的序列全部删除，（那是对应载体的序列）。保存克隆的中间序列，然后跟斑马鱼的序列对比，一般重复性在90%以上。若有几组序列满足要求，用着几组进行对比突变的地方按照重复多的碱基最为标准。尽量选2组以上序列。 2. 3‘克隆 克隆3‘的时候要重新用mRNA做反转录，在做反转录的时候要加上3‘接头。（接头由自己合成）。 设计引物：正向的外侧引物和内侧引物 反向的UPM和NUP 一般设计特异性引物的TM值为接近60度，最后60度以上。 首先用外侧引物和UPM做10ul体系的下体系。然后用其PCR产物模板稀释10-40倍。用作内侧引物+NUP的PCR反应模板。做大系统检测最适合TM值。找到以后直接进行胶回收，链接转化，测序。 第一轮的TM值需要摸索，第一轮以后通常是弥散的条带。如果多次尝试还是不
cDNA文库的构建方法与原理
c D N A文库的构建方法与原理 蛋白质是细胞的功能分子：它们构成结构和调控分子，动力和泵蛋白，酶和受体。然而，如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列，或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。如果只限于将基因组DNA作为材料来源，由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质，那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。如果分析仅局限在编码序列，那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板，所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。不幸的是，现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。因此，产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA，由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。 1．基本原理 cDNA（Complementary DNA）是以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的顺序可代表mRNA序列。cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组，然后去转化克隆载体DNA 的宿主细胞，从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。其过程可概括为：（1）通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA；（2）cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。 cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途： 首先，cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用，因为它们的增殖并不经过DNA中间体，研究这样的生物有机体，cDNA克隆是唯一可行的方法。 第二，cDNA基因文库的筛选简单易行，恰当选择mRNA的来源，使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的克隆达到很高的比例，简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。 第三，每一个cDNA克隆都含有一种mRNA序列，在选择中出现假阳性几率比较低，从阳性杂交信号选择出来的阳性克隆一般含有目的基因序列。 第四，cDNA克隆的另一用途是用于基因序列的测定，读码框（ORF）的界定，只有通过对mRNA5’核苷酸序列才能获得。 2．基本方法 2．1 mRNA纯化 构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞类型表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞mRNA 3’端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。方法有三种： ·寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 ·溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。 ·生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 2.2 cDNA的合成与克隆
全长cDNA主要构建方法的比较
全长cDNA主要构建方法的比较 摘要全长cDNA文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径,克服了传统cDNA 文库的缺点,本文主要介绍了两种较为实用的方法，分别是SMART法和Cap trapper法。 关键词：全长cDNA构建SMART法Cap trapper法 随着测序技术和计算机科学的不断发展，大部分生物和人类的基因组全序列测定高速完成。cDNA作为基因克隆的一种重要工具，在帮助人们更好的发现新基因和研究基因功能上发挥了巨大的作用。但是，由于传统的cDNA由于反转录能力差，cDNA酶切位点保护不彻底和非cDNA片段插入导致克隆片段短、无效克隆多和全长率低等缺点,因而无法满足大规模、高通量、高效的功能基因组研究需要。而全长cDNA序列大多数拥有5’和3’端非编码区序列,因而弥补了传统cDNA文库构建方法的缺陷,成为目前基因克隆的一种重要方法。 目前主要有CAPture法，Oligo capping法，SMART法，Cap jumping法以及Cap trapper 法。本文主要介绍优点突出的两个方法，SMART法和Cap trapper法。
SMART 方法 SMART 方法是Chenchik 等1996 年提出的[3]，该方法利用PowerscriptTMRT 反转录酶的反转录、末端转移活性和内切酶sfiⅠ的特性，快速、简单地构建全长cDNA 文库。PowerscriptTMRT 反转录酶是M-MLVR点突变而来的，丧失了RnaseH 的活性，但保留着野生型聚合酶转移酶的活性，能够长距离的反转录，又可识别mR-NA5’帽子结构。原始一链合成中，转移酶的活性低，延伸效率低。用于反转录的5’端poly(A)引物和延伸模板分别含有sfiI（A）、sfiI（B）识别位点的寡聚核苷酸序列。而截短的一链cDNA，反转录酶没有识别到mRNA5’帽子结构，一链cDNA3/ 端不能被延伸、合成和扩增二链。两端含有sfiI 识别位点的全长cDNA，经两种类型（A、B）内切酶sfiI 酶切，使两端产生不同的粘性末端，而全长cDNA 内部由于sfiI 识别位点在基因组中很少见而得以保护，这样就实现了目的全长基因的高效定向克隆。与其他方法相比，此方法有其独特的优点（1）所需起始材料少，一般0.5~1μg mRNA（2）mRNA 在合成cDNA 前无需任何酶反应或化学反应处理，不会导致处理过程中mRNA 的降解和损耗。（3）实验过程快速、简单，整个过程没有对mRNA 和中间产物的复杂处理。（4）全长比例较高[13]。SMART 方法也有其自身明显的缺点（：1）PCR 扩增具有选择性，不利于长片段序列的扩增，使一些长片段的全长基因丢失，不易得到大于3kb 片段和低峰度 全长基因[13]2）dG 加尾效率低，导致文库中基因信息丢失，文库缺乏代表性。在实际应用中，该方法快速、简单的优点使之广受青睐[14~17]，尤其是在医学领域中应用较广[18~20]。 4 CAP- trapper 方法
构建cDNA文库应注意的事项
构建全长cDNA文库时应当注意事项 构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二者大同小异。但都应当注意以下四个方面： 一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。 构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录，则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。 二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。 这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手工方法构建中对文库的滴度影响不大，但对文库的全长性则有很大影响。Invitrogen公司基于去磷酸化、去帽、RNA接头连接后再反转录的新技术（可参考其GeneRacer说明书）从原理上是保证最终获得全长cDNA的最好方法，但对mRNA的完整性要求非常高，理论上讲必须是带有帽子结构和Poly A结构的全长mRNA且反转录完全，才能进入文库中。反转录完成后点样检测cDNA的浓度及分子量分布是很重要的。
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。 经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。（2）cDNA第一条链的合成。（3）cDNA第二条链的合成。（4）双链cDNA的修饰。（5）双链cDNA的分子克隆。（6）cDNA文库的扩增。（7）cDNA文库鉴定评价。 一、Superscipt II—RT合成第一链 1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul) (5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water （大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。 3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。 4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂： （1）4 ul 5×first strand buffer （2）2 ul 0.1 M DTT （3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制) 5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。 6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。 7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。 二、cDNA第二链的合成
cDNA文库构建简易流程
1、紫茎泽兰第一链cDNA的合成 取2 u1提取的紫茎泽兰mRNA，加入适量的CDSIII primer和SMART IV Oligo寡 核苷酸以及其它相应试剂，在适当的条件下，经反转录酶进行反转录合成紫茎泽兰第一链cDNA. 2、LD-PCR合成紫茎泽兰第二链cDNA 取合成的紫茎泽兰第一链cDNA加入其它试剂，通过LD-PCR进行双链cDNA的合成3、紫茎泽兰双链cDNA的酶切及分离纯化 双链cDNA经蛋白酶K消化去除DNA聚合酶活性，经氯仿:异戊醇抽提，酒精沉淀后，用限制性内切酶sfi I进行酶切消化。酶切后，过CHROMA SPIN-400柱进行分级分离纯化，以去除小的片段和杂质，依次收集16管，经1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，收集cDNA 含量最高的几管。 4、双链cDNA片段的克隆和体外包装 分级分离纯化的双链cDNA，定向克隆到试剂盒提供的经sfi I酶切的去磷酸化的入λTripIEx2载体上，在载体量不变的前提下，设定了3个连接梯度反应，连接结束后，3个连接产物分别用Promega公司的Packagene Lambda DNA受Packaging System包装，体外包装条件按试剂盒说明进行。 5、文库的滴定与重组率检测 用常规方法检查文库的滴度。3个连接反应包装后，分别取1ul用1X Lambda dilution buffer按1:10稀释，稀释后的入噬菌体裂解物再分别取0. 5ul 加入到150ul预先过夜培养的XL1-BLue菌液，在37 C进行20min的吸附后，再加入到1. 5m1熔化的LB/MgSO4顶层软琼脂，迅速混匀倒到预热至37℃的平板上，快速摇动平板使顶层软琼脂分布均匀，顶层软琼脂凝固后在37℃培养箱中倒置培养，每相隔一段时间后，检查噬菌斑生长情况。根据长成的噬菌斑的数目进行文库的滴度计算，公式如下 : 文库的重组率则利用蓝白斑互选进行，在每1. 5m1的顶层琼脂加入50ul X-gal (20mg/ml) , 50ul IPTG (200mg/Ml)，待噬菌斑长成后，统计蓝白斑的数量，算出重组率。 6、cDNA的PCR快速鉴定 从平皿中直接挑取噬菌斑，用5' PCR primer和3' PCR primer分别进行PCR扩增检查插入片段的长度。 初步结果：按l : 10的比例稀释后滴定，过夜后统计噬菌斑数目并计算滴度。1号和2号连接反应的噬菌斑很少，滴度很低，而3号连接反应的滴度为2.47X106pfu/ml, 滴度很高，符合建库标准。所以3号连接反应的cDNA与载体的比例最理想，连接效率最高。 紫茎泽兰cDNA的PCR快速鉴定，随机挑取10个透明噬菌斑，PCR扩增均有大于500bp的插入片段，进一步说明已成功获得了紫茎泽兰cDNA重组噬菌体。
全长cDNA在功能基因组学中的意义
全长cDNA在功能基因组学中的意义 cDNA（complementary DNA）是指从mRNA反转录而得到的DNA，是mRNA的一个可靠的拷贝。由于cDNA已经经过了剪接，而且含有完整的CDS，因此cDNA是研究基因功能以及基因结构的重要资源。采用一般的方法构建的cDNA文库，其全长的比例往往比较低，主要是因为在cDNA第一链的生成过程中，反转录酶在还没有生成完整的第一链的情况下就脱离了反应，以致得到不完整的cDNA。CDNA第一链的生成一般使用polyT作引物，因此，一般cDNA文库中，含有大量的3’端EST，而mRNA5’端的信息较少。但在功能基因组的研究中，5’端序列更有意义。因此，构建富含全长的cDNA克隆的文库显得更加重要。 1富含全长cDNA的文库的构建 （sequence 全长cDNA就是含有完整的3’和5’端的cDNA，mRNA的3’端具有polyA作为“标签序列” tag）用于辩别mRNA或cDNA是否含有完整的3’端。在生成第一链cDNA的过程中一般采用polyT 作引物，所以，得到的cDNA克隆一般都含有完整的3’端。mRNA的5’端与3’端不同，它没有高度保守的序列可用作“标签序列”来通过DNA/DNA或DNA/RNA杂交进行5’端鉴定，只有帽子结构（CAP）。因此为了分离到全长cDNA克隆，研究者一般利用“帽子结构”在mRNA的5’端加上一段序列或者其他标记物。 1．1．1 常规方法 这里说的常规方法，也就是够建一般的cDNA文库所采用的方法。分离出mRNA后，以mRNA为模板、带接头的polyT作引物合成第一链cDNA，再以用第一链作模板合成双链cDNA，加上5’端接头，便可连到载体上。 1．1．2 Oligo—CAP的方法 Oligo—CAP的方法是在mRNA的5’端加上一段寡核苷酸取代5’CAP。具体过程如图1所示。其原理是在BAP（bacterial alkaline phosphatase）和TAP（tobacco acid pyrophosphatase）的作用下，完整的mRNA（含CAP）的5’端的G被切除，剩下一个一个磷酸基团，可以在RNA连接酶的作用下与Oligo adapter连接；而不含CAP的mRNA的5’端则是一个羟基，无法与Oligo adapter连接。这样，mRNA的5’端也有了可识别的“标签序列”。 1．1．3 CAP—Select的方法 如图2所示，在生成cDNA第一链时，引物中带锚定序列，同时加入MnCl2。在MnCl2存在时，反转录酶会在有CAP的mRNA为模板的第一链cDNA的3’端加上三至四个dCMP，然后在末端转移酶的作用下加上三到四个dAMP，在3’端形成一粘端。这样，在RNA连接酶的作用下加上3’接头。这样，在5’和3’端都有特异的序列用于PCR扩增及全长cDNA的筛选。 1．1．4 CAP—Traper select的方法
CDNA文库构建的注意
构建全长cDNA文库分为噬菌体文库和质粒文库，二 者大同小异。无论怎样，应当注意如下几个方面：一、保证获得数量足够的高质量的起始RNA。构建cDNA文库要求的RNA量比做RACE和Northern blot 的要多，在材料允许的情况下一般的试剂盒均推荐采用纯化总mRNA后进行反转录，这比直接采用总RNA 进行反转录而构建的cDNA文库好，虽然后者也并不 是不能做。老版本CLONTECH的SMART 4的中级柱子 要求纯化后的总mRNA量最好在0.05-0.5微克左右，这就要求起始总RNA量较多。虽然有的试剂盒声称少至几十个纳克的总RNA也可以构建cDNA文库，但这 是针对材料极为稀缺者而言，但起始RNA太少还是会或多或少影响文库构建成功的风险和文库的代表性。至于RNA的质量，如果采用纯化总mRNA后反转录， 则对总RNA的杂质方面要求稍松，但对RNA的完整性则一丝不苟，要求未降解。如果直接采用总RNA进行反转录，则对总RNA的质量要求非常高，不仅要求RNA相当完整而无降解，而且要求多酚、多糖、蛋白、盐、异硫氰酸胍等杂质少，最好是试剂盒抽提的。二、反转录成功与否及反转录效率是关键中的关键。这是构建cDNA文库中最贵的一步，也是核酸质变的 一步，它将易降解的RNA变成了不易降解的cDNA。 反转录不成功，说明一次文库方案的夭折。反转录效率不高表现在一是部分mRNA被反转录了，但还有相 当一部分本该反转录的mRNA未被反转；二是只有少 部分mRNA被反转录通了即达到帽子结构最近处，而 很大一部分mRNA没有反转录完全，总的全长cDNA太少，这就难以构建好的全长cDNA文库。少量程度的mRNA降解或反转录不完全在SMART 4等试剂盒及手
关于cDNA文库
1 cDNA 文库的构建 1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法 cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA 文库，获得高质量的mRNA 是至关重要的，所以处理mRNA 样品时必须仔细小心。由于RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA 很重要。在获得高质量的mRNA 后，用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成cDNA 第1链，cDNA 第2链的合成(用RNA 酶H 和大肠杆菌DNA 聚合酶I，同时包括使用T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA 连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链DNA 克隆到载体中去、分析cDNA 插入片断，扩增cDNA 文库、对建立的cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ 噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。 1.2 cDNA 全长文库 经典cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNA。为了克隆到真正的cDNA 全长，建立富含全长的cDNA 文库具有重要意义。为此，必须克服仅用mRNA 的PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的mRNA 分子经反转录而得到的DNA 分子群体，是mRNA 分子群的一个完整的拷贝。全长cDNA 文库不仅能提供完整的mRNA 信息，而且可以通过基因序列比对得到mRNA 剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。目前所报道的对全长文库的构建一般按照美国CLONTECH 公司的SMART cDNA Library Construction Kit 方法或GeneRacer 试剂盒(Invitrogen，USA) 使用说明进行。判断一个cDNA 文库中的cDNA 序列是否是全长基因的cDNA，主要方法有以下几种。 1.2.1 直接从序列上评价