Mg_2_和氨基酸对重组大肠杆菌_省略_E3_生长及羧肽酶原B表达的影响_张文超

【实验技术】

M g2+和氨基酸对重组大肠杆菌BL21(DE3)生长及羧肽酶原B表达的影响张文超陈长华李素霞张晓彦

【摘要】目的研究M g2+和氨基酸对重组菌株生长及表达pCPB的影响。方法通过摇瓶和发酵罐培养,观察不同M g2+浓度和氨基酸对重组菌的生长和羧肽酶原B表达的影响。结果添加1g/L M g2+能提高质粒的稳定性;添加氨基酸能使羧肽酶原B表达量由1817g/L提高到24g/L。结论添加适量的M g2+和氨基酸能促进重组菌的生长和提高目的蛋白的表达量。

【关键词】羧肽酶原B;重组大肠杆菌;发酵;表达

Infl uence ofM agnesi u m Ion and Am i no A ci d on Gro w th of R eco mb i nant E.coli BL21(DE3)and Expressi on of Procarboxypepti dase B

ZHANG W en-chao,C H E N Chang-hua,LI Su-x ia,e t al(The State K ey Labor a t o ry of B ioreact o r Eng i n eeri n g,East China University o f Science and Techno l o gy,Shanghai200237,China)

【Ab stract】O b jective T o study t he infl uence o f m agnesi u m i on and a m ino ac i d on t he grow t h o f recombinant E.co li BL21 (DE3)and the expression o f p rocarboxypeptida se B.M eth ods Cu lture reco m bi nant E.co li BL21(DE3)i n spinner and fer m ent o r re-spec tively,add m agnesi u m ion and a m i no acids t o the m ed i u m and observe the g row th o f reco m bi nant E.co li BL12(DE3)and t he ex-pression o f procarboxypep tidase B.R esu lts The stab ilit y o f plas m i d wa s i mproved by adding m agnesi u m i on to a fina l concentra tion of 1g/L.A fter a m ino acidsw e re added,the expression leve ls of procarboxypeptidase B i ncreased fro m1817g/L t o24g/L.Conc l u si on The addition o f a suit able a m oun t o f magne siu m ion and a m ino acid i m p roved the g row th of recomb i nan t E.co li BL21(DE3)and ex-pression o f p rocarboxypeptida se B.

【K ey w ord s】P roca rboxypepti dase B;R eco m bi nant E.co li;Fe r m en t a tion;Expre ssi on

羧肽酶B(CPB)是一种金属酶,它能从蛋白质或肽段的C-末端选择性水解精氨酸和赖氨酸[1]。目前,商品CPB是从猪胰脏中分离纯化得到,产量少,价格昂贵。利用重组大肠杆菌生产羧肽酶B,可以大大降低生产成本,有很高的实用价值。

M g2+是许多酶的重要辅助因子,能作为催化活性的激活剂。限制镁的含量会导致在最适条件下的许多代谢途径的变化。镁离子浓度不足还会降低ATF(A ctiva ting transcription facto r)酶的活性,影响氧化磷酸化控制点DNA的合成和脂肪酸的代谢[2]。

氨基酸是表达蛋白的基本原料,来源于培养基中的酵母粉和蛋白胨。由于所用培养基氨基酸成分和所表达蛋白的氨基酸组成有一定差别,在合成目标蛋白的过程中,菌体会将一部分含量充分的氨基酸合成自身需要而含量不足的氨基酸,添加这些氨基酸就可能增加蛋白的表达。

作者单位:华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室(上海200237).

通讯作者:陈长华,E-m ai:l CCH0911@citi https://www.wendangku.net/doc/7014078685.html,

材料与方法

11菌种

重组大肠杆菌BL21(DE3)/Zn-pCPB,中国科学院生物工程中心构建。

21培养基

211摇瓶种子培养基:蛋白胨10g/L,酵母膏10g/L,Na C l10g/L,用前加入100L g/m l氨苄青霉素。

212发酵基础培养基:蛋白胨10g/L,酵母膏10g/L,NaC l5g/L,N a2HPO4#2H2O5g/L,KH2P O4 315g/L,K2HPO45g/L,葡萄糖10g/L,接种前加入100L g/m l氨苄青霉素。

213补料培养基:蛋白胨100g/L,酵母膏100g/L,葡萄糖600g/L,浓氨水调节发酵液p H值。

214金属离子M g2+使用M gSO4溶液;诱导剂I PTG溶液加入量按发酵液体积为01005m o l/L。

31培养方法

311菌种活化:取甘油冻存菌种015m,l接种于50m l摇瓶培养基中,37e、250r/m in培养5h后,琼脂平板划线分离,从平皿中挑选6个单菌落,接种于

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81

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中国生物制品学杂志2006年1月第19卷第1期C hin J B i ologicals J anuary2006,V o1.19N o.1 DOI：10.13200/j.cjb.2006.01.86.zhangwch.024

100m l LB培养基中,37e、250r/m i n培养12h。

312发酵罐培养:在15L全自动发酵罐中进行,发酵24h。接种量2%,加入氨苄青霉素,37e 培养约10~12h至工程菌进入对数生长期中后期时,加入I PTG,同时开始流加补料培养基。控制pH 为710?012,通过调节通气量、搅拌转速、补料速率,控制溶氧在30%以上,每隔1h取样。

41包涵体分离

发酵液经8000r/m i n离心得湿菌体,悬浮在TE中,均质后以10000r/m in离心,用TE洗涤1次,再离心得包涵体沉淀。

51菌体活性和质粒稳定性的检测

诱导开始时及诱导后每隔2h取样,样品经稀释适当倍数后,分别取100L l于备好的含100L g/m l氨苄青霉素和不含氨苄青霉素的LB琼脂平板上,均匀涂布后,置于37e培养箱培养12h,取出计数每个平板上的单菌落(同一条件下3次,取平均值),含氨苄青霉素的平板菌落数与不含氨苄青霉素的平板上菌落数之比为存活率。

61胞内重组蛋白相对含量的检测

取015m l发酵液,冷冻离心,菌体沉淀用超声波破碎,离心后,加入015m l TE缓冲液溶解,取100L l加100L l上样缓冲液混合上样。SDS-PAGE 检测目标蛋白。

结果

11M g2+对菌体活性和质粒稳定性的影响

111摇瓶试验:在摇瓶发酵24h后,不添加M g2+的空白对照组质粒丢失达1514%,加入M g2+后,质粒丢失2%左右,M gSO4浓度为1g/L时菌体活性最高,随着浓度的升高,菌体活性受到抑制,见表1。

112发酵罐试验:在培养基和补料条件相同的情况下,分别进行在发酵基础培养基中添加和不添加M g2+的实验,其生长曲线见图1。

加入M g2+后,能明显促进菌体在罐上的生长和提高重组蛋白的表达,发酵18h,添加M g2+的一组得到羧肽酶原B包涵体1714g/L,不添加M g2+一组得到羧肽酶原B包涵体9g/L。最终菌密度(A600)由52提高到83,添加M g2+后得到羧肽酶原B包涵体18g/L,不加M g2+菌体自溶严重,几乎得不到包涵体。在缺少M g2+离子的情况下,罐培养到20h 蛋白降解,见图2。

21氨基酸添加对菌体生长和蛋白表达的影响

211摇瓶实验:分别添加不同浓度的6种氨基酸。从综合菌生长情况和电泳凝胶成像系统分析可以看出,胱氨酸加入后,羧肽酶原B蛋白(pCPB)表达提高不明显,且对菌体生长有一定的抑制作用。除胱氨酸外,其它5种氨基酸对菌体生长和pCPB 表达都有一定促进作用,提高菌体对氨基酸的利用效率,羧肽酶原B表达量由原来的16g/L提高到20g/L。随着氨基酸含量的提高,菌体生长良好,见表2。

212发酵罐实验:由于胱氨酸效果不明显,在罐发酵时不添加。只添加另外5种氨基酸,加入量012g/L。通过电泳图可以看出,与不添加氨基酸的对照相比,羧肽酶原蛋白(pCPB)的表达提高,发酵结束时相对含量由32%提高到38%,添加氨基酸后蛋白合成速率也有所提高,收获羧肽酶原B包涵体24g/L,比不加氨基酸时的1817g/L提高5g/L左右,见图3、图4。

表137e培养24h不同M g2+浓度下菌体活性和质粒稳定性(106倍稀释)

Tab11Bacterial ac ti v ity and p l as m i d stab ility at d ifferen t magnesi um io n concen trat i on s after reco mb i nan t E.co li was cu lti-vated for24h at37e

Index

M agne siu m i on(g/L)

0151102104108101510B lank contro l

Bacteria l densit y(A

600

)516515510318318214516 Count o f bac t e rial co l ony(w ith AM P)2083762581176316137 Count of bacteria l co lony(w it hout AM P)2113802611206416162

A :w ith m agne si u m i on ;

B :w ithou t m agnesi um ion .1,2,3,4,5,6,7,8,9,10and 11:16,18,20,22,24,14,16,18,20,22and 24hours after i n cubation respec ti vely .

图2 表达产物的SD S-PAG E 图谱

F i g 21SDS-PA

G E profil e of expressed protei

n

A :expressed p rote i n w ith a m i no ac i d s added ;B:con-tro.l 1,2,3,4,5and 6:14h ,16h ,18h ,20h,22h and 24h

a fter i ncabation respec ti vely .

图3 SDS-PAGE 分析添加氨基酸对蛋白表达的影响

F i g 31Analysis of i nf l uence of a m i n o aci d s add ed i n cu ltu re m ed iu m on p rotein expressi

on

图4 羧肽酶原B 蛋白表达曲线F i g 41Expression curve of pCPB

表2 摇瓶发酵结束时菌密度(A 600)

T ab 21B ac ter i al density(A 600)at end of fl ask fermen tation Am i no ac i d con t ent(g /L)

Bacte ri a l densit y (A 600)Thr

V a l

A la

T ry Ser

Cys

04169012510841604176417151104142014510641584185417551234136016511841674193418251424112018512141695102418351684103110

5122

4178

5109

4192

5186

3192讨 论

本文对重组大肠杆菌的生长表达进行了研究,

最终通过重组大肠杆菌在15L 全自动发酵罐中培养条件的优化,实现了菌的高密度培养和重组蛋白的高表达。

本研究分别在摇瓶发酵和15L 全自动罐规模探讨了添加M g 2+

对菌体生长、外源蛋白表达及质粒稳定性的影响。添加1g /L 浓度的M g 2+

,可使活细

胞密度从137@106个/m l 提高到376@106

个/m ,l 而且质粒稳定性明显增加,从对照质粒丢失1514%下降到111%,外源蛋白的稳定性也大大提高,即降解减少,这对于产物的分离提取十分有益。实验还发现菌体密度与活菌落数没有相关性,其原因是菌密度用分光光度计测定,它包括了死菌和活菌。而平板活计数表示存活的菌数,因此在菌密度接近的情况下,平板单菌落数多,说明活菌数高,加入1g /L M gSO 4的含量提高了菌的存活率,也就可以提高外源蛋白的表达量。

根据重组蛋白的氨基酸组成比例与培养基中所含蛋白的氨基酸组成比例,可以确定所需要加入的氨基酸种类及含量,本实验结果也证实了培养基中添加相应氨基酸能提高氨基酸的利用效率,从而增加重组蛋白的表达量。

参 考 文 献

[1]Rez n i k SE,Pricker LD .Carboxypep ti d ases fro m A to Z :i m plications

in e m bryon i c devel opm en t and W n t banding .Ce ll M o l Life S c,i 2001,58:1790-1804.

[2]张和笙,梁卫红.浅论镁离子对啤酒发酵的影响.酿酒科技,

1999,91(1):53~54.

(收稿日期:2005-03-18)

大肠杆菌的生长模型探讨

大肠杆菌的生长模型探讨 小组成员：王雪娇2013214127 王蕾2013214125 薛雪2013214129 崔静慧2013214091 李云2013214010 关梦玲2013214101 勾倩倩201321410 杜桂月2013214094 1.背景介绍 1.1大肠杆菌 大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。大肠杆菌能合成维生素B和K，正常栖居条件下不致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。 大肠杆菌革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。 1.2大肠杆菌的特点 大肠杆菌属于原核生物，它的代谢类型是异养兼性厌氧菌，具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核，有拟核；细胞质中的质

大肠杆菌的培养

大肠杆菌的培养 1、大肠杆菌 （1）特性： 革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌 （2）用途： 基因工程技术中被广泛采用的工具 2、培养： LB液体培养基——扩大培养 LB固体培养基——分离 培养基的配制：基础培养基（LB培养基）:含有一般细菌生长繁殖需要的基本的营养物质。最常用的基础培养基是天然培养基中的牛肉膏蛋白胨培养基。 细菌培养基的特殊成分：蛋白胨、酵母提取液、氯化钠，酸碱度：中性偏碱 a.固体培养基 通常加琼脂，作为凝固剂 （凝固剂的要求：不被微生物利用，又可使培养基固化，且不影响培养基中的其他营养物被细菌吸收） 作用：分离（纯化）细菌、计数、保留菌种等 b.液体培养基 不加琼脂等凝固剂其它成分与固体培养基相同 作用：培养细菌 高压蒸气灭菌： 条件： 1kg/cm2压力、121℃、15min 可灭菌培养皿、试管、三角瓶、取样器的头、移液管、三角刮刀、接种环、镊子、无菌水、培养基（高压蒸汽灭菌不会破坏培养基的营养成分） 分离细菌方法 一、划线分离法 1）灼烧接种环； 2）接种环冷却后，蘸取带菌培养物 3）在近火焰处，让带菌接种环在固体培养基上划线。 划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。 二、涂布分离法 1) 稀释菌液（10-5 ~ 10-7倍） 用无菌吸管吸取1ml细菌培养液加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此制成10-1倍的稀释液。…… 3) 涂布 用无菌吸管取0.1ml稀释度不同的菌液，加在培养皿的固体培养基上。再将玻璃刮刀放在酒精灯火焰上灼烧，待刮刀冷却后，在酒精灯旁打开培养皿，将菌液涂布到整个平面上。

大肠杆菌的特点与前景研究

大肠杆菌的特点与前景研究 摘要：肠埃希氏菌(E. coli)通常称为大肠杆菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内，一直被当作正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一些特血清型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜（禽），常引起严重腹泻和败血症，它是一种普通的原核生物。大肠杆菌属于细菌。关键词：大肠杆菌病原性应用前景 大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。大肠杆菌能合成维生素B和K，正常栖居条件下不致病；若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在水和食品中检出，可认为是被粪便污染的指标。大肠菌群数常作为饮水、食物或药物的卫生学标准。 大肠杆菌O157：H7血清型属肠出血性大肠杆菌，自1982年在美国首先发现以来，包括中国等许多国家都有报道，且日见增加。日本近年来因食物污染该菌导致的数起大暴发，格外引人注目。在美国和加拿大通常分离的肠道致病菌中，目前它已排在第二或第三位。大肠杆菌O 157：H7引起肠出血性腹泻，约2%～7%的病人会发展成溶血性尿毒综合征，儿童与老人最容易出现后一种情况。致病性大肠杆菌通过污染饮水、食品、娱乐水体引起疾病暴发流行，病情严重者，可

危及生命。 大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几占粪便干重的1/3。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。（国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个）大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12菌株中发现的。莱德伯格（Lederberg）采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。 大肠杆菌（E. coli）为埃希氏菌属(Escherichia)代表菌。一般多

大肠杆菌的保存和培养

大肠杆菌的保存和培养 大肠杆菌, 培养, 保存 一．菌种的保存 重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的重组DNA。 通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌 1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此，而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。能够长期在研究上应用。 2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态，以减少变异的发生。 3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后vf fv 的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的改变外，还不允许污染任何杂菌。此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进行鉴定，然后再繁殖保存。 4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。 5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点 i. 甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌. ii. 使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。 二、菌种的复苏 复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。 切记：接种过程中不得使保存瓶中的菌液融化。 三、大肠杆菌培养 1.

大肠杆菌生长的条件

大肠杆菌生长的条件 大肠杆菌生长的条件是什么呢？大肠杆菌是寄生在人体大肠里对人体无害的一种单细胞生物,结构简单。那么，大肠杆菌生长的条件是什么呢？小编这就来告诉你。 文章目录 一、大肠杆菌生长的条件 二、大肠杆菌的作用 三、大肠杆菌的培养方法 大肠杆菌生长的条件 1、大肠杆菌生长的条件 它是寄生在人体大肠里对人体无害的一种单细胞生物,结构简单,繁殖迅速,培养容易,它是生物学上重要的实验材料。在婴儿刚出生的几小时内,大肠杆菌就经过吞咽在肠道内定居了。只有在机体免疫力降低、肠道长期缺乏刺激等特殊情况下,这些平日里的良民才会兴风作浪,移居到肠道以外的地方,例如胆囊、尿道、膀胱、阑尾等地,造成相应部位的感染或全身播散性感染。因此,大部分大肠杆菌通常被看作机会致病菌。

2、大肠杆菌的致病物质 2.1、定居因子:也称粘附素(Adhesin),即大肠杆菌的菌毛。致病大肠杆菌须先粘附于宿主肠壁,以免被肠蠕动和肠分泌液清除。使人类致泻的定居因子为CFAⅠ、CTAⅡ,定居因子具有较强的免疫原性,能刺激机体产生特异性抗体。 2.2、黏附素能使细菌紧密黏着在泌尿道和肠道的细胞上,避免因排尿时尿液的冲刷和肠道的蠕动作用而被排除。大肠杆菌黏附素的特点是具有高特异性。 3、大肠杆菌的危害

3.1、肠道外感染:大肠杆菌离开肠道后,最容易引发的就是尿路感染,比如尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎等,这些炎症的发生都是因为大肠杆菌所引起。除了这些之外,大肠杆菌还会引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎等,特别是一些抵抗力较弱的婴幼儿以及老年人,大肠杆菌还会进入血液,从而引起败血症。 3.2、急性腹泻:大肠杆菌同时还会有暖气各种腹泻症状,而患有腹泻的人群通常以婴幼儿以及旅游者为主,其程度各有所不同,除了轻度的水泻以外,同时还有可能会引起严重的霍乱样症状。患有腹泻的人一般两到三天就会自行痊愈,但如果是体质较弱的人群,其腹泻症状会延长至数周。 肠致病性大肠杆菌是婴儿腹泻的主要病原菌,其特点是有着高度的传染性,如果情况严重的话还有可能会致死。并且肠出血性大肠杆菌会引起散发性或暴发性出血性结肠炎,可产生志贺氏毒素样细胞毒素。 大肠杆菌的作用

大肠杆菌生长曲线的制备

大肠杆菌生长曲线的制备 一、实验目的 1 了解细菌生长曲线特点及测定原理； 2 学习用比浊法测定细菌的生长曲线。 二、基本原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，定时测定培养液中的菌量，以菌量的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、对数期、稳定期和衰亡期。这四个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所改变。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解各菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。 三、器材 1菌种：大肠杆菌

2培养基：LB培养基（蛋白胨10g 酵母膏5g Nacl 10g pH7.0~7.2） 3仪器和器具：721分光光度计，比色杯，恒温摇床，无菌吸管，试管，三角瓶。 四、方法与步骤 1种子液制备 取大肠杆菌斜面菌种1支，以无菌操作挑取1环菌苔，接入LB培养基中，静止培养18h作种子培养液。 2标记编号 取11支无菌试管，分别编号为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20h。 3接种培养 吸取2.5ml种子液加入装有60mlLB培养基的锥形瓶中，混匀。分别取5ml加入到11根试管，于37℃下振荡培养。然后分别按对应时间将试管取出，立即放冰箱中贮存，待培养结束时一同测定OD值。 4生长量测定 将未接种的LB培养基倾倒入比色杯中，选用600nm 波长分光光度计上调节零点，作为空白对照，并对不同时间培养液从0h起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用未接种的牛肉膏蛋白胨液体培养基适当稀释后测定，使其OD值在0.10.～0.65以内，经稀释后测得的OD值要乘以稀释倍数，

大肠杆菌生长曲线的测定概要

大肠杆菌生长曲线的测定 一、基本原理 生长曲线是微生物在液体培养基中所表现出来的生长、繁殖的规律，不同的微生物表现为不同的生长曲线，而即使是同一种微生物在不同培养条件下，其生长曲线也不同。因此测定微生物的生长曲线对于了解，掌握微生物的生长规律是有帮助的。 由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此可利用光电比色计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。本实验是以活菌计数法与光电比浊法相对应来测定大肠杆菌在不同培养条件下的生长曲线，从而观察分析大肠杆菌在这些培养条件下的生长情况。 二、器材 培养了20小时的大肠杆菌悬液；肉汤蛋白胨培养基（液体、固体）；浓缩的肉汤蛋白胨液体培养基（浓缩5倍）；无菌酸溶液（甲酸：乙酸：乳酸＝3：1：1）。 1毫升及5毫升无菌吸管；无菌试管；无菌生理盐水； 无菌平皿；血球计数器；显微镜；光电比色计；无菌离心管；离心机等。 三、操作步骤 1．将经20小时培养的大肠杆菌培养物，倒入无菌离心管内离心（3000r.p.m×10），以无菌生理盐水洗涤三次后，制成约9亿毫升的菌悬液（用显微镜直接计数法），作为种子。上述过程都必须注意严格无菌操作。 2．取盛有200毫升培养基经灭菌的三角瓶三瓶，分别标明A、B、C，按5%接种量，将上述种子接入，置37℃振荡培养。在B瓶培养了4小时后取出，加入10毫升无菌酸溶液，然后继续振荡培养。在C瓶培养了6小时后取出，加入10毫升无菌浓缩肉汤蛋白胨液，再继续振荡培养。 3．间隔一定时间，即0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20小时后，从A、B、C三角瓶中各取5毫升菌液放于无菌试管中，置冰浴。并作适当稀释，使菌悬液的光密度控制在0.0－0.4范围内，再置光电比色计中进行比浊测定（400－440毫微米波长），用未接种的肉汤蛋白胨液为空白对照。记下光密度值。 另外，A管在比浊测定以前，以无菌操作吸取0.1毫升菌液于肉汤蛋白胨琼脂平板上，用玻璃刮棒涂抹均匀后，置37℃培养30小时后计数。 4．按间隔时间全部测完了以后，以菌悬液光密度值（O.D.）为纵坐标，培养时间为横坐标再绘制一条A培养条件下的生长曲线。 四、思考题 1．比较A、B、C三组生长曲线有什么不同？说明原因，标出A组生长曲线的四个时期的位置及名称。 2．两条A生长曲线有什么不同？为什么？

大肠杆菌生长曲线

四川大学 化学实验报告 课程名称生物工艺学实验课程号 309119060 学院轻纺与食品学院专业轻工生物技术 学生姓名赵凤佼学号 0843095035 指导教师周荣清成绩评定 实验日期 2011-06-20~2011-06-22 一、实验名称：大肠杆菌生长曲线的制作 二、实验目的： 1.通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生长特征与规律，绘制生长曲线。 2.掌握光电比浊法测量细菌数量的方法。 三、实验仪器及药品： 1.菌种：大肠杆菌。 2.培养基：LB培养基100ml，分装两支大试管（5ml/支），剩余90ml装入250ml三角瓶。 3.仪器和其他药品：722型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管和无菌吸管等。 四、基本原理： 在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次，将一定量的细菌转入新鲜培养液中，在适宜的培养条件下细胞要经历延迟期、对数期、稳定器和衰亡期4个阶段。以培养时间为横坐标，细菌数目的对数或生长速率为纵坐标所绘制的曲线成为该细菌的生长曲线。不同的细菌在在相同的培养条件下其生长曲线不同，同种细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不同。 当光线微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比；而光密度或透光度可以通过光电池精确测出。因此，可利用一系列菌悬液测定的光密度及其含菌量，做出光密度—菌数的标准曲线，然后根据样品液所测得的光密度，从标准曲线中查处对应的菌数。 本实验用分光光度计进行光电比浊，测定不同时间细菌悬浮液的OD值，绘制生长曲线。 五、关键步骤及注意事项： 1.测定OD值时，要求从低浓度到高浓度测定 2.严格控制培养时间

(完整版)生长曲线的测定

实验日期：2017.11.1 实验班级：生物技术指导教师：张建丽 姓名：高熹学号：1120152430 测定细菌生长曲线 一．实验目的 1.通过对大肠杆菌生长曲线的测定，了解细菌生长的特点，综合训练微生物实验的基本实验技能。 2.巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板。 3.掌握用比浊法测定细菌的生长曲线。 二．实验原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，以菌量的数量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、生长期、稳定期和衰亡期。将每一种一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。 延迟期：又叫调整期。细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少延迟期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1～4小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。 对数生长期：又称指数期。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。 稳定期：该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大细菌浓度达到最大即环境最大容纳量。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、过氧化物等）积累PH下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽孢等。 衰亡期：随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。 体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。 这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实

测定细菌生长曲线

实验七 测定细菌生长曲线 一、 实验目的 1. 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时； 2. 学习液体培养基的配制以及接种方法； 3. 反复练习无菌操作技术； 4. 了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同； 5. 掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法 二、 实验原理 将一定量的细菌接种在液体培养基内，在一定条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定的规律性，如以细菌的活菌数的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，可绘成一条曲线，成为生长曲线（如图一）。 图一 微生物生长曲线示意图 单细胞微生物的发酵具有四个阶段，即Ⅰ调整期（延滞期）、Ⅱ对数期（生长旺盛期）、Ⅲ平衡期（稳定期）、Ⅳ死亡期（衰亡期）。 生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程的动态。不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。 测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数板法、平板菌落计数法、称重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值（OD600）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测定的生长曲线的衰亡期不明显。 从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G 表示。其计算公式为： 2 lg /)lg (lg 121 2W W t t G --= 式中t1和t2为所取对数期两点的时间； W1和W2分别为相应时间测得的细胞含量（g/L ）或OD 。 三、 实验仪器、材料和用具 1. 实验材料:大肠杆菌，枯草杆菌菌液及平板； 2. 培养基:牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基

大肠杆菌发酵经验总结

大肠杆菌发酵经验总结 大肠杆菌发酵经验总结 首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。 其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。 第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。 第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。 根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。 大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。 一、代谢副产物-乙酸 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度

生长曲线的测定

实验日期：2017.11.1实验班级：生物技术指导教师：张建丽 姓名：高熹学号：1120152430 测定细菌生长曲线 一．实验目的 1.通过对大肠杆菌生长曲线的测定，了解细菌生长的特点，综合训练微生物实验的基本实验技能。 2.巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板。 3.掌握用比浊法测定细菌的生长曲线。 二．实验原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，以菌量的数量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所表现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、生长期、稳定期和衰亡期。将每一种一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。 延迟期：又叫调整期。细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程（不适应者可因转种而死亡）。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少延迟期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1～4小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。 对数生长期：又称指数期。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等（视培养条件及细菌代时而异）。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。 稳定期：该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大细菌浓度达到最大即环境最大容纳量。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物（有机酸、过氧化物等）积累PH下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽孢等。 衰亡期：随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。 体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。 这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实

用比浊法测定大肠杆菌浓度生长曲线

用比浊法测定大肠杆菌的生长曲线 (一)实验目的 了解细菌生长曲线的持点及测定原理，学会用比浊法测定细菌的生长曲线。 (二)实验原理 将一定数量的细菌，接种于适宜的液体培养基中，在适温下培养，定时取样测数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标，作出的曲线称为生长曲线。该曲线表明细菌在一定的环境条件下群体生长与繁殖的规律。一般分为延缓期、对数期、稳定期及衰亡期四个时期，各时期的长短同菌种本身特征、培养基成分和培养条件不同而异。 比浊法是根据细菌悬液细胞数与混浊度成正比，与透光度成反比关系，利用光电比色计测定细胞悬液的光密度(即OD值)，用于表示该菌在本实验条件下的相对生长量。 实验设正常生长、加酸抑制和加富培养等三种处理，以了解细菌在不同生长条件下的生长情况。 （三）实验器材 (1)活材料：大肠杆菌(E.coli)。 (2)培养基和试剂：牛肉膏蛋白胨液体培养基14支(每支10mL)，浓缩5 倍的牛肉膏蛋白胨培养基1支。无菌酸溶液(甲酸：乙酸：乳酸=3：1：1)。 (3)器材：1mL无菌吸管、摇床、冰箱、光电比色计、标签等。 （四）实验方法 方法(1) 1)接种：取13支装有牛肉膏蛋白胨培养液的试管，贴上标签(注明菌名、培养处理、培养时间、组号)。按无菌操作法用吸管向每管准确加入0.2mL的大肠杆菌培养液，接种后，轻轻摇荡，使菌体混匀。另一支不接种的培养管注明CK(对照)。 2)培养：将接种后的培养管置于摇床上，在37℃下振荡培养。其中9支培养管分别于培养的0、1．5、3、4、6、8、10、12和14h后取出，放冰箱中贮存，待测定。加酸处理。取出经4h培养的另二支培养管，按无菌操作法加入lmL无菌酸溶液，摇匀后放回摇床上，继续振荡培养，于培养8h和14h后取出放冰箱中贮存，待测定。加富营养物处理。余下的二支培养管于培养6h后取出，按无

细菌生长曲线的测定的实验步骤

细菌生长曲线的测定的实验步骤 一、 实验目的 1. 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时； 2. 学习液体培养基的配制以及接种方法； 3. 反复练习无菌操作技术； 4. 了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同； 5. 掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法 二、 实验原理 将一定量的细菌接种在液体培养基内，在一定条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定的规律性，如以细菌的活菌数的对数作纵坐标，以培养时间作横坐标，可绘成一条曲线，成为生长曲线（如图一）。 图一 微生物生长曲线示意图 单细胞微生物的发酵具有四个阶段，即Ⅰ调整期（延滞期）、Ⅱ对数期（生长旺盛期）、Ⅲ平衡期（稳定期）、Ⅳ死亡期（衰亡期）。 生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的全过程的动态。不同的微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。 测定微生物生长曲线的方法很多，有血球计数板法、平板菌落计数法、称重法和比浊法等。本实验采用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可利用分光光度计测定细菌悬液的光密度来推知菌液的浓度。将所测得的光密度值（OD600）与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌与死菌，因此所测定的生长曲线的衰亡期不明显。 从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G 表示。其计算公式为： 2 lg /)lg (lg 121 2W W t t G --= 式中t1和t2为所取对数期两点的时间； W1和W2分别为相应时间测得的细胞含量（g/L ）或OD 。 三、 实验仪器、材料和用具

大肠杆菌的保存与培养

一．菌种的保存 重组DNA 分子(质粒、噬菌体、粘性质粒)必须导入宿主菌中，通过细菌培养来扩增所需的 重组DNA。 通常采用宿主菌是大肠杆菌，根据不同载体需求，选用不同品系大肠杆菌 1. 概述：大肠杆菌其它微生物一样，都具有稳定遗传性和变异性、遗传性，保证微生物本 身特征的相对稳定，即无性繁殖过程中能够保持原有的性状，为菌种保藏提供了有利因此， 而变异性，使微生物的性状在繁殖过程中出现某些改变，给菌种保藏带来了困难。由于存在变异，即菌种常出现所谓的退化，主要指理想性状的丧失，从而导致发育缓慢，存活率和产 质量降低等现象，菌种保藏工作就是使菌种的变异降低至最小水平，使菌种在较长期的保藏之后仍然保持着原有的生命力、优良生产性能、形态特征以及不污染杂菌。能够长期在研究上应用。 2. 微生物的变异速度，通常情况下，与其新陈代谢速度有关，微生物代谢活力旺盛，它的 变异速度快，代谢活动微弱，变异速度就慢。并且在多次的无性繁殖过程中可能会有突变的 积累。人们利用这一规律，可以创造各种条件，使微生物活动处于微弱活动或不活动状态， 以减少变异的发生。 3. 菌种保藏的原理是：通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达最大限度地降 低菌种的代谢强度，抑制细菌的生长和繁殖。由于菌种的代谢相对静止，生命活动将处休眠状态，从而可以保藏较长时间。要求保存的菌种在复苏后除保持以前的生活与繁殖能力、不发生形态特征、生理状态及遗传性状的 改变外，还不允许污染任何杂菌。此外，在保存前应确保菌种的单纯性，先分离单菌落后进 行鉴定，然后再繁殖保存。 4. 常用的长期保存法有：液体石蜡法、硅胶保存法、加入甘油或二甲基亚砜（DMSD）等保护剂。 5. 甘油低温保存法(－70℃—－196℃)的特点 i. 甘油菌低温保存的基本原理是：在-70℃或液氮中冻存，细菌内的酶活性均己停止，即代谢 处于完全停止状态，故可以长期保存。在0℃—-70℃温度范围内，水晶呈针状，极易招致 细菌的严重损伤。用电镜观察，可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此，为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏，需要加保护剂。甘油可降低冰点，在缓 慢的冻结条件下，能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成，甘油对细菌无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细菌. ii. 使用浓度范围为15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混匀后贮存于-70℃或液氮中。复苏后细菌仍能生长，活力不受任何影响。 二、菌种的复苏 复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化 部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。

大肠杆菌生长曲线的测定

大肠杆菌生长曲线的测定 蔡小鹏 （南京工业大学生物与制药工程学院制药1104班）【摘要】通过比浊法对大肠杆菌生长曲线进行测定。因为细菌悬液的浓度与光密度成正比，所以可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌悬液的浓度。将培养12h的大肠杆菌进行发酵罐培养，在不同时间段取样，用分光光度计对大肠杆菌的生长曲线进行测定，测定结果显示：大肠杆菌生长曲线基本符合迟缓期、对数生长期、稳定生长期和衰亡期4个时期。 【关键字】比浊法；发酵罐培养；生长曲线 大肠杆菌是人和动物肠道中最著名的一种细菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的1%。是一种两端钝圆、能运动、无芽孢的革兰氏阴性短杆菌。除某些菌型能引起腹泻外，一般不致病，能合成维生素B和K，对人体有益。大肠杆菌是肠杆菌科的一员，经常作为细菌的模式生物广泛用于科学研究。 1实验材料与方法 1.1实验材料 1.1.1菌种 大肠杆菌 1.1.2培养基 1.1. 2.1种子培养基 蛋白胨1%，酵母粉0.5%，Nacl0.8%，硫酸卡那霉素800μL/L（灭菌后同冻存管一起加入摇瓶） 在烧杯中加入1.5g/150mL蛋白胨、0.75g/150mL酵母粉、1.2g/mLNacl,再加入适量（少于150ml）的蒸馏水，搅拌使之充分溶解，再补充水定容至150ml，保持自然PH。平均分装3瓶后，121℃灭菌20min[1] 1.1. 2.2发酵培养基 在烧杯中加入6g/L蛋白胨、3g/L酵母粉、1.5g/L无水硫酸镁、0.013g/L无水氯化钙、5g/L硫酸铵、1.5g/L柠檬酸三钠、3g/L磷酸二氢钾、0.075g/L七水合硫酸亚铁，再加入适量的（少于1L）蒸馏水，搅拌使之充分溶解，再补充水定容至1L。121℃灭菌20min。 1.2器材 超净工作台，高压灭菌锅，分光光度计，发酵罐及相应装置，摇床，移液枪，枪头，酒精灯，接种环，三角瓶，玻璃棒，烧杯 1.3接种 1.3.1种子培养基接种 选取单菌落生长明显的平板，用接种环挑取适量的菌落转移到灭过菌的种子培养基三角瓶中。 将接种好的种子培养基放到摇床中，200rpm/min转速，37℃，培养12-14 h。 1.3.2发酵罐接种 将灭过菌的发酵液装入发酵罐中，安装好发酵罐。将三瓶种子液混合均匀，

细菌生长曲线 -

实验报告 课程名称：生物工艺学实验 实验名称：大肠杆菌生长曲线测定专业：___生物工程__________ 学号：________ 姓名：____________ 实验地点：_________________ 实验日期：_________________

[实验目的和要求] 1．了解光电比浊计数法的原理。 2．了解细菌生长曲线的特点，绘制生长曲线。 3. 掌握光电比浊计数法测定大肠杆菌生长曲线的方法。 [实验器材] 1．菌种大肠埃希菌（E.coli）1~18h液体培养物或菌悬液。或者上次实验诱变得到的菌种。 2．培养基营养肉汤培养基，生理盐水 3．其它：721型光电比色计、1ml无菌移液管、摇床等。 [实验原理和方法] 原理：细菌的生长一般指群体的生长，常常具有一定的规律性。描述细菌在液体培养基中的生长规律的曲线叫做生长曲线，即将一定量的细菌接种到一定容积的液体培养基中，在适宜的条件下进行培养，以培养时间为横坐标，以菌数的对数为纵坐标进行作图得到的曲线。 典型的生长曲线可分为延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个时期。 细菌培养物在生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高。细菌悬液的混浊度和透光度成反比、与光密度成正比，透光度或光密度可借助光电比浊计精确测出，因此可用光电比浊计测定细胞悬液的光密度（OD值），表示该菌在特定实验条件下的细菌相对数目，进而反映出其相对生长量。

步骤： 1．接种、培养 采用无菌操作技术用移液管向每个100ml营养肉汤培养基的三角瓶中试管准确加入大肠埃希菌悬液3ml，轻轻振荡混匀，另设一空白对照组（不加大肠埃希菌悬液）。 将接种后的9组三角瓶置于摇床上，37℃,220r/min，振荡培养。间隔一定时间，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9~18小时后，从摇床上将取下其中一瓶三角瓶培养物（标记时间），置4℃冰箱保存。2．吸光度测定 每组取9支干净小试管，从不同时间培养菌液中摇匀各取3ml，将大肠埃希菌培养液进行适当稀释，使光密度在0.1~0.65之间，以没有接种的空白对照组液体培养基调零点，在600nm波长，1cm比色杯中依次进行测定OD值。测定从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。 经稀释后测定的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液的实际OD值。3．绘制生长曲线 以光密度(OD值)为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制大肠埃希菌的生长曲线。

大肠杆菌实验报告

大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 2.1实验材料、仪器和试剂 菌种：大肠杆菌 仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水 2.2实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）： 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml Ph7.0 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。） 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml Ph7.0 硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）0.2ml，按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌，取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素0.2ml加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液（106 ~ 108个/mL） ①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。 ②菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌