稀土离子_与牛血清白蛋白结合作用的研究

Vol.20高等学校化学学报No.1　1999年1月 CHEMICAL JOURNAL OF CHIN ESE UNIV ERSITIES 127～131　

稀土离子(Ⅲ)与牛血清白蛋白结合作用的研究3

李晓晶　张善荣　张树功　裴奉奎

(中国科学院长春应用化学研究所,长春,130022)

摘要　模拟生理条件研究了稀土离子(Ⅲ)与牛血清白蛋白(BSA)的结合性质.荧光光谱结果表

明,Tb与BSA形成1∶2配合物,表观络合常数lg K=7.93,并由p H电位法得出相近结果.用平

衡透析法确定Pr与BSA结合的高亲合位点数为2,低亲合位点数大于6,两类条件结合常数lg K1

=5.157,lg K2=3.435.由NMR法通过23Na弛豫时间的改变可知稀土与BSA络合后蛋白质体积

膨胀,活动性增加,相关时间τc减小.

关键词　稀土离子,牛血清白蛋白,荧光光谱,p H电位法,平衡透析法,23Na NMR

分类号　O616

随着稀土开发应用的不断深入,稀土离子可通过各种途径进入生物体.蛋白质是含有多种配位基团的生物大分子,稀土进入体内必然会与蛋白质发生某些作用,从而影响或改变蛋白分子固有的结构和功能.因此,研究稀土与蛋白质的结合性质对了解稀土离子在体内的代谢过程及生物效应的作用机理有实际意义.

血清白蛋白是哺乳动物体内多种内源和外源性物质的存储和转运蛋白[1],对稀土离子与其作用的研究较少.本文采用荧光光谱、p H电位、平衡透析和23Na NMR法研究了近似体液条件下,稀土离子(Ⅲ)与牛血清白蛋白(BSA)的结合常数和配位情况.

1　实验部分

1.1　试剂和仪器

氯化稀土溶液由纯度大于99.9%的单一稀土氧化物用盐酸溶解配制.BSA(中国科学院上海生物化学研究所)溶液以0.05mol/L、p H6.30的Tris(三羟甲基氨基甲烷)2HCl缓冲溶液配制,以0.15mol/L NaCl维持离子强度.

所用仪器为RF25000型荧光光谱仪(日本岛津)、p HS23C型精密p H计(上海)和Varian Unity2400型NMR波谱仪.

1.2　实验方法

1.2.1　荧光光谱　光谱仪以150W氙灯为光源,扫描速度60nm/s,激发及发射狭缝均为5nm,计算机预制程序采集数据.向加有2mL1.0×10-5mol/L BSA溶液的1cm石英池中逐次滴加2μL0.01mol/L TbCl3溶液,室温下记谱.

1.2.2　p H电位滴定　37.5℃下通氮,电磁搅拌,以0.15mol/L NaCl维持离子强度.加入适量HCl,逐次记录NaOH滴定后的p H值变化情况,用SCO GCS2程序处理数据.

1.2.3　平衡透析实验　将10mL BSA溶液置于透析袋中,以微量进样器注入PrCl3溶液(体

收稿日期:1998201219.联系人:裴奉奎.第一作者:李晓晶,女,26岁,博士研究生.

3国家自然科学基金(批准号:29403025)资助课题.

积小于6μL ,忽略对总体积的影响),扎紧袋口放入磨口瓶,袋外加10mL 缓冲液,密封.在

37.5℃恒温反应14.5h.取袋外液偶氮胂Ⅲ显色,用光度法测稀土浓度.

1.2.4　23

Na NMR 实验　定量取抗磁性稀土溶液装入有0.4mL BSA (1.3mmol/L BSA ,55mmol/L NaCl ,50mmol/L HEPES 的D 2O 溶液)的5mm NMR 样品管中,NMR 观察频率105.80MHz ,90°脉冲宽度为19.5μs ,

23

Na 的T 1和T 2用反转恢复法和CPM G 法测定.

2　结果和讨论

2.1　荧光光谱研究稀土离子与BSA 的结合常数

BSA 分子中色氨酸和酪氨酸残基具有荧光发射性质,以283.2nm 激发BSA ,在340.8

nm 处有很强的荧光峰.以283.2nm 激发毫摩尔浓度的TbCl 3溶液,其545nm (4D 0→7

F 4)的

特征荧光极弱.由于本实验中Tb 3+浓度为1.0×10-5mol/L ,故可认为溶液中游离Tb 3+无影响.向BSA 溶液中滴加TbCl 3溶液,发现340.8nm 荧光峰强度减弱,并于542nm 处出现Tb 3+的荧光峰,说明BSA 分子与Tb 3+之间存在能量转移.以Tb 3+滴定BSA 时340.8nm 荧

光峰的相对荧光强度F 0/F (F 0为BSA 溶液340.8nm 的荧光峰强度,F 为加入Tb 3+后BSA 于340.8nm 荧光峰强度)对Tb 3+与BSA 的摩尔比作图(图1,滴定曲线在n (Tb 3+)∶n (BSA )=2∶1处出现转折,说明Tb 3+在BSA 分子中至少有两类结合位点[2],强结合位点数为2,即形成Tb 2?BSA 配合物.在n (Tb 3+)/n (BSA )≤2时,相对荧光强度F 0/F 的变化与Tb 3+浓度呈线性关系,则有

2Tb 3++BSA

Tb 2BSA

(1)[BSA ]total -[Tb 2BSA ][BSA ]total =

F

F 0(2)[Tb 3+]=[Tb 3+]-2[Tb 2BSA ]

(3)

式(1)的络合常数为:

K =[Tb 2BSA ][Tb 3+]2[BSA ]=1-F ?F -1

([Tb 3+]total -2[BSA ]total +2F ?F -10?[BSA ]total )2?F ?F -1

0 采用荧光法测得室温下p H 6.30、离子强度0.15mol/L NaCl 条件下Tb 3+与BSA 结合的表观络合常数lg K =7.

93.

Fig.1　The relative fluorescene instensity of BSA at 340.8nm with Tb/

BSA

Fig.2　Titration curve of BSA solution

2.2　pH 电位滴定法对Tb 3+与BSA 络合常数的测定

821高等学校化学学报 Vol.20

以0.15mol/L NaCl 维持离子强度,配成一定浓度的待测液和适量HCl ,逐次记录NaOH 滴定后的p H 值变化情况,并以SCO GCS2程序[3]处理数据.BSA 溶液的滴定曲线见图2,求得BSA 的质子化常数lg K =4.70,Tb 2?BSA 的表观结合常数lg K =8.1,这与荧光法的结果十分接近.

2.3　平衡透析法研究稀土离子与BSA 的结合情况

模拟体内生理条件研究在离子强度为0.15mol/L NaCl 、p H =6.30、0.05mol/L Tris 2HCl 缓冲溶液中不同温度下Pr 3+与牛血清白蛋白的结合情况,并由Scatchard 曲线[4]确定配

合物的强弱结合位点数及其条件结合常数:

Pr 3++BSA -=Pr 3+2BSA (4)[BSA -]=[BSA ]total -[Pr 3+2BSA ](5)[Pr 3+]total =[Pr 3+]ex +[Pr 3+]in

(6)

式中,in (internal )和ex (external )分别表示透析袋的袋内和袋外,由于透析袋内外自由Pr 3+

的浓度相同,故式(3)可表示为

[Pr 3+]total =2[Pr 3+]ex +[Pr 3+2BSA ]

(7)

从式(4)—式(7)可得出每摩尔总蛋白质结合的Pr 3+摩尔数r 为:

r =[Pr 3+2BSA ]/[BSA ]total

由Scatchard 曲线的切线与横轴的两个交点可分别确定BSA 分子中与Pr 3+的强、弱结合位点数n 1和n 1+n 2,又从两条切线的斜率可求得Pr 3+与BSA 强、弱结合位点的条件结合常数.按上述方法可得到一组不同温度下Pr 3+2BSA 的结合数据(表1),并可获得生理温度(3715℃

)下Pr 3+与牛血清白蛋白的结合情况(图3).BSA 中有两类Pr 3+结合部位,强结合位点数为2,弱结合位点数目大于6;两类结合位点的条件结合常数lg K 1=5.157,lg K 2=3.435.

T able 1　The associated data of Pr 3+2BSA at different temperatures

25℃

37.5℃

45℃

r

105[Pr

3+

]/(mol ?L -1

)r 105[Pr

3+

]/(mol ?L -1

)r

105

[Pr 3+]/(mol ?L -1)

0.259 1.862 1.0980.7290.9380.8240.547 1.702 1.412 1.194 1.694 2.0841.052 3.170 1.453 1.877 2.336 4.3251.357 4.592 1.539 1.556 2.670 6.5461.825 5.675 2.464 4.183 3.1848.4921.918 6.934 3.033 6.969 3.49510.2802.099 6.180 3.1098.156 4.18715.282.2738.091 4.86617.07 6.54338.642.6607.228 6.12225.56 6.68942.074.67312.68 6.72430.217.54255.214.73613.557.301

32.81

8.371

74.82

4.865

12.74

将不同温度下的r 对lg[Pr 3+]作图可得到一组结合曲线.该曲线表明了Pr 3+的结合尚未

饱合时游离Pr 3+与r 的关系(图4),并用曲线拟合法[5]得到p H =6.30、μ=0.15mol/L NaCl 条件下的结合曲线方程为

lg r =A +B ?lg[Pr 3+]

则25℃、37.5℃及45℃下方程分别为:

lg r =4.782+1.063lg[Pr 3+]

921No.1李晓晶等:稀土离子(Ⅲ)与牛血清白蛋白结合作用的研究

lg r=2.567+0.497lg[Pr3+]

lg r=2.441+0.478lg[Pr3+]

相关系数分别为0.988、0.997和0.998.从结合方程看,随温度升高,每摩尔BSA结合Pr3+

的摩尔数降低,说明升温引起的BSA分子构型改变,致使稀土离子的结合位点数降低

.

Fig.3　Scatchard plot of Pr3+2

BSA Fig.4　Free Pr3+and r at different temperatures

a.25℃;

b.37.5℃;

c.45℃.

2.4　抗磁氯化稀土(La3+,Lu3+)与BSA结合性质的23N a NMR研究

以23Na为磁核探针,通过弛豫分析研究稀土金属离子与血清白蛋白的作用可克服直接检测蛋白质分子磁核灵敏度低的问题[6].23Na(I=3/2)的弛豫机制取决于其所处环境中随时间起伏变化的电场梯度间的相互作用,从横、纵弛豫速率(T-11、T-12)和相关时间τc可了解稀土离子结合BSA前后结构变化的信息,τc与BSA上Na+结合位点处电场梯度的旋转相关时间τrot和该位点上的交换时间τB有关,τ-1c=τ-1rot+τ-1B.

将稀土加入到BSA溶液中,首先取代了与BSA结合的Na+,理论上会使自由态Na+的布居数P A增大,结合态Na+布居数减小,致使23Na的T-11和T-12同时减小.稀土离子会诱导BSA发生类似降低p H值时所出现的蛋白质肽链伸展现象[7],使BSA分子溶剂化作用增强,粘度增加,体积膨胀.BSA分子内部运动性的增加使Na+的τrot值减小,τc值随之减小,导致T-11增大,T-12减小;而粘度增加则使自由态和结合态Na+交换减慢,τB值增大,使

T-1

1

和T-12均减小.

取代效应与膨胀效应对T-11和T-12影响程度见表2.由表2可知,低浓度稀土存在下

T-1

1

的总结果增大,T-12减小,此时膨胀效应起主导作用,反映了稀土离子在BSA上的高亲合位点不会太多,与前面的结果一致;稀土浓度增大时,τB值显著增加,使T-11减小的幅度大于T-12的,因此τC随稀土离子浓度增加呈“V”型变化.

T able2　The effect of RE3+to T-11and T-12of23N a in BSA solution 103[RE3+]La3+Lu3+

/(mol?L-1)T-11T-12τc/ns T-11T-12τc/ns 024.57±0.1633.90±0.80 1.46224.57±0.1833.90±0.80 1.462

225.45±0.0633.31±0.67 1.21424.88±0.1931.54±0.88 1.140

524.75±0.0531.00±0.60 1.10524.21±0.1132.36±0.52 1.380

824.33±0.0730.84±0.44 1.17623.58±0.0830.86±0.39 1.359

1024.51±0.3332.56±0.84 1.33223.42±0.1230.60±0.52 1.368

2023.47±0.2430.37±0.60 1.32622.68±0.1129.42±0.53 1.421 031高等学校化学学报 Vol.20

参　考　文　献

　1　Krogh 2Hansen Ulrich.Pharmacol.Rev.,1981,33(1):17

　2　YAN G Bin 2Sheng (杨斌盛),YAN G Pin (杨　频).Progress in Biochemistry and Biophysics (生物化学与生物物理进展),

1989,16(5):354

　3　Sayce I.G..Talanta ,1971,18:653

　4　Scatachard G.,Ann N.Y..Acad.Sci.,1949,51:660

　5　Spain D..Basic Microcomputer Models in Biology ,New Y ork :Addison 2Wesley Publishing Co.,1982

　6　REN Ji 2Min (任吉民),ZHAN G Shan 2Rong (张善荣),L IU Ai 2Zuo (刘爱琢)et al ..Chinese J.Magn.Reson.(波谱学杂

志),1995,12(3):253

　7　Shahid F.,G omz J. E..J.Biol.Chem.,1982,257(10):5618

Studies on the Interaction of R are E arth Ions with BSA

L I Xiao 2Jing ,ZHAN G Shan 2Rong ,ZHAN G Shu 2G ong ,PEI Feng 2Kui 3

(Changchun Institute of A pplied Chemist ry ,Chinese Academy of Sciences ,Changchun ,130022)

Abstract Studies on the bounding character of rare earth ions with borine serum albumin (BSA )are significant for understanding the state of rare earth ions in body and their effects on the struc 2ture and function of protein.The fluorescence spectrum and p H potentiometry showed consistent results of apparent complexion constant of Tb 2?BSA.The equilibrium dialysis showed that there are two specific binding sites and more than six non 2specific binding sites of RE ions onto BSA molecule with the conditional stable constants lg K 1=5.157and lg K 2=31435.23

Na NMR stud 2

ies revealed that the BSA peptide chain bound to RE ions was expanded and the mobility of its

molecular backbone was increased.

K eyw ords Rare earths ions ,Bovine serum albumin ,Fluorescence spectrum ,p H potentiometry ,Equilibrium dialysis ,

23

Na NMR

(Ed.:Y ,X )

131No.1李晓晶等:稀土离子(Ⅲ)与牛血清白蛋白结合作用的研究

牛血清白蛋白的提取与鉴定演示教学

如有侵权请联系网站删除 牛血清白蛋白的提取与鉴定 一、实验目的 1. 掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法 2.掌握盐析法、透析法及电泳法 二、实验原理 牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。应用相同浓度硫酸铵盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。 三、操作步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（2000r/min）10min，将上清液倾入试管中。 （二）透析（1 ）取干净的比色板，在各孔内滴加一滴纳氏试剂 （2）透析袋未放入水中时，立即取水中液体检查有无NH4+ (3)取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。 (4)每隔2分钟检查一次，更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化并记录，直至袋内盐分透析完毕。 (5)将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。 （三）电泳（1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。标准液点一次，待测液点三次。 （2）电泳将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时膜条无光泽面向下，点样端臵于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将膜条取出。 （3）染色将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。（4）鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。 四、仪器和试剂 仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色板、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、天平 试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2饱和硫酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液 五、预测结果位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。 六、参考文献[1]陆红玲.生物化学与分子生物学实验教程.西安:第四军医大学出版社,2010 精品资料

牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析(ELISA)

牛的牛血清白蛋白残留检测酶联免疫分析（ELISA） 试剂盒使用说明书 本试剂仅供研究使用 目的：本试剂盒用于测定牛血清，血浆及相关液体样本中类牛血清白蛋白残留检测的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中牛的牛血清白蛋白残留检测水平。用纯化的牛的牛血清白蛋白残留检测抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入类牛血清白蛋白残留检测，再与HRP标记的类牛血清白蛋白残留检测抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的类牛血清白蛋白残留检测呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中牛的牛血清白蛋白残留检测浓度。 试剂盒组成： 试剂盒组成48孔配置96孔配置保存 说明书1份1份 封板膜2片（48）2片（96） 密封袋1个1个 酶标包被板1×48 1×96 2-8℃保存 标准品：2700ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存 样本处理及要求： 1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上 清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心 20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程 中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

异硫氰酸荧光素_牛血清白蛋白标记物的化学发光反应

异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白标记物的化学发光反应 黄春保 *1 慈云祥2 常文保21(黄冈师范学院化学系,黄州438000) 2(北京大学化学与分子工程学院,北京100871) 摘 要 采用反相流动注射法,系统地研究了碱性介质中和阳离子在表面活性剂C TM AB 存在下,N aClO 氧化 异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白标记物的化学发光行为和化学发光反应的条件,提出了反相流动注射化学发 光测定牛血清白蛋白的新方法。该法测定牛血清白蛋白线性范围为0.08~16mg P L;检出限为0.032mg P L 。讨 论了蛋白质标记物化学发光增强作用的原因。 关键词 异硫氰酸荧光素,牛血清白蛋白,化学发光反应,流动注射法 2001205217收稿;2001211226接受 1 引 言 蛋白质测定在临床医学和生命科学研究中具有重要意义。这方面的研究引起了人们的广泛重视。近年来,常见蛋白质测定方法的报道,其中大多是利用蛋白质与生色探针的结合作用,生成有色复合物后以分光光度法测定[1~3],少数是将蛋白质用卟吩、四环素等荧光探针标记后,用荧光光度法测定 [4,5],也见有蛋白质电分析方法的报道[6]。这些方法在临床检测和生化分析中具有一定的应用价值。 研究发现,在碱性条件下,选用某些氧化剂氧化异硫氰酸荧光素(FI TC),能产生化学发光,但强度很弱。若在碱性介质中,将异硫氰酸荧光素标记到蛋白质分子上,生成的蛋白质标记物则更易于氧化,不仅化学发光能力极大增强,而且发光强度与蛋白质的含量呈良好的线性关系。本文采用反相流动注射方法,研究了碱性介质中,次氯酸钠氧化异硫氰酸荧光素2牛血清白蛋白(B SA)标记物的化学发光行为、反应条件和阳离子表面活性剂的增敏作用,提出了反相流动注射化学发光测定牛血清白蛋白的新方法。体系的发光强度与B SA 的含量在0.08~16mg P L 范围内呈良好的线性关系;检测限为0.032mg P L 。由于采用反相流动注射进样方式,消除了样品背景干扰,故方法的灵敏度高,且稳定性好。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 GD 21型微光测量仪(西北有色地质研究所);LP 21型蠕动泵(北京东方仪器设备公司);自动平衡记录仪(上海大华仪表厂);821型pH 计(中山大学)。 BSA(A.R.,Sigma 公司)。FITC 溶液(1g P L):称取50mg FI TC(第三军医大学朝晖制药厂),用5mL 0.5mol P L 碳酸盐缓冲溶液和少量水使其溶解后转入50mL 容量瓶中定容。9.0@10 -2mol P L NaClO 溶液(pH=9.5):移取1.5mol P L NaClO 溶液,适当稀释,用HCl 调节溶液酸度至pH =915(酸度计测量),然后定容,该溶液在使用前配制。8.0@10-4mol P L C TM AB 溶液;0.5mol P L NaHCO 32Na 2CO 3缓冲溶液(pH= 9.5)。所用试剂均为分析纯,用二次蒸馏水配制溶液。 2.2 实验方法 2.2.1 FITC 2BSA 标记物的制备与分离 准确称取40mg B SA 置于比色管中,依次加入1.5mL 水,0.5mL 碳酸盐缓冲溶液,摇匀后缓慢滴加1mL FI TC 溶液,混合均匀后置于冰箱(4e )中反应12h 。用G 225色谱柱分离游离的FI TC 。收集FI TC 2BS A 标记物并定容20mL 。该液准确稀释250倍后用于化学发光体系的条件实验。 2.2.2 测定方法 采用反相流动注射法。测定装置流程和抽取试液速度、试液混合顺序如图1所示。NaClO 溶液通过旋转六通阀注入,每次注射体积为100L L 。试液在流动过程中混合,并立即流进发光仪第30卷 2002年4月 分析化学(FE NXI HUA X UE) 研究简报 Chinese Journal o f Analytical Chemistry 第4期 447~449

牛血清白蛋白的提取与鉴定

第八次实验： 牛血清白蛋白的 提取与鉴定 一、实验名称牛血清白蛋白的提取与鉴定 二、实验目的1、掌握盐析法提取牛血清白蛋白 2、掌握血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳法 鉴定牛血清白蛋白 3、了解用溴甲酚绿鉴定血清蛋白 三、实验原理1，蛋白质是水化作用较强的高分子物质， 向其加入碱土金属的中性盐类可是蛋白质胶粒脱水并失去 电荷，从溶液中沉淀出来。球蛋白在半饱和的硫酸铵溶液 中可析出，而清蛋白则需在饱和的硫酸铵溶液中可析出。 可将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐， 即可提取白蛋白。2，利用电泳过程中带电粒子的移动速度

与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠 度等有关，可对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。3，血清中 的白蛋白与溴甲酚绿在ph=4.2的条件下结合生成绿色化合 物，溶液由黄色变为绿色，而球蛋白基本不与之反应，缩 短反应时间可去除干扰，其颜色的深浅与白蛋白浓度成正 比，可用于鉴定牛血清白蛋白。 四、实验步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS磷酸盐缓冲生理盐水稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（4000r/min）10min，将上清液倾入试管中。 （二）透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。（三）BCG法鉴定 白蛋白+溴甲酚绿ph=4.2 绿色复合物 或（三）电泳鉴定

牛血清白蛋白的提取与鉴定 自主设计实验

自主实验设计 牛血清中白蛋白的提取与鉴定 小组成员： 【目的】 1.通过牛血清白蛋白的提取与鉴定，掌握盐析、离心、电泳、及呈 色反应的原理及应用。 2.通过实验掌握实验的基本操作、原理及为以后的学习打下坚实的 基础。 【原理】 本实验用盐析、离心、透析、电泳及呈色反应来分离、纯化及鉴定牛血清白蛋白。首先用盐析初步分离，在半饱和硫酸铵溶液中，血清球蛋白沉淀下来，经离心后上清液中含白蛋白。第二步用玻璃纸利用透析原理通过不断改变膜内外的浓度差让膜内的盐离子不断溢出达到纯化的目的，得到较纯的白蛋白。第三步利用电泳将蛋白彻底分离。最后，将其与标准膜一起染色，漂洗，进行对比即可达到鉴定的目的。

【操作】 1盐析 取小牛血清0.5ml+PBS液0.5ml+饱和硫酸铵2.3ml，充分混合均匀，静置20min，2500r/min 离心10min。 2、透析 取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），放入有自来水的小烧杯中透析，要不断震动，每隔2min换一次水，换15次。放入试管待用。 3、准备与电泳 1）取两条2.5cm x 8.0cm 的膜条，将膜条无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中冲锋浸透。 2）将充分浸透的两条膜条取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以醋纤膜的光泽面距一端1.5cm处作为点样线，并用铅笔在上面编好号①②。 3）用两个点样器分别在标准液和测定液中櫵一下，点样器下端粘上薄层标准液和样液，然后将点样器竖直，进行点样。 4）电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时点样面向下（无光泽面），点样端置于阴极，膜条与滤纸贴紧，待平衡5min后，即可通电。调节电泳仪，使两极间距的电压为15v/cm，电流0.4~0.6Ma/cm 膜条，通电50分钟关闭电源。 5)通电完毕后，用镊子取出膜条，直接浸于盛有氨基黑10B的染色

牛血清白蛋白

BSA牛血清白蛋白 牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。 CAS号：9048-46-8 英文名称：Bovine albumin 英文同义词：nhsa;BSA-C;AC-BSA;ALBUMIN, PIG;albumenpowder;SERUM ALBUMIN;ACETYLA TED BSA;BSA ACETYLATED;Bovine albumin;BSA, METHYLA TED 中文名称：牛血清白蛋白 中文同义词：蛋白粉；牛白蛋白；卵蛋白粉；血清蛋白；血清白蛋白；牛血蛋白质；复合氨基酸；牛血清蛋白；牛血清白蛋白；血清白蛋白（牛） CBNumber: CB5107573 分子式：N/A 英文别名：Bovine serum albumin 化学性质 储存条件: 2-8°C 溶解度: PBS: >40 毫克/毫升 form : lyophilized powder Merck : 13,8542 稳定性：Stable. Incompatible with strong oxidizing agents and strong acids. Refrigerate. EPA化学物质信息：Albumins, blood serum(9048-46-8) 用途 1、用于生化研究、遗传工程和医药研究 2、用作医药保健食品、调味品 3、维持渗透压、pH缓冲、载体作用 4、在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，可以提高PCR的效率

牛血清白蛋白分离提纯工艺

课程设计说明书 课程名称：生物分离工程 设计题目：牛血清白蛋白的分离提纯工艺 院系：环境与化学工程学院 学生姓名：孙盼盼 学号：41004020111 专业班级：10级生物工程01班 指导教师：王晓军 2013年6月20日

目录 1.设计任务书 (1) 2.设计背景 (1) 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 (1) 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 (1) 3.设计原理 (2) 4.设计工艺流程及设计方案说明 (2) 4.1对原材料的粗分级分离 (3) 4.2对粗分离成分进行细分级分离 (3) 4.3 蛋白的结晶与重结晶 (3) 4.4 对分离出的蛋白质进行纯度鉴定 (3) 4.5 牛血清白蛋白质分离提纯的整个工艺流程 (3) 5.操作过程 (4) 5.1蛋白质分离的准备阶段 (4) 5.2细分级分离设备的设计 (4) 5.3蛋白质的纯度鉴定 (8) 6.参考文献 (8) 7.课程设计心得 (9)

1.设计任务书 现有一混合物料液中含有酪蛋白（分子量：57000Da，pI 4.5）、β-乳球蛋白（分子量：35000Da，pI 5.1）、α-乳白蛋白（分子量：14000Da，pI 4.2）和牛血清白蛋白（分子量：66200Da，pI 4.7），设计一个分离纯化工艺纯化其中的牛血清白蛋白。 2.设计背景 2.1 牛血清白蛋白分离提纯的简介 蛋白质是（protein）是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命。因此，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的物质。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。蛋白质占人体重量的16%~20%，即一个60kg重的成年人其体内约有蛋白质9.6~12kg。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。 蛋白质具有很多生物化学共性，运用相关性质进行蛋白质的分离制备多种不同的单一蛋白质，更好的为人们所有。蛋白质的分离提纯技术已经很成熟，相关的工艺流程包含各种不同的分离提纯设备，这些设备运用蛋白质的不同原理对其进行分离纯化，单一蛋白质的分离提纯在现实生活中具有重要意义！ 2.2 牛血清白蛋白分离提纯的意义 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫

双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用

牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基。分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。其在血液中的主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，可起到生理和机械保护作用和载体作用。目前，石家庄鼎晨科技有限公司致力于研究牛血清白蛋白的溶液标准物质。此外，纽邦生物科技有限公司也专业提供牛血清白蛋白。 双水相萃取技术主要技术特征是条件温和，两相间界面张力小，生物相容性高，萃取后目标产物的后处理简便，一般不存在有机溶剂残留问题，易于放大工艺，可获得较高收率和纯度，已经在生物化学、细胞生物学以及生物化工等领域得到了广泛的应用。 国内双水相萃取技术在提取牛血清白蛋白中的应用十分广泛。邓凡政等建立了由亲水性离 子液体四氟硼酸1-甲基-3-丁基咪唑和KH 2PO 4 形成的双水相体系萃取分离牛血清白蛋白(BSA) 的新方法，结果表明,磷酸二氢钾盐浓度为80g/L,离子液体浓度在160~240 mL/L,BSA的浓度为30~50 mg/L,溶液酸度在pH 4~8范围,离子液体双水相体系对BSA有较高的萃取率；林潇利用双水相技术萃取牛血清白蛋白回收率为96.90%。结果表明，此方法回收率、重现性好，且适用于牛血清白蛋白和牛血红蛋白混合样品的检测，为蛋白质分离提取提供了一种新思路；田明玉考察了多种单羟基的短链醇/无机盐双水相体系对牛血清白蛋白的萃取能力。结果表明，多种体系对牛血清白蛋白都有较好的萃取效果，在磷酸二氢钾18%（W/W）/乙醇18%（W/W）、碳酸钠13%（W/W）/乙醇18%（W/W）时，收率达到最大分别为94.0%、93.6%，此时其分配系数分别为11.52、11.24，这与传统的低分子量聚乙二醇/磷酸氢二钾体系萃取效果相似。 国外在双水相提取牛血清白蛋白中也取得了长足的发展。LouwrerA用乙醇/磷酸氢二钾体系萃取分离牛血清白蛋白,酪蛋白，核糖核酸酶等蛋白质，实验结果表明：被萃取物在该体系能得到较好的分离，而且部分稳定性较高的蛋白的生物活性得到了很好的保持；E-Kiss等人采用硫酸铵/叔丁醇双水相体系对牛血清白蛋白进行分离提取，结果表明，牛血清白蛋白能保持较高活性沉淀到两相界面处；据外文文献记载，牛血清白蛋白在聚乙二醇/葡聚糖双水相体系中分配特性的研究实验中，结果表明：pH对其影响主要为任一NaCl浓度下，pH=5.0处均出现一波峰。当pH>7并继续增大时，开始受电位差的影响。由于BSA所带的负电荷不断增大，在电位差的影响下，聚阴离子不断向上相富集使得分配系数呈向上趋势。 目前，通过市场的调研和实践，证实了双水相萃取牛血清白蛋白的可行性。石家庄鼎晨科技有限公司应用双水相萃取技术制备的牛血清白蛋白降低了其成本，扩大了生产规模，提高了纯化倍数和相的分离速度，系统经济，成本低且无毒，此技术的大规模应用为社会带来了广大的社会效益。该公司充分利用双水相萃取技术的作用条件温和，可调节因素多，易于放大和操作的优点来分离提纯牛血清白蛋白，从而达到降低成本，提高产率的目的，这些也是传统工艺所没有的特点。 双水相萃取技术是一种新型液液萃取分离技术，其技术有点很多，譬如，条件温和，工艺易于放大，杂质少，纯度高等。然而，相关研究和应用还不够深入，一些技术难题还有待解决。双水相萃取技术的发展趋势为：解决易乳化，相分离时间长，成相聚合物的成本较高，水溶性高聚物粘度较大且不宜定量控制等问题。开发新型优质的双水相体系，进一步拓宽应用领域，与其他技术结合的多元化利用。今后，随着对双水相体系研究的深入，双水相萃取将成为一种优良的分离技术。

牛血清白蛋白的提取与鉴定

牛血清白蛋白的提取与鉴定 一、实验目的掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法 二、实验原理牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的 主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。应用相同浓度硫酸铵盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。

三、实验步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（4000r/min）10min，将上清液倾入试管中。 （二）透析取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化，直至袋内盐分透析完毕。将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。（三）电泳 （1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位臵点样。 （2）电泳将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时膜条无光泽面向下，点样端臵于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将膜条取出。（3）染色将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗

牛血清蛋白提取

牛血清蛋白试验 【摘要】本次历时三周的实验，主要是通过一系列提纯，分离，得到牛血清蛋白，并电泳，在此过程中学习一些基础的医学生化实验知识，比如盐析，凝胶过滤层析，DEAE-纤维素离子交换层析，α1-AT活力测定及蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳等，另外，还学习了一些实验仪器的使用，如分光光度计，离心机，电泳胶的制作等 【关键字】牛血清蛋白，电泳，盐析，凝胶过滤层析，比色 【Abstract】The experiment lasted three weeks, mainly through a series of purification, separation, obtained bovine serum albumin, and electrophoresis, in the process learn some basic medical knowledge of biochemical experiments, such as salt precipitation, gel filtration, DEAE-cellulose ion exchange chromatography, α1-AT activity assay and protein quantification, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, etc. in addition, a number of experiments studying the use of instruments such as spectrophotometer, centrifuges, gel electrophoresis of production, etc.【Key words】Bovine serum albumin, electrophoresis, salt precipitation, gel filtration chromatography，colorimetric 正文 前言：血清是血液的组成成分，是血液经离心或凝固后析出来的液体成分。血清的主要成分是免疫球蛋白和血清白蛋白，本系列实验采用牛血清提取蛋白质进行试验。由于在蛋白质溶液中加入无机盐会破坏蛋白质的稳定结构，而使蛋白质析出，牛血清首先经过分段盐析进行蛋白质的粗提，得到α1-AT粗提蛋白成分。之后通过凝胶过滤层析，利用分子两大小的差别，导致的经过凝胶形成的固定相的分子筛时流速不同而进一步分离除盐。第三步，运用DEAE-纤维素离子交换剂对负电物质的吸引能力，除去溶液中的大部分球蛋白。之后通过α-AT对胰蛋白酶的抑制力来测定α1-AT的活力。最后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定1 蛋白质分子量。 材料与方法 材料、主要仪器与主要试剂 材料：牛血清 主要仪器：离心机，真空泵，层析柱，分光光度计，恒温水浴箱，电泳仪器一套 主要试剂：牛血清待测液，牛血清样品，PBS，pH7.2饱和磷酸钠溶液，奈氏试剂 方法：1.盐析 取样→离心→弃上清，加硫酸铵后4°C30min→抽滤→得粗样 2.凝胶过滤层析 蛋白样用PBS溶解→装柱及平衡→上样→洗脱→凝胶再生 3.α1-AT活力测定及蛋白定量 α1-AT活力测定→蛋白定量——双缩脲法 4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

牛血清蛋白BSA

牛血清白蛋白 简介 牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。 CAS号：9048-46-8 英文名称：Bovine albumin 英文同义词：nhsa;BSA-C;AC-BSA;ALBUMIN, PIG;albumenpowder;SERUM ALBUMIN;ACETYLATED BSA;BSA ACETYLATED;Bovine albumin;BSA, METHYLATED 中文名称：牛血清白蛋白 中文同义词：蛋白粉；牛白蛋白；卵蛋白粉；血清蛋白；血清白蛋白；牛血蛋白质；复合氨基酸；牛血清蛋白；牛血清白蛋白；血清白蛋白（牛） CBNumber: CB5107573 分子式：N/A 英文别名：Bovine serum albumin 化学性质 储存条件: 2-8°C 溶解度: PBS: >40 毫克/毫升 form : lyophilized powder Merck : 13,8542 稳定性：Stable. Incompatible with strong oxidizing agents and strong acids. Refrigerate. EPA化学物质信息：Albumins, blood serum(9048-46-8)

用途 1、用于生化研究、遗传工程和医药研究 2、用作医药保健食品、调味品 3、维持渗透压、pH缓冲、载体作用 4、在PCR体系中有助于Taq酶的稳定性及活性，可以提高PCR的效率，在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。 生产方法 以牛血为原料分离出血清，用硫酸铵分级沉淀后，经辛酸处理精制而得。 贮存方法 每10克加100毫升水进行溶解，或用PBS溶解也可，视用途而决定。然后分装成小支。若不使用防腐剂可贮存在零下20或30摄氏度的恒温柜中，若使用防腐剂（如0.1%叠氮化钠）则可贮存在零上4摄氏度的环境下。一般可存放数月不变质。防腐剂可能对牛血清白蛋白的效果造成影响，应慎用。 编辑本段结构与作用 成分结构 牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种球蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在western blot中作为Blocking agent。它是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。含氮量16%，含糖量0.08%。仅含已糖和已糖胺，含脂量只有0.2%。白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。

牛血清白蛋白-9048-46-8(MSDS)

牛血清白蛋白-9048-46-8（MSDS） 牛血清白蛋白 化学品安全技术说明书 第一部分化学品及企业标识 化学品中文名称: 牛血清白蛋白化学品英文名称: Bovine albumin 企业名称: Shenzhen Biochemilogic Co. Ltd. 地址: 广东省深圳市宝安区龙华镇大浪明君工业园A2栋4楼邮编: 518109 电子邮件地址: 传真号码: 企业应急电话: 技术说 明书编码: 生效日期: 2010年02月26 日国家应急电话: 第二部分成分/组成信息 纯品 , 混合物 ? 化学品名称:牛血清白蛋白有害物成分:牛血清白蛋白浓度: ?95% CAS No.:9048-46-8 第三部分危险性概述 危险性类别: 无资料侵入途径: 吸入，食入，经皮吸收。健康危害: 刺激眼睛，呼吸系统和消化系统，引起皮肤过敏。环境危害: 对环境有危害，曝光或遇 热分解对大气可造成污染。燃爆危险:无资料 第四部分急救措施 第 1 页共 6 页 牛血清白蛋白皮肤接触: 立即脱去被污染的衣服，用清水或肥皂水彻底冲洗 皮肤至少15分钟， 如果暴露皮肤的外观发生了变化或疼痛，就医。眼睛接触: 立即提起眼睑， 用大量流动清水冲洗至少15分钟。即使没用急性疼

痛或外观变化，一定要就医。吸入: 迅速脱离现场至空气新鲜处。保持呼吸道通畅。如呼吸困难，不能进 行人工呼吸，给输氧，就医。食入:不能催吐，喝2-4杯牛奶或水，立即就医。 第五部分消防措施 危险特性:在足够的浓度下与空气可形成爆炸性混合物。有害燃烧产物: 一氧化碳、二氧化碳、刺激性和有毒烟雾和气体。灭火方法及灭火剂: 消防人员必须穿全身防护服，戴防护眼镜，佩戴自给式呼吸 器。使用适合周围环境的灭火设施。灭火剂:雾状水、泡沫、 干粉、二氧化碳。灭火注意事项: 没有配备全身防火防毒服和供氧设备请不要待在危险区。 第六部分泄露应急处理 应急处理: 应急处理人员须穿戴化学防护衣进入现场。化学品未经处理严禁向环 境排放。消除方法: 隔离泄漏污染区，限制出入。切断火源。确保有足够的通风，建议应 急处理人员戴防尘面具(全面罩)，穿防毒服。避免扬尘，小心扫起， 置于袋中转移至安全场所，防止流入水渠。收集回收或运至废物处理 场所处置。 第七部分操作处置与储存 操作注意事项: 密闭操作，全面通风。防止粉尘释放到车间空气中。操作人员必 第 2 页共 6 页 牛血清白蛋白

牛血清白蛋白的提取与鉴定

牛血清白蛋白的提取与鉴定 一、实验目的 1.掌握牛血清白蛋白的提取与鉴定方法 2.掌握盐析法、透析法及电泳法 二、实验原理 牛血清白蛋白是牛血清中的简单蛋白，是血液的主要成分（38g/100ml），分子量68kD。等电点4.8。应用相同浓度硫酸铵盐析法将血清中白蛋白与其它球蛋白分离，最后用透析法除盐，即可提取白蛋白。再利用电泳过程中带电粒子的移动速度与粒子荷电量、电场强度、粒子重量与半径及介质的黏稠度等有关，对牛血清白蛋白进行分离与鉴定。 三、操作步骤 （一）盐析取离心管一支加入牛血清2mL、加入等量PBS（磷酸盐缓冲生理盐水）稀释血清，摇匀后，逐滴加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2mL，边加边摇，充分混匀，然后静止放臵10分钟，再离心（2000r/min）10min，将上清液倾入试管中。 （二）透析（1）取干净的比色板，在各孔内滴加一滴纳氏试剂 （2）透析袋未放入水中时，立即取水中液体检查有无NH4+ (3)取玻璃纸一张，折成袋形，将离心后的上清液倒入袋内，用线扎紧上口（注意要留有空隙），用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯内，使透析袋下半部侵入水中，对蛋白液进行透析，常用玻璃棒搅拌袋外（烧杯中）液体，以缩短透析时间。 (4)每隔2分钟检查一次，更换蒸馏水多次，用纳氏试剂检查袋外液体的NH4+，观察颜色变化并记录，直至袋内盐分透析完毕。 (5)将袋内液体倾入试管，即得牛血清白蛋白溶液。 （三）电泳（1）点样取一张膜条，将薄膜无光泽面向下，放入培养皿中的巴比妥缓冲液中使膜条充分浸透，取出，用干净滤纸吸去多余的缓冲液，以薄膜的无光泽面距一端1.5㎝处作点样线，将牛血清样品与待测的牛血清白蛋白溶液分别用点样器在同一张薄膜的点样线处不同位置点样。标准液点一次，待测液点三次。 （2）电泳将点样后的膜条臵于电泳槽架上，放臵时膜条无光泽面向下，点样端臵于阴极，待平衡5min后，打开电源，调节电泳仪的电压为160伏，通电60min，关闭电源后用镊子将膜条取出。 （3）染色将膜条直接浸于盛有氨基黑10B的染色液中，染2分钟取出，立即浸于漂洗液中，分别在漂洗液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各漂洗5min，直至背景漂洗干净为止，用滤纸吸干薄膜。（4）鉴定比较样品与待测液中白蛋白在薄膜上的电泳结果，看位置是否一致。 四、仪器和试剂 仪器：离心管、离心机、试管、玻璃纸、烧杯、比色板、滴管、玻璃棒、电泳仪、醋酸纤维素薄膜、天平 试剂：牛血清待测液、牛血清样品、PBS（磷酸盐缓冲生理盐水，用0.01mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）配制的0.9%NaCl溶液）、pH7.2饱和硫酸铵溶液、纳氏试剂、巴比妥缓冲液、氨基黑10B染色液、漂洗液 五、预测结果位置一致，实验成功。若在待测液的电泳结果中出现其他球蛋白的黑带区域，则说明提取不够纯。 六、参考文献[1]陆红玲.生物化学与分子生物学实验教程.西安:第四军医大学出版社,2010

Diludine与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究

Diludiｎe与牛血清白蛋白相互作用的光谱研究 摘要：在模拟动物体生理条件下，应用荧光光谱和紫外可见吸收光谱法研究了Ｄｉｌｕｄｉｎｅ与牛血清白蛋白（ＢＳＡ）的相互作用，结果表明，Ｄｉｌｕｄｉｎｅ对ＢＳＡ有较强的荧光猝灭作用，根据不同温度下Ｄｉｌｕｄｉｎｅ对ＢＳＡ的荧光作用及Ｓｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒ方程得到Ｄｉｌｕｄｉｎｅ与ＢＳＡ反应的结合常数Ｋ为１．２３×１０６Ｌ／ｍｏl（２９８Ｋ）和２．２７×１０４Ｌ／ｍｏl（３０３Ｋ）。根据Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｃｋ，结合位点数为０．９３８７（２９８Ｋ）和０．６７４０３（３０３Ｋ）。热力学参数△Ｈ和△Ｓ分别为１．８４×１０－３Ｊ／ｍｏl和－１．９１×１０３Ｊ／ｍｏl，热力学数据说明Ｄｉｌｕｄｉｎｅ与ＢＳＡ之间主要以静电作用力与疏水作用力相互结合。根据Ｆｏｒｓｔｅｒ非辐射能量转移理论，求出Ｄｉｌｕｄｉｎｅ与ＢＳＡ间的结合距离ｒ＝４．５８ｎｍ。 关键词：Ｄｉｌｕｄｉｎｅ；牛血清白蛋白；荧光光谱；荧光猝灭；紫外光谱 Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｎｄｅｒｔｈｅｉｍｉｔａｔｅｄｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｆａｎｉｍａｌｂｏｄｙ，ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｂｅｔｗｅｅｎＤｉｌｕｄｉｎｅａｎｄｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ）ｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｆｌｕｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＵＶ－Ｖｉｓｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．ＩｔｗａｓｓｈｏｗｎｔｈａｔＤｉｌｕｄｉｎｅｈａｄａｑｕｉｔｅｓｔｒｏｎｇａｂｉｌｉｔｙｔｏｑｕｅｎｃｈｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌａｕｎｃｈｉｎｇｆｒｏｍＢＳＡ．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇｏｆｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｎｄＳｔｅｒｎ－Ｖｏｌｍｅｒｅｑｕａｔｉｏｎ，ｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｃｏｎｓｔａｎｔＫｏｆｔｈｅｃｏｍｐｏｕｎｄｔｈａｔＤｉｌｕｄｉｎｅａｎｄＢＳＡｆｏｒｍｅｄweｒｅ１．２３×１０６Ｌ／ｍｏl （２９８Ｋ）ａｎｄ２．２７×１０４Ｌ／ｍｏl（３０３Ｋ）．ＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ－Ｂｕｃｋｅｑｕａｔｉｏｎ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅs weｒｅ０．９３８７（２９８Ｋ）ａｎｄ０．６７４０３（３０３Ｋ），ａｎｄｔｈｅｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓ△Ｈwas １．８４×１０－３Ｊ／ｍｏl ａｎｄ△Ｓwas －１．９１×１０３Ｊ／ｍｏl，ｗｈｉｃｈｅｘｐｌａｉｎed ｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｐｏｗｅｒｓｂｅｔｗｅｅｎＤｉｌｕｄｉｎｅａｎｄＢＳＡwere ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．ＢａｓｅｄｏｎＦｏｒｓｔｅｒｔｈｅｏｒｙｏｆｎｏｎ－ｒａｄｉａｔｉｏｎｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，ｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｌｏｃａｌｉｔｙｒwas ４．５８ｎｍ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Dｉｌｕｄｉｎｅ；ｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍａ

牛血清蛋白简介

基本信息 【词条中文名称】牛血清白蛋白【词条拼音名称】Níuxuèqīng báidànbái 牛血清白蛋白 【词条英文名称】Bovine albumin 【词条英文别名】Bovine serum albumin 【词条分类性质】名词词组，偏正词组【词条适用范围】医学领域，药学领域【CAS 数字登录号】9048-46-8 BSA简介 BSA结构 CAS号：9048-46-8 英文名称：Bovine albumin 英文同义词：nhsa;BSA-C;AC-BSA;ALBUMIN, PIG;albumenpowder;SERUM ALBUMIN;ACETYLATED BSA;BSA ACETYLATED;Bovine albumin;BSA, METHYLATED 中文名称：牛血清白蛋白 中文同义词：蛋白粉；牛白蛋白；卵蛋白粉；血清蛋白；血清白蛋白；牛血蛋白质；复合氨基酸；牛血清蛋白；牛血清白蛋白；血清白蛋白（牛） CBNumber: CB5107573 分子式：N/A 英文别名：Bovine serun albumin 化学性质 储存条件: 2-8°C 溶解度: PBS: >40 mg/mL form : lyophilized powder Merck : 13,8542 稳定性：Stable. Incompatible with strong oxidizing agents and strong acids. Refrigerate. EPA化学物质信息：Albumins, blood serum(9048-46-8) 用途 1、用于生化研究、遗传工程和医药研究 2、用作医药保健食品、调味品