测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量的高效液相色谱法

第22卷第4期分析测试学报Vo l.22No.4

2003年7月FENXI CES HI XUEB AO(J ou rn al of In stru mental An al y si s)J ul.2003

测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量的

高效液相色谱法

陈勇1,李德发1,陆文清1,朴香淑1,杨文军1,惠柏棣2,韩雅珊2

(1.中国农业大学动物科技学院国家饲料工程技术研究中心,北京100094;

2.中国农业大学食品学院,北京100094)

摘要:建立了一种分离和测定雨生红球藻中虾青素和其它色素的反相高效液相色谱法;含有雨生红球藻细胞的培养液经离心分离,匀浆破碎,用甲醇-二氯甲烷(体积比3B1)提取色素,提取液用HPLC分离测定;

分析柱为Nov a_Pak C18(300mm@3.9mm ID,5L m)柱,流动相为水、甲醇和丙酮,流速1.0mL/min,用二极管阵列检测器在250~700nm波长范围扫描,在476nm处进行检测;虾青素、多种类胡萝卜素和叶绿素在30 min内得到较好分离,其中游离虾青素、斑蝥黄质和B_胡萝卜素的检出限分别为3.56、1.36和29.4L g/L,这3种类胡萝卜素分别在质量浓度为1.99~31.7m g/L、2.44~39.0m g/L、2.25~36.0m g/L范围内与峰面积线性关系良好,相关系数分别为0.9993、0.9987和0.9778;该法的精密度(RSD为0.09%~2.97%)和回收率(96%~102%)均符合方法学要求,可以用于研究和测定雨生红球藻中虾青素和其它色素的含量。

关键词:雨生红球藻;虾青素;类胡萝卜素;叶绿素;高效液相色谱法

中图分类号:O657.72;Q949.212文献标识码:A文章编号:1004-4957(2003)04-0028-04

雨生红球藻(Haematococcus p luv ialis)是一种广泛分布于自然界的淡水绿藻。在一定条件下(如应激、营养缺乏等),雨生红球藻能大量积累类胡萝卜素(可占细胞干重的2%~5%),其中80%以上为虾青素(astaxanthin)及其酯类[1]。虾青素,又名虾黄质、龙虾壳色素,是海洋动物体内主要的类胡萝卜素之一,其化学名为3,3c_二羟基_4,4c_二酮基_B,B c_胡萝卜素,分子式为C40H52O4,相对分子质量为596.86。近年来许多研究表明,虾青素具有许多重要的生物学功能,如抑制多不饱和脂肪酸的氧化、抵御紫外线的作用、维生素A样活性、改善视力、提高免疫力、促进色素形成、改善生育以及抗肿瘤等[2]。目前,虾青素在水产养殖(如红鳟鱼、鲑鱼、虾和观赏鱼类等的人工养殖)中较广泛地用作饲料添加剂,取得了满意的着色及改善动物机体健康状况的效果[3]。

虾青素和其它类胡萝卜素的定量分析是研究雨生红球藻必需的基本方法。目前,国外已有文献用HPLC方法分离测定雨生红球藻中各种色素的含量[4~6],但许多方法分离时间较长[4]或分离组分较少[5]。国内应国清等[7]和许培雅等[8]分别用HPL C检测虾壳和分光光度计法检测红发夫酵母中虾青素和其他色素的含量,但还没有见到采用HPLC法分离检测雨生红球藻中各种色素含量的报道。作者建立了一种快速而准确地检测雨生红球藻中虾青素和其它类胡萝卜素含量的方法。

1实验部分

1.1主要仪器及试剂

高效液相色谱仪为W aters2690分离系统(美国W aters公司),M assL y nx色谱工作站。Pow erG en 700D组织匀浆机(美国Fisher Scientif ic公司),Biofu g e22R型低温高速离心机(德国Heraeus公司), 8892型超声波清洗机(美国Cole_Parmer公司),N AN O pure超纯水系统(美国Barnstead公司)。

甲醇为色谱纯试剂;二氯甲烷和丙酮为分析纯试剂,使用前用0.45L m的微孔滤膜(M illpore公司)过滤;所有实验用水均为超纯水。虾青素、斑蝥黄质(canthaxanthin)和B_胡萝卜素(B_carotene)等标准品均购自Si g ma公司,纯度在95%以上。

分别准确称取9.5m g虾青素、11.7m g斑蝥黄质和10.8m g B_胡萝卜素标准品,用甲醇-二氯甲烷(体积比3B1)溶液配制成100mg/L的储备液(超声波促进溶解),存放于棕色瓶中,保存在2~8e 冰箱,使用前配成合适含量的工作液用于液相色谱分析。

收稿日期:2002-08-07;修回日期:2003-05-16

基金项目:/十五0国家科技攻关项目(2002B A514A-10)

作者简介:陈勇(1973-),男,湖北利川人,助理研究员,博士研究生;李德发,联系人.

图1类胡萝卜素标准品的色谱图Fi g .1Chromato g ramof the carotenoids standards 1.astaxanth in ;2.canthax an thin; 3.B _caro tene

图2雨生红球藻中类胡萝卜素的色谱图Fig.2Chromato gram ofthe carotenoids in Haemato coccus pluv ialis 1.astaxanth in ;2.can thaxanth in ; 3.B _

caro tene

第4期陈勇等:测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量的高效液相色谱法29

1.2样品制备

取5mL 雨生红球藻培养物于10mL 试管中,3000g 低温(4e )离心15min,弃去上清液,藻细胞沉淀用超纯水洗3次,加入2mL 甲醇-二氯甲烷(体积比3B 1)提取液,在低温环境下(试管外冰水冷却)用高速组织匀浆机28000r/min 匀浆20s,匀浆液10000g 低温离心15min,将上清液转移至另一试管中。重复以上色素提取步骤3~5次,直至藻细胞中色素基本提取完全,细胞沉淀物变为灰白色为止。将所有收集的提取液10000g 再次低温离心15m in,取上清液保存于-20e ,待用。

1.3色谱条件

色谱柱为N ova_Pak C 18(300mm @3.9mm ID ,5L m,美国Waters 公司);流动相A 为水,流动相B 为丙酮,流动相C 为甲醇;洗脱梯度为:9%A ,15%B,76%C(0min);5%A,50%B,45%C(9min);4%A,58%B,38%C(15min);3%A,70%B,27%C(18min,保持至25min);100%B(27min,保持至28min);5%A,50%B,45%C(29min);9%A,15%B,76%C(30min)。流速为1.0mL/min;检测器为Waters996光电二极管阵列检测器;光谱扫描波长范围为250~700nm,积分定量用检测波长为476nm;进样量为30L L;自动进样系统样品盘温度4e ;柱箱温度为25e 。

2结果与讨论

2.1检测波长的选择雨生红球藻中含有多种色素,其各种组分的吸收峰在300~670nm 之间,但作者主要对其中几种类胡萝卜素进行定量检测,重点考察的组分为游离虾青素和虾青素酯。游离虾青素和虾青素酯的吸收峰在470~480nm 之间,而斑蝥黄质的吸收峰约为480nm,而其他类胡萝卜素在该波段也有较强的吸收[4]。根据对各色素吸收光谱的分析选用检测波长为476nm 。

2.2色谱分离情况

由于雨生红球藻中含有许多种类的类胡萝卜素,要在较短

的时间内将各组分完全分离是非常困难的。图1为虾青素、斑

蝥黄质和B _胡萝卜素混合标样的液相色谱图,图2为雨生红球

藻样品提取液的色谱图。从图1和图2可见,在本实验选定的

色谱条件下,标准品及雨生红球藻样品中的虾青素、多种类胡

萝卜素以及叶绿素都得到较好的分离,能满足研究和定量测定

实际样品中虾青素和多种类胡萝卜素的需要。

2.3主要组分的定性

雨生红球藻中含有大量的叶绿素和多种类胡萝卜素,但由

于条件所限,不能获得所有组分的标样。本法应用二极管阵列

检测器在波长范围250~700nm 进行光谱扫描,从而可根据组

分吸收的特征峰K max 对各个组分进行定位[4]。本系统中叶绿素

a 的吸收峰在431.8和663.8nm,叶绿素

b 的吸收峰在459.8和

646.8nm,叶黄素(lutein)的吸收峰在446.8和474.8nm,而多种

虾青素酯的K max 为478.8nm;叶绿素a 和叶绿素b 的保留时间

分别为14.89和10.54min,叶黄素的保留时间为6.99min,而

多种虾青素酯则在10~25min 内被洗脱出。在本法中应用的游

离虾青素标样中还分离出(3S ,3S c )_13_c is _astaxanthin 或(3S ,

3S c )_15_cis _astaxanthin(两者在本系统中无法鉴别,K max 为368.8

和466.8nm),其保留时间为7.24min 。2.4线性关系及检出限

用外标峰面积法测定线性关系。准确吸取一定体积的虾

青素、斑蝥黄质和B _胡萝卜素的标准储备液,配制成6

个各

30分析测试学报第22卷

组分质量浓度不同的混合标准样品。分别取30L L进样。由色谱工作站处理数据,以各类胡萝卜素的质量浓度X(m g/L)为横坐标,相应的峰面积(Y)为纵坐标,得到3条标准曲线:虾青素, Y=3439.24X+59,r=0.9993,线性区间为1.99~31.7mg/L;斑蝥黄质,Y=3689.24X+37, r=0.9987,线性区间为2.44~39.0mg/L;B_胡萝卜素,Y=542.44X+43,r=0.9778,线性区间为2.25~36.0m g/L。结果表明,在该实验条件下,这3种类胡萝卜素的质量浓度与响应值线性关系较好。

按信噪比(S/N)为3计算检出限。各组分的检出限质量浓度Q min(m g/L)按下式计算:Q min=Q@ 3@N/h(式中:Q为标样的质量浓度,m g/L;N为仪器噪声,L V;h为标样峰高,L V)。3种类胡萝卜

素的检出限分别为:虾青素3.56L g/L,斑蝥黄质1.36L g/L,B_胡萝卜素29.4L g/L。

2.5精密度实验

将一混合标准溶液平行测定6次,计算各组分的峰面积和保留时间的相对标准偏差(RS D),结果见表1。

表1方法的精密度(n=6)

T able1Precisio n of the method(n=6)

Co m po und

Retentio n tim e Peak area

(t R?s)/m in R SD s r/%(A?s)/104L V RS D s r/%

Astax anthin(虾青素) 5.55?0.13 2.3411.68?0.100.86

Canthax an thin(斑蝥黄质)10.01?0.060.6014.95?0.181.20

B_Caro tene(B_胡萝卜素)21.85?0.020.092.36?0.072.97

2.6回收率实验

回收率实验采用加标回收法。取同样的样品3份,分别加入已知量的虾青素、B_胡萝卜素和斑蝥黄质标准品,按照前述样品处理方法进行处理并测定,平均回收率见表2。

表2方法回收率(n=6)

Table2Recovery of the method(n=6)

Co m po und

Ori g inal Add ed F oun d R eco ver y RSD Q O/(m g#L-1)Q A/(m g#L-1)Q F/(m g#L-1)R/%s r/%

Canthax an thin(斑蝥黄质)12.49.759.63991.3

B_Carotene(B_胡萝卜素)7.329.008.66964.7

2.7标样及样品稳定性测定

由于虾青素等类胡萝卜素和叶绿素容易受光照、氧化及温度影响因结构变化而发生降解,故本实验研究了在该实验条件下样品的稳定性。将测定后的样品和混合标准溶液密封并避光保存在-20e冰箱中。于保存1~7、14和30d后测定样品中各组分的含量,计算各组分含量的变化率,结果表明:在保存1~5d内,各种组分含量变化均在?5%范围内;但5d以后各组分含量明显下降,其中游离虾青素含量、叶绿素的含量变化很大,甚至超过30%,而另外两种类胡萝卜素的含量变化在10%以内。所以,用本法测定雨生红球藻中色素的含量时,标样和样品溶液的保存时间最好不超过5d。

2.8雨生红球藻中虾青素及其它色素的测定

用该法对不同培养期(不同颜色)的雨生红球藻细胞中色素含量进行了分析,结果表明:培养早期(浅绿色)的藻细胞中叶绿素含量较高,而类胡萝卜素的含量很低,几乎检测不到游离虾青素和虾青素酯,可检测到微量的斑蝥黄质;培养中期(深绿色)的藻细胞中叶绿素含量很高,而类胡萝卜素含量则明显升高,可以检测到一定量的虾青素(3.47~ 6.59mg/L)、斑蝥黄质(0.89~ 3.21m g/L)和B_胡萝卜素(1.78~ 4.64m g/L);收获期(红褐色)的藻细胞类胡萝卜素的含量显著增加,其中游离虾青素(0.35~0.42m g/L)和虾青素酯(70.5~95.8m g/L)的含量可占类胡萝卜素总含量的78%~89%。

第4期陈勇等:测定雨生红球藻中虾青素及其它色素含量的高效液相色谱法31

参考文献:

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120-123,125.

Determ ination of Astaxanthin and Other Pi g m ents in Haem atococcus Pluv ialis

b y HPLC

CHEN Y ong1,L I D e_fa1*,L U Wen_qing1,PI AO Xiang_shu1,

Y AN G Wen_j un1,HUI Bo_di2,HA N Ya_shan2

(1.National Feed En g ineerin g T echnolo g y Research Center,Co lle g e of Animal Science and T echnolo g y,China A g ricultural

U niversit y,Bei j in g100094,China; 2.Colle g e of Food Science,China A g ricultural Universit y,Bei j in g100094,China)

Abstract:A gradient reversed_phase high perf ormance liquid chromatography(RP_HPLC)w as developed f or the se p aration of astaxanthin and other p i g ments from the p i g ment extracts of the microal g a Haem atococcus p luv ialis. Al g al cells w ere collected b y centrif u g in g the culture f luid at3000g for15min,homo g enized and extracted usin g the solvent mixture of methanol and dichloromethane(3B1by volume).Chromatographic separation w as perf ormed in Nova_Pak C18column(300mm@3.9mm ID,5L m)at25e with an eluent consisting of w ater,methanol and acetone at a f low rate of1.0mL/min,the eluate w as monitored by a photodiode array detector at476nm.Sep2 aration and identification of chloro p h y lls and multi p le carotenoids w ere com p leted in30min.The detection limits of astaxanthin,canthaxanthin and B_carotene w ere3.56,1.36and29.4L g/L,res p ectivel y.T he linear ran g es of astaxanthin,canthaxanthin and B_carotene w ere1.99~31.7m g/L(r=0.9993), 2.44~39.0m g/L(r= 0.9987)and2.25~36.0mg/L(r=0.9778),respectively.T his method is rapid,simple,precise and accu2 rate(RSD0.09%~2.97%,average recoveries96%~102%),and can be used for the quantification of astax2 anthin and other p i g ments in Haematoc oc cus Pluvialis.

K e y words:Haematoc oc cus p luv ialis;Astaxanthin;Carotenoid;Chloro p h y ll;HPL C

*Corres p o ndin g author

紫外分光光度法测定蛋白质含量

上海百贺仪器科技有限公司提供ｗｗｗ．ｓｏｕｔｈｈｋ．ｃｎ 紫外分光光度法测定蛋白质含量 摘要： 考马斯亮兰G250与蛋白质结合，在0－1000ug/ml范围内，于波长595nm 处的吸光度与蛋白质含量成正比，可用于蛋白质含量的测定。考马斯亮兰G250 与蛋白质结合迅速，结合产物在室温下10分钟内较为稳定，是一种较好的蛋白 质定量测定方法。 1.实验部分 1.1仪器与试剂： Labtech UV POWER紫外分光光度计；玻璃比色皿一套；考马斯亮蓝G250； 牛血清蛋白；超纯水。 1.2试液的制备： 牛血清蛋白标准溶液（1000ug/ml）的制备称取100mg牛血清蛋白置100ml 容量瓶中，加入超纯水溶解并定容。 考马斯亮兰G250试剂称取100mg考马斯亮兰G250，溶于50ml95％的乙 醇后，加入120ml85％的磷酸，用水稀释至1升。 2.结果与讨论 2.1校正曲线的绘制 准确吸取1000ug/ml牛血清蛋白标准溶液0.0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ml 分别加入到6只10ml试管中，然后用超纯水补充到0.1ml，各试管分别加入5ml 考马斯亮兰G250试剂，混合均匀后，即可依次在595nm处测定吸光度。以浓度 为横坐标，吸光度为纵坐标绘制校正曲线如下图，校正曲线方程为 A=0.613556C+0.001008，R=0.9994。

上海百贺仪器科技有限公司ｗｗｗ．ｓｏｕｔｈｈｋ．ｃｎ 2.2精密度 配制0.6mg/ml牛血清蛋白的考马斯亮兰溶液连续进样6次，得到吸光度的 相对标准偏差。 表1精密度测定结果 次数123456RSD% A0.26260.26220.26200.26280.26290.26260.13 2.3稳定性 取1mg/ml牛血清蛋白标准溶液每十分钟测定一次，50分钟内的吸光度变化 如下表2。 表2稳定度测定结果 时间（min）A1A2A3A平均 00.55110.55230.55160.5517 100.52040.51840.51680.5185 200.49100.49010.49030.4905 300.47650.47160.47210.4734 400.45240.44750.44400.4480 500.39820.39350.40310.3983 3.结论 该方法测定快速、简便，干扰物少，是目前灵敏度较高的蛋白质含量测定 的紫外分光光度法。

雨生红球藻提取虾青素永远健康

雨生红球藻提取虾青素永远健康2010年10月，中华人民共和国卫生部发布第17号公告，批准雨生红球藻为新资源食品，雨生红球藻作为添加剂，开始正式进入中国的食品、保健以及日化行业。雨生红球藻中的虾青素是类胡萝卜素的一种，也是迄今发现的类胡萝卜素合成的最高级别产物，在自然界具有最强的抗氧化性，因此被誉为21世纪抗氧化的革命性产品。 为什么我们会对大家讲一大堆雨生红球藻的东西，大家一定很疑问，其实呀也就是为了大家更深一步的了解天然虾青素。 天然虾青素世界第一品牌益康臻品艾诗特虾青素软胶囊是全球最畅销的人类营养用天然虾青素品牌，它是一款优质的膳食补充剂，具有超强抗氧化性和对人体的众多健康益处。并且天然虾青素是如今最理想的抗氧化清除自由基的新能源食品，艾诗特(益康臻品)系列虾青素由中国国内生产。荣获国家药监局批准的唯一蓝帽子。其生产微藻类产品已有27年的历史了，这期间不断优化生产技术，再加上优越的地理位置——夏威夷Kona岛岸边(洁净的天空、清洁的水源、长年稳定的光照、相对温和的气候都是微藻类最理想的天然培育厂)，这种环境下才能生产出单藻种、无污染的微藻产品。 雨生红球藻的地位以及品质，更不要说他对我们人体的作用和功效了。下面我们一起来看下： 天然虾青素对人体有8大强效作用: (一)对心脑血管的预防作用 天然虾青素在体内具有明显的提升好胆固醇,降低坏胆固醇的作用天然虾青素在体内具有明显的提升好胆固醇,降低坏胆固醇的作用。 (二)抑制糖尿病肾病 虾青素是迄今为止发现的唯一可以有效阻止糖尿病肾病损的物质,研究证实:8mg天然虾青素,8周时间可显著减少尿蛋白30%。 (三)廷缓衰老 天然虾青素又被称为“超级维生素E”,天然虾青素可保护皮肤免受紫外线辐射并能减少皮肤细纹的产生,同时提升皮肤的新陈代谢以及锁住皮肤的水分,让您的皮肤犹如婴儿般的幼滑、更有弹性、张力和润泽感以及延缓细胞衰老。 (四)缓解关节炎,关节疼痛 关节疼痛和关节炎通常是自由基导致的氧化损伤所致。虾青素较强的抗氧化特性有助于抑制自由基,减少其对关节的氧化损害。虾青素与92%的抗炎药物有同等的效果或效果更佳,却没有副作用。 (五)缓解运动疲劳 研究表明,虾青素作为一种抗氧化剂能抑制自由基对机体的氧化损害作用,还可以强化需氧代谢,增加肌肉力量和肌肉耐受力,迅速缓解运动疲劳,减轻剧烈运动后产生的迟发性肌肉疼痛。 (六)增强免疫力 虾青素能明显促进脾细胞产生抗体的能力,增强T细胞的作用,刺激体内免疫球蛋白的产生,虾青素具有重要的免疫调节作用。 选择天然虾青素没有错，当然前提是要认准雨生红球藻才能提取虾青素永远健康，现在选择我们益康臻品商城购买虾青素还可以享受上门送货货到付款，为了自己以后的生活，赶紧行动吧。

虾青素检测方法

虾青素分析方法 1.仪器：Agilent 1100 旋转蒸发器超声波 2.试剂：无水乙醇三氯甲烷正己烷（HPLC）丙酮（HPLC） 3.检测方法： 色谱柱：ZORBAX RX-SIL 4.6×250mm,5um 流动相：正己烷：丙酮=86：14 柱温：25℃ 检测波长：470nm（VWD） 流速：1.2ml/min 进样体积：20ul 4.溶液配制 供试品溶液： 精密称取虾青素（微粒）样品100mg，置于250ml容量瓶中，加5ml水，50℃水温超声10min，使样品完全溶解。冷却到室温，加100ml无水乙醇，用三氯甲烷定容。取一定量的溶液离心，转速2500/min，5min。移取上清液5ml于蒸馏烧瓶中，50℃旋转蒸发，残渣用4ml三氯甲烷溶解，移入50ml容量瓶中，并用正己烷定容。此溶液为供试品溶液。 标准品溶液： 精密称取虾青素对照品10.0mg，置于100ml容量瓶中，加10ml三氯甲烷，冷水超声溶解，加正己烷稀释至刻度，摇匀。移取此溶液5ml于50ml容量瓶中，加4ml三氯甲烷，用正己烷稀释至刻度，摇匀，此溶液为标准品溶液。 5.计算 虾青素含量＝样品峰面积×标准品质量×250×10×标准品含量×100％÷标准品峰面积÷样品质量÷100÷10

10%虾青素干粉的紫外检测方法 1.样品液配制 取待测样品100毫克干粉至250毫升棕色容量瓶中，加5毫升去离子水，在50摄氏度条件下超声溶解5min，冷却后，加100毫升无水乙醇摇匀，再用氯仿定容，过滤。取5毫升上述溶液至50毫升容量瓶中，再用氯仿定容至刻度。 2.虾青素空白溶液 用氯仿做空白。在474nm处测最大吸收值。 3.结果计算 C=A*2500/（1830*W） A为吸光系数 W为样品重量 虾青素晶体、油悬检测方法 1.样品液配制 取待测样品20毫克晶体（或油悬液60毫克）至100毫升棕色容量瓶中，加入10毫升氯仿溶解，加正己烷定容，摇匀，取1毫升上述溶液至100毫升容量瓶中，再用正己烷定容至刻度。 2.虾青素空白溶液 用正己烷做空白。在470nm处测最大吸收值。 3.结果计算 C=A*10000/（2100*W） A为吸光系数 W为样品重量

紫外-可见分光光度法测定有色溶液 (2)

紫外-可见分光光度法测有色溶液最大吸收波波长 一、实验目的 1.学习紫外-可见分光光度法的原理； 2.掌握紫外-可见分光光度法测定的实验技术； 3.了解掌握U-3010型紫外-可见分光光度仪的构造及使用方法。 二、实验原理 1.紫外-可见吸收光谱法(称紫外-可见分光光度法)以溶液中物质的分子或离 子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析法。根据最大吸收波长可做定性分析；根据朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）可做定量分析。紫外-可见分光光度法定性分析原理：根据吸收曲线中吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状进行定性分析。 2.紫外-可见分光光度法定量分析原理，根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入 射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。 3.仪器由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装 置。 三、仪器与试剂 日立U-3010型紫外-可见分光光度仪；吸量管；乙醇；待测溶液；烧杯等。 四、实验步骤 1.接通电源，启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器，预 热半小时。 2.在工作接口上选择测量项目为光谱扫描，设置扫描参数（起点：650nm，终 点：250nm，速度：中，间隔：1.0nm，单次扫描） 3.将两个均装有无水乙醇的1cm石英比色皿放入测量池中，进行基线扫描。 4.基线做好后，按下面的顺序进行操作：做Baseline→换样（换上待测样品置 于Sample池）→进入Analysis Method对相关的参数进行设定→Sample命名→Ready→Measure进行测量，寻找待测溶液的最大吸收波长，再在最大吸收波长处分别测定待测溶液的吸光度。

虾青素的最佳来源—密闭式培养的雨生红球藻

虾青素的最佳来源—密闭式培养的雨生红球藻 雨生红球藻（Haematococcus Pluvialis)又被叫做雨生血球藻，是一种普遍存在的藻类，这种藻类广泛存在于自然界中，从炎热的赤道到寒冷的北极雪域均有它的分布。在与雨生红球藻相关的文献中没有任何有毒性的报道。当前，雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物，因此，利用这种微藻提取虾青素无疑具有广阔的发展前景，已成为近年来国际上天然虾青素生产的研究热点。 雨生红球藻的生命力非常强，但是只有在特定的环境下，其藻体中才会生成虾青素，完成虾青素的积累。在积累虾青素的过程中对光照、温度以及生长环境的要求非常高，生长环境一旦不符合要求，雨生红球藻就会停止生成虾青素（Astaxanthin），甚至迅速的死亡。因此在雨生红球藻的人工培养中，如何对雨生红球藻的生长进行优良的控制，即其培养技术的要求一直是生产公司的优秀程度与否的很重要的评价指标。 在目前雨生红球藻的培养当中，世界上所有的公司采用的培养技术分为了两种，即Closed Incubation（密闭式培养）和Opening Incubation(开放式培养)两种。下面简单介绍一下这两种技术的一些特点。Opening Incubation(开放式培养)由于技术要求和成本低，对于培养环境的要求不是十分苛刻，因此能够进行大量化的培养，但是培养过程中无法保证其生长环境的稳定性，极易受到外来物种的污染和影响。

开放式培养红球藻虽然有成本低，易于大规模生产的优点，但由于其生产过程中的开放式的特点，极易受到外来物种的污染，导致其他微生物的繁殖，产生抑制甚至导致雨生红球藻种群的退化，使其成品的纯度无法达到满意的效果。并且由于在开放式培养的过程当中受到的外来物种的污染，由此方法培养出的红球藻粉经过萃取加工后的虾青素产品应用于一般食品及饮料上时，很难取除掉其他受污染的不纯物质的特有异味，影响添加虾青素的美味食品的开发。 Closed Incubation(密闭式培养)则不然，由于在培养的整个过程中采用了密闭容器，可以很好的阻止外来物种对雨生红球藻的侵蚀和影响，而且便于对培养环境的调节和控制。密闭式培养能为雨生红球藻提供稳定和优质的生长环境，其成品中虾青素的纯净度可以达到很高的程度。 由于在雨生红球藻的生长过程中对光源的要求很重要，因此密闭容器大多设计成造型特殊的透明密闭容器，也称为Photoreactor(光反应器)。容器的形状常设计成柱状、细管状、平板状、曲面板状等等，力求密闭容

ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验

ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验 1.实验目的 1.1 了解多功能酶标仪的应用范围和基本结构及其操作方法 1.2 掌握ORAC法测定虾青素抗氧化能力实验原理 2 实验原理： 2.1 仪器基本原理 酶标仪实际上就是一台变相的专用光电比色计或分光光度计。光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本，该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上。光电检测器将透射过待测标本后强弱不同的光信号转换成相应的电信号，电信号经前置放大、对数放大、模数转换等处理后，送入微处理器进行数据处理，转换成相应的浓度，最后由显示器和打印机输出结果。 2.2 ORAC实验原理 ORAC是氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity）的缩写，也被称为抗氧化能力指数，ORAC分析法中的自由基主要来源于偶氮化合物2，2'-偶氮-双-（2-脒基丙烷）氯化二氢[2，2'-azobis（2-amidinopropane）dihydrochloride，AAPH]热分解产生的过氧化氢自由基，也可以是芬顿( Fenton) 反应过程中产生的羟自由基，以荧光素钠（sodium flourescein，FL）为荧光探针，观察自由基与荧光探针作用后，探针荧光强度的衰退过程，以水溶性维生素E类似物( 6-hydro-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox) 作为抗氧化标准物质，检测体系中各种抗氧化剂延缓探针荧光强度衰退的能力，以此评价抗氧化剂的抗氧化能力。 3 仪器及试剂 3.1 仪器及配件 Enspire 多功能酶标仪，96孔荧光板 3.2 试剂 3.2.1 磷酸盐缓冲液的制备：精密量取适量磷酸，以高纯水稀释得到75 mmol/L 磷酸溶液；称取8.56 g磷酸氢二钾以高纯水500mL溶解，以磷酸溶液调pH 7.4，即得75 mmol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液。 3.2.2 AAPH溶液的制备：精密称取AAPH 207mg，以磷酸盐缓冲液溶解并定容至5 mL量瓶，即得浓度为153 mmol/L的AAPH溶液。 3.2.3 FL溶液的制备：精密称取FL 40 mg，以磷酸盐缓冲液溶解，制成4125 mmol/L的FL 溶液，记为FL母液a。精密吸取FL母液a 50uL置50 mL量瓶中，以上述缓冲液定容至刻度，记为FL母液b；FL母液a，b均于4℃冷藏。实验时精密吸取FL母液b500uL置25 mL 量瓶中，以上述缓冲液定容至刻度，即得8*10-5mmol/L的稀释液。 3.2.4 样品溶液的制备：精密称取虾青素样品适量，以甲醇溶解，配制成1mg/mL的化合物母液，继而以缓冲液稀释制成10，50，100ug/mL的化合物溶液。 4 实验内容 4.1 样品量效曲线的确定：精密吸取FL稀释液100uL于96孔荧光板中，随后加入不同浓度样品溶液50uL振荡5 min，37℃温育10min后迅速加入AAPH液50uL启动反应。以激发波长485 nm，发射波长535 nm进行测定并记录荧光值，反应过程中每隔1.5min测定一次荧光值（记为Fn）。以测定时间为横坐标，荧光值为纵坐标绘制不同浓度虾青素荧光衰变曲线。

常用紫外分光光度法测定蛋白质含量

6种方法测定蛋白质含量 一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法 样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1) 2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2) (nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3) 反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。 为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。 计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白 氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。 二、双缩脲法（biuret法） （一）实验原理 双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。 （二）试剂与器材 1. 试剂： （1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正

非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法与相关技术

本技术公开了非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，在室内培养和室外诱导培养之间，增加如下步骤：步骤一、改变培养条件，将室内培养得到的雨生红球藻游动营养细胞转变为不动营养细胞；步骤二、收集并浓缩步骤一中所得藻液，加入抗生素和/或防腐剂，低温冷藏；步骤三、除去冷藏后的藻液中的抗生素和/或防腐剂，加入稀释的培养基，在弱光照条件下通气培养，对所述不动营养细胞进行活化。本技术的方法能够在室外诱导培养中断的情况下，将室内培养的营养细胞进行浓缩储藏，在气候适宜的时候，将储藏的营养细胞快速活化并进行室外诱导培养，以大幅缩短整体培养周期，提高设备利用率和生产率，从而提高生产的稳定性。 权利要求书 1.非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，在室内培养和室外诱导培养之间，增加如下步骤： 步骤一、改变培养条件，将室内培养得到的雨生红球藻游动营养细胞转变为不动营养细胞；步骤二、收集并浓缩步骤一中所得藻液，加入抗生素和/或防腐剂，低温冷藏； 步骤三、除去冷藏后的藻液中的抗生素和/或防腐剂，加入稀释的培养基，在弱光照条件下通气培养，对所述不动营养细胞进行活化。 2.如权利要求1所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述室内培养具体为：将雨生红球藻藻种置于BG11培养基中进行培养，初始接种量为5～30万个细胞/ml，培养温度为15～25℃，白色荧光灯24小时连续单侧光照，光照强度为50～ 100μE/m2/s，pH为7.0～8.0，培养7～15天，游动营养细胞比例为80～100％。 3.如权利要求1所述的非连续性两步法培养雨生红球藻生产虾青素的方法，其特征在于，所述步骤一，具体为：将室内培养的温度提升至28-35℃和/或将pH提高至8.5-9.5，继续培养1-5

超声波诱变筛选虾青素高产菌株_刘艳

生物技术 虾青素（astaxanthin），是一种类胡萝卜素，化学名称为3，3′－二羟基－4，4′－二酮基－β，β′－胡萝卜素，又名虾黄素，虾黄质或龙虾壳色素。天然虾青素于自然界广泛的存在，尤其是在海洋环境中。大量研究证明，虾青素具有增强免疫力；抗衰老；降低心血管疾病和由化学因素诱发的癌症发病率；增加对有害生物的抵抗力；维护眼睛和中枢神经健康；抗氧化能力极强，增强肌肉力量和耐受力等重要的生理功能，而且对人体绝对安全。因此，虾青素在食品工业、饲料工业、化妆品工业、保健品和医药工业等方面具有广阔的应用前景[1-2]。本论文以CTD004为出发菌株，对其进行超声波诱变，提高了该菌生产虾青素的能力，采用这种传统的生物物理学方法，不但生产出的产品安全无毒副作用，而且可以提高虾青素产量。 １　材料与方法 １．１　材料与试剂 1.1.1　菌株　CTD004菌株（自命名，经初步鉴定属于假单胞菌属）：吉林农业大学发酵工程实验室。 1.1.2 培养基及试剂 1.1. 2.1　基础培养基　蛋白胨10.0 g，葡萄糖10.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，酵母膏2.0 g，定容至1 L蒸馏水中，pH 7.2～7.5，121℃，灭菌20 min。 1.1. 2.2　发酵培养基　蛋白胨10.0 g，可溶性淀粉10.0 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 1.0 g，酵母膏2.0 g，定容至1 L蒸馏水中，pH 7.2～7.5，121℃，灭菌20 min。 虾青素标准样品（购于Sigma公司），二甲基亚砜、氯仿、甲醇、冰醋酸、蛋白胨、葡萄糖、可溶性淀粉、酵母膏、KH2PO4、MgSO4·7H2O均为进口分装或国产分析纯。 １．２　方法 1.2.1　菌种超声波驯化和筛选　 1.2.1.1　菌悬浮液的制备　将出发菌株接种于固体培养基上，32℃培养16 h（种龄处于对数期），用接种环移一个虾青素菌落至无菌试管中（9 mL装有玻璃珠的生理盐水），振荡10 min 过滤，即得菌体悬浮液。 1.2.1.2　超声波驯化　取菌体悬浮液15 mL在20kHz，200 w，工作电压200 v的超声条件照射不同时间（2 min，1 min，30 s），按10倍系列稀释法稀释，分别取稀释倍数为l0-5、10-6、10-7 3个稀释度0.1mL涂布于平板上，培养120 h，挑取颜色较深的菌落扩大培养，重复上述操作3轮。 1.2.2　诱变筛选方案 第一轮诱变：以CTD004为出发菌株，经超声波诱变，在初筛平板上选出200株颜色较深的菌株，进行摇瓶复筛，选出5株发酵产青素良好的菌株进行第二轮诱变。 第二轮诱变：以第一轮所选5株为出发菌株，经超生波诱变，在初筛平板上，每株选出40株颜色较深的菌株，共200株颜色较深的菌株，进行药瓶复筛，选出5株发酵产青素良好的菌株进行第三轮诱变。 第三轮同上。 1.2.3　分析测定　标准曲线的绘制：精确称取0.1g虾青素样品，用混合破壁提取试剂定容至100 mL，分别取1 mL，2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL，7 mL，8 mL 加入8个100mL容量瓶内，定容摇匀，配置成浓度为0.01、 0.02、 0.03 、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg/mL，在480 nm下测定配制溶液的吸光度。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作曲线图，所得曲线即为虾青素的标准曲线，其标准曲线的方程为（Y=1.2786X-0.0088）。 胞内虾青素含量测定[3]：发酵液中虾青素的含量采用分光光度法进行测定，由于虾青素是一种细胞内色素，需要混合破壁提取试剂提取。甲醇与氯仿按体积比5：1配成试剂Ⅰ，冰醋酸与二甲基亚砜按体积比5：1配成试剂Ⅱ，将试剂Ⅰ与试剂Ⅱ按体积比3：1配成混合破壁试剂。50 mL发酵液经8 000 r/min离心10 min后，用蒸馏水洗两遍，离心得鲜菌体，搅拌后加入混合破壁试剂，环境温度为30℃。搅拌，于8 000 r/min离心10 min 得提取液，480 nm下，以混合破壁试剂作为参比液调零，测定其OD值。将OD值代入虾青素的标准曲线，即可算出发酵液中虾青素的含量。 ２　结果与分析 ２．１　不同超声波处理时间的诱变效应筛选　超声波对菌株CTD004有明显的致死效应，致死率随照射剂量增大而增大，短时间超声波处理会给筛选带来大量的工作量，而负突变较多的出现在偏高的剂量中，为保证有较高的筛选机率，因此选择死亡率在85%左右的超声波处理：处理时间为1 min。 超声波诱变筛选虾青素高产菌株 刘 艳1　李 佳2　冯 印1 （1　长春科技学院，长春　130000；　2　辽宁省粮食科学研究所，沈阳　110000） 摘　要　以CTD004为出发菌株，经超声波诱变，获得一株高产虾青素菌株，结果显示：此菌株在用20 kHz，200 w，工作电压200 v条件下处理30 s，虾青素的产量明显提高，诱变后虾青素产量为190.6 mg/L，比出发菌株增加了126.0 mg/L。经5次传代培养，虾青素产量稳定。 关键词　虾青素；超声波；诱变 中图分类号　Q 93 文献标志码　B 作者简介：刘艳（1981-），讲师，主要从事发酵工程方面的研究。 收稿日期：2013-09-12

紫外可见分光光度法含量测定

【含量测定】照紫外-可见分光光度法(附录V A)测定。 1.仪器与测定条件：室温：____℃相对湿度：____% 分析天平编号：；水浴锅编号：； 紫外可见分光光度计编号：； 2.对照品溶液的制备： 取西贝母碱对照品适量，精密称定，加三氯甲烷制成每1ml含_______mg的溶液，即得。 3. 供试品溶液的制备： 取本品粉末(过三号筛)约______g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液3ml，浸润1小时。加三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液40ml，置80℃水浴加热回流2小时，放冷，滤过，滤液置50ml量瓶中，用适量三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液洗涤药渣2～3次，洗液并入同一量瓶中，加三氯甲烷-甲醇(4：1)混合溶液至刻度，摇匀,即得。 4.标准曲线的制备： 精密量取对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、1.0ml，置25ml具塞试管中，分别补加三氯甲烷至10.0ml，精密加水5ml、再精密加0.05％溴甲酚绿缓冲液(取溴甲酚绿0.05g，用0.2mol／L氢氧化钠溶液6ml使溶解，加磷酸二氢钾1g，加水使溶解并稀释至100ml，即得)2ml，密塞，剧烈振摇，转移至分液漏斗中，放置30分钟。取三氯甲烷液，用干燥滤纸滤过，取续滤液，以相应的试剂为空白。 5.测定法： 照紫外-可见分光光度法(附录ⅤA），在nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含西贝母碱的重量，计算，即得。 6.结果与计算 6.1 标准曲线制备：

对照品批号 纯 度 S 对照品来源 干燥条件 对照品称重W 对(mg) 各浓度点稀释倍数f 对 溶液浓度C 对(ug/ml) 吸光度A 对 线性回归方程 A=( )C ＋/-（ ） r ＝（ ） 计算公式： W S C f ?= 对对对 C 对= 6.2 样品测定： 水分Q 取样量W 样（g ） 样品稀释倍数f 样 样品吸光度A 样 样品平均吸光度A 样 浓度C(ug/ml) 含量X （%） 平均含量X （%） 计算公式：() %100Q 110W f C X 6 ?-???= 样样 样 X 1= X 2= 7.本品按干燥品计算，含总生物碱以西贝母碱(C 27H 43NO 3)计，不得少于0.050％。 结果: 规定 检验人： 检验日期： 复核人： 复核日期:

影响雨生红球藻中虾青素的提取条件的研究_赵立艳

多糖的提取率与多糖在溶液中的溶解状态及分散度有关，溶解性和分散性越好，越容易从体系中析出，超临界ＣＯ２萃取脱除蒙古口蘑中的脂类及色素等脂溶性物质，提高了蒙古口蘑多糖的溶解性和分散性，降低其溶出阻力，多糖与水的接触面积及亲和力大幅度增加，从而提高了蒙古口蘑多糖的提取率。另外，由于超临界ＣＯ２萃取中压力变化及ＣＯ２的穿透作用可使细胞壁脆性增强，通透性提高，亦可使多糖溶出性增强，进而提高多糖的提取率［８］。利用乙醚和碱联合处理口蘑粉，对其脱脂只是一种简单的溶出作用，对胞壁无脆化及提高通透性效果，另外处理过程中对多糖成分产生一定程度的破坏，所以提取率增加幅度不大，产品亦有化学污染，且带有异味。 ３结 论 ３．１采用超临界ＣＯ２流体萃取技术脱除蒙古口蘑中脂类物质，具有高效、无污染、无萃取剂残留等优点，同时还具有脱色脱异味作用，对提高蒙古口蘑多糖的提取率及改善蒙古口蘑多糖的颜色和风味极为有利。 ３．２超临界ＣＯ２流体萃取最佳工艺条件为：萃取压力３０ＭＰａ，萃取温度４５℃，萃取时间６０ｍｉｎ，萃取剂流量２５Ｌ／ｈ，以此条件萃取脂类物质，萃取率为２．０６％。萃取后蒙古口蘑粉呈乳白色，风味纯正，粗脂肪含量０．０１％。 ３．３超临界ＣＯ２萃取处理蒙古口蘑粉后，其蒙古口蘑多糖的提取率为６．２４％，是未处理样及溶剂处理样的４．２和１．８倍。 参考文献： ［１］凌关庭．　保健食品原料手册［Ｍ］．　北京：　化学工业出版社，　２００２．　７－３３．［２］陈士瑜．　珍稀菇菌栽培与加工［Ｍ］．　北京：　金盾出版社，　２００３．　１２８－１５４．［３］张艳荣，　马福敏，　王大为．　超临界ＣＯ２萃取玉米皮纤维脂类物质的研究［Ｊ］．　食品科学，　２００５，　２６（６）：　１４９－１５１． ［４］李海平，　王硕．　滑菇多糖制备的研究［Ｊ］．　食品科学，　２００５，　２６（１）：　１４９－１５１． ［５］张镜澄．　超临界流体萃取［Ｍ］．　北京：　化学工业出版社，　２０００．　７－７７．［６］周泉诚，　吴谋成，　等．　超临界ＣＯ２萃取技术在油脂工业中的应用［Ｊ］．中国油脂，　２００３（３）．　１７－２０。 ［７］沈晓京，　赖炳森，　陈镇童，　等．　超临界萃取时间对植物药油脂产率及脂肪酸质量的影响［Ｊ］．　中国医药工业杂志，　２００２，　１１：　５３３－５３６。［８］王大为，　邵信儒，　张艳荣．　超临界ＣＯ２萃取对玉米醇溶蛋白提取率及水解度影响的研究［Ｊ］．　食品科学，　２００５，　２６（８）：　１６６－１７０． 影响雨生红球藻中虾青素的提取条件的研究 赵立艳，陈　芳，廖小军，吴继红，胡小松＊ （中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 １０００８３） 摘 要：冻干的雨生红球藻粉为原料，采用乙醇和乙酸乙酯混合溶剂进行虾青素酯的提取。Ｌ９（３３）正交试验筛选获得虾青素酯的最佳条件为：温度２５℃，提取时间为６ｈ，乙酸乙酯和乙醇的配比为１：２，固液比为１：１２０（ｇ／ｍｌ）。 对提取的虾青素酯进行皂化，分别研究了４℃和４０℃时碱的浓度及皂化时间对提取效果的影响。结果表明：０．０６ｍｏｌ／ＬＫＯＨ甲醇溶液于４℃皂化１２ｈ效果最好，从１００ｍｇ藻粉可以得到（５７５．８６±５．６８）μｇ虾青素单体。 关键词：皂化；雨生红球藻；虾青素；提取 Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ Ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｌｕｖｉａｌｉｓ ＺＨＡＯ　Ｌｉ－ｙａｎ，ＣＨＥＮ　Ｆａｎｇ，ＬＩＡＯ　Ｘｉａｏ－ｊｕｎ，ＷＵ　Ｊｉ－ｈｏｎｇ，ＨＵ　Ｘｉａｏ－ｓｏｎｇ＊（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，　Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ａｓｔａｘａｎｔｈｉｎ　ｅｓｔｅｒｓ　ｆｒｏｍ　ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｅｄ　ａｌｇａｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｗｅｒｅ：　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｉｘｅｄ 收稿日期：２００５－０６－２９ ＊通讯作者 基金项目：国家８６３专项课题项目资助课题（２００２ＡＡ２４８０１１） 作者简介：赵立艳（１９７７－），女，在读博士，主要从事天然产物的分离提取及性质研究。

雨生红球藻

ASTAPLANCTON COMPLEX 是两种协同互补的成份，来自同个微藻Haematococcus pluvialis－雨生红球藻，在不同培养环境下产生的两种不同的化学成份。 雨生红球藻是一个独特的“细胞工厂”，具有很强的新陈代谢可塑性，能依营养条件下生长周期的改变而重新分配细胞内的大分子成份来源。 ASTAPLANCTON COMPLEX 含有两种不同的活性成。 在化妆品中的在化妆品中的好处好处 ASTAPLANCTON G8和ASTAPLANCTON HA具有协同补充的抗氧化作用。 ASTAPLANCTON G8 能清除单线态氧。能同时清除以下物质： – 活性氧类物质 ROS – 活性羰基类物质 RCS 能提供皮肤细胞和其成份有效的保护作用，尤其是DNA和蛋白质。 ASTAPLANCTON HA能防止紫外诱导对皮肤的伤害，包括UVA和UVB。它的强效抗氧化作用是由于其含有的虾青素。 ASTAPLANCTON G8和ASTAPLANCTON HA作为一个独特的双系统，可以防止紫外诱导产生的皮肤破坏，改善皮肤由于活性氧类ROS和活性羰基类RCS引起的损伤。 ASTAPLANCTON COMPLEX是肌肤抗老化和防护的创新途径。 有效的双系统 高效的抗氧化防护体系 上海舜拓 ASTAPLANCTON G8 (绿色细胞抗氧化因子) 是萃取自最佳营养条件下 培养的绿色活性细胞。 这种水溶的活性成份 以海水做补充。 在配方中应加入到水相 中。 ASTAPLANCTON HA (红色细胞抗氧化因子)是萃取自外界诱导条件下，尤其是高强度光如阳光下，非活性状态下的红色细胞，其中积聚了虾青素(astaxanthin)。 海藻是在夏威夷培养，从植物油中选择性萃取得到：葵花籽油。 在配方中应加入到油相中。

虾青素试验方法

虾青素试验方法 警告----本产品对光敏感，在操作过程中应避光操作。三氯化锑-三氯甲烷溶液有强腐蚀性，在操作过程中应注意避免与皮肤接触，如不慎接触到皮肤，应立即用清水冲洗。 本标准所用的试剂和水，除非另有说明，均指分析纯试剂和符合GB/T6682中规定的三级水。 4.1 试剂和溶液 4.1.1 三氯甲烷。 4.1.2 无水乙醇。 4.1.3 BHT（2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚）。 4.1.4 三氯化锑-三氯甲烷溶液：称取1g三氯化锑用4ml三氯甲烷溶解即得（现配现用）。 4.2 仪器和设备 4.2.1 紫外-可见分光光度计。 4.2.2 分析天平。 4.2.3 超声波清洗器。 4.2.4 恒温水浴装置。 4.2.5 离心机（离心试管体积大于20ml）。 4.2.6 氮气吹干装置。 4.2.7 孔径为0.84mm的分析筛。 4.2.8 孔径为0.425mm的分析筛。 4.3 鉴别 4.3.1 取试样约10mg于试管中，加50℃-60℃热水1ml，于50℃-60℃热水浴中超声5min。冷至室温后，加入三氯甲烷（4.1.1）10ml并振摇30s，静置分层后，取三氯甲烷层溶液3ml与三氯化锑-三氯甲烷溶液（4.1.4）1ml反应，溶液应立即显蓝紫色。 4.3.2 取含量测定项（4.4.1）下的待测液，以三氯甲烷为空白，使用1cm的比色皿，于分光光度计上扫描波长200nm-600nm之间的吸收光谱，其最大吸收波长应在波长 484nm-490nm之间，光谱图参见附录A。 4.4 含量 4.4.1 测定 待测液：称取试样0.15g（精确至0.0002g），置于250ml棕色容量瓶中，加入BHT（4.1.3）约10mg，加入蒸馏水10ml，在50℃-60℃热水浴中超声5min，流水冷却至室温，加入无水乙醇（4.1.2）100ml和三氯甲烷100ml，于室温水浴中超声5min，用三氯甲烷稀释至刻度摇匀。取该溶液适量，置于具塞离心管中离心5min（转速为3000r/min），精密称取上层清液2ml于50ml棕色容量瓶中，将容量瓶置于约45℃的水浴中，用氮气流吹干，用三氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，即为待测液，应立即测定（于20min内完成测定）。 以三氯甲烷为空白，使用1cm的比色皿，在分光光度计上测定待测液在487nm 附近最大吸收波长处的吸光度。 4.4.2 计算

紫外分光光度法测定未知物

紫外分光光度法测定未知物 1.仪器 1.1紫外分光光度计（UV-1801型）；配石英比色皿（1cm）2个 1.2容量瓶（100mL）：10个；容量瓶（250mL）1个 1.3吸量管（10mL、5mL）：各1支 1.4移液管（20mL、25mL、50mL）：各1支 2.试剂 2.1标准溶液（1mg/mL）：维生素C、水杨酸、苯甲酸、山梨酸、邻二氮菲分别配成1mg/mL的标准溶液，作为储备液。 2.2未知液：浓度约为（40~60ug/mL）。（其必为给出的五种物质之一） 3.实验操作 3.1比色皿配套性检查 石英比色皿装蒸馏水，以一只比色皿为参比，在测定波长下调节透射比为100%，测定其余比色皿的透射比，其偏差应小于0.5%，可配成一套使用。 3.2未知物的定性分析 将五种标准储备液均稀释成10ug/mL的试液（配制方法由选手自定）。以蒸馏水为参比，于波长200~350nm范围内扫描五种溶液，绘制吸收曲线，根据所得到的吸收曲线对照标准谱图，确定被测物质的名称，并依据吸收曲线确定测定波长。五种标准物质溶液的吸收曲线参五种标准物质溶液的吸收曲线参五种标准物质溶液的吸收曲线参五种标准物质溶液的吸收曲线参考考考考附图附图附图附图。。。。 3.3未知物定量分析 根据未知液吸收曲线上测定波长处的吸光度，确定未知液的稀释倍数，并配制待测溶液3份，进行平行测定。 推荐方法 3.3.1维生素C含量的测定：准确吸取1mg/mL的维生素C标准储备液50.00mL，在250mL容量瓶中定容（此溶液的浓度为200ug/mL）。再分别准确移取1、2、4、6、8、10mL上述溶液，在100mL容量瓶中定容（浓度分别为2、4、8、12、16、20 ug/mL）。准确移取20.00mL维生素C未知液，在100mL容量瓶中定容，于

利用雨生红球藻生产虾青素的研究进展及其产业化现状

利用雨生红球藻生产虾青素的研究进展及其产业化现状 沈建新,韦金河 (江苏省农业科学院,江苏南京210014) 摘要:本文综述了国内外雨生红球藻培养及虾青素积累的研究进展,介绍了利用雨生红球藻生产虾青素的产业化现状,并对国内虾青素的产业化前景进行了展望,以期推动国内雨生红球藻生产虾青素的产业化进程。 关键词:虾青素;雨生红球藻;产业化 中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:1002-1302(2007)03-0196-04 (上接第195页) 的酯酶、过氧化物酶同工酶的影响也有待深入研究。参考文献: [1]于明革,杨洪强,刘高峰,等.壳聚糖对黄瓜萌芽种子及幼苗生理 生化特性的影响[J].山东农业大学学报:自然科学版,2004,35 (1):47-50. [2]王　洁.壳聚糖在绿色蔬菜生产上的应用[J].广西园艺,2004 (3):50-52. [3]盛彦清,陈繁忠,傅家谟,等.壳聚糖和黄腐酸在草菇中的应用试 验[J].中国食用菌,2003,23(5):20-21. [4]沈　萍,范秀荣,李广武.微生物学实验指导[M].北京:高等教 育出版社,1999:215. [5]王　艳.产壳聚糖酶菌株的初步筛选[J].中国微生态学杂志, 2003,15(5):259-261.[6]Ya mashita.Effect of chit osan-deacetylati on degree on the p r oduc2 ti on of chit ooligsaccharides by B acillus s p.Chit osanse[J].Kichin Kit osan Kenkyu,1999,5(2):148-149. [7]邱昌恩.6-BA对平菇和香菇菌丝体两种同工酶的影响[J].微 生物学杂志,2002,22(4):89-92. [8]王秀奇,秦淑媛,高天慧,等.基础生物化学实验[M].北京:高 等教育出版社,1999:227-232. [9]季维智,宿　兵.遗传多样性研究的原理与方法[M].杭州:浙 江科学技术出版社,1999:52-68. [10]赵　莉,曲延英,岳丕昌,等.新疆两种粉虱的酯酶和过氧化物 酶同工酶的比较研究[J].植物保护,2002,28(4):17-19. [11]朱宝成,王俊刚,燕克勤,等.紫孢侧耳、糙皮侧耳及其融合菌株 的同工酶分析[J].遗传,1995,17(4):37-39. [12]詹秋文,胡绪同.高粱与苏丹草酯酶同工酶分析[J].生物学杂 志,2005,22(4):18-20. 虾青素是一种类胡萝卜素含氧衍生物,呈鲜红色。它广泛存在于自然界中,也是海洋动物体内主要的类胡萝卜素之一。以往研究表明,虾青素具有强大的清除氧自由基的能力,其抗氧化性是类胡萝卜素的10倍、维生素E的550倍,被誉为“超级氧化剂”[1-2]。虾青素能够增加水生动物的着色;促进鱼卵受精,降低胚胎的死亡率,促进个体生长并加快成熟速度[3];提高母鸡产卵率,增加鸡蛋黄色素含量[4];提高人体免疫力,延缓皮肤衰老,维护眼睛及中枢神经系统健康等多种生理功能。虾青素具有广泛的应用价值,不仅可以用作水产养殖的饲料添加剂和人类食品添加剂,在药品、化妆品和营养保健品等领域也具有很大的应用潜力。 收稿日期:2007-05-14 作者简介:沈建新(1964—),男,江苏无锡人,副研究员,主要从事农业科技与财务管理工作。Tel:(025)84391488。 目前,虾青素的生产工艺主要有化学合成和生物提取两种。化学合成的虾青素在结构、功能及安全性等方面都不及天然的虾青素。动物和人体试验结果表明,天然虾青素没有任何致病效应或毒副作用,对人体绝对安全无害[5]。虾青素的生物来源主要有三种[6]:一是从甲壳类动物中提取。由于甲壳中含有较高水平的灰分和几丁质,较低水平的蛋白质和其他营养成分,这极大地限制了虾青素的提取和再利用。二是利用酵母菌生产虾青素。真菌中虾青素的含量很低,而且发酵成本也很高。三是利用藻类生产。雨生红球藻(Hae m a tococcus pluvialis)细胞内天然虾青素的含量相对较高。 据报道,在特定条件下,雨生红球藻可以积累占其干重1%以上的虾青素,且所含虾青素的结构与养殖对象所需一致,被公认为天然虾青素的最好生物来源[7]。因此,利用雨生红球藻生产虾青素已成为国内外虾青素研究的热点[8-9]。但是,利用雨生

紫外可见分光光度法实验

1.1 了解紫外可见分光光度计的食用方法及基本结构 1.2 掌握用紫外可见分光光光度法进行定性分析和定量分析的方法 2.实验原理 2.1 定性分析 不同物质的分子结构不同，因此各种物质各有其特征的紫外可见光吸收光谱。以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图，得到的曲线称为吸收光谱曲线，他能清楚的描述该物质对不同波长光的吸收情况。光吸收程度最大处叫做最大吸收波长，用λmax表示。浓度不同时，光吸收曲线的形状相同，最大吸收波长不变，只是相应的吸光度大小不同。说明吸收曲线的形状只与物质的本性有关，而与物质的浓度无关。因此，我们可以利用吸收曲线对物质进行定性分析。 2.2 定量分析 根据朗伯-比尔定律：A=εbc，式中A—吸光度，ε—摩尔吸光系数，b—液层厚度cm，c—浓度，mol/L 当液层厚度b固定时，吸光度正比于浓度，因此可采用标准曲线法对物质进行定量分析。通常选择最大吸收波长进行定量分析，以提高分析灵敏度和消除干扰影响。 3.仪器及试剂 3.1 仪器及配件 UV1800PC型紫外可见分光光度计，1cm石英比色池 3.2 试剂 3.2.1 虾青素标准溶液 3.2.1.1 标准储备液（浓度为1.0mg/mL） 称取10mg 虾青素标准品溶于二甲基亚砜（DMSO），定容至10mL，摇匀，避光-20℃保存。 3.2.1.2 标准系列溶液的配制 用移液管分别量取0.5，1.0，2.0，3.0mL标准储备液，分别用50mL容量瓶定容，稀释溶剂为无水乙醇，定容之后摇匀，避光放置。 3.2.2 未知浓度的虾青素样品溶液。 4.实验内容 4.1 不同浓度的虾青素溶液吸收曲线的比较。 4.2 标准曲线的制作。 4.3 样品溶液的测定。 5.仪器操作步骤 5.1 开机，自检，预热20分钟 5.2 放置样品 将配好的样品转入比色池，比色池要用蒸馏水和待测溶液润洗，溶液装至比色池的1/2~2/3左右。装好后用纸巾吸干比色池表面的液体，将比色池放入样品槽中，注意比色池透光面要对住样品槽有孔的一边。 5.3 全波长扫描 将不同浓度的标准品依次转入比色池中进行全波长扫描，比较其吸收曲线和最大吸收峰