脏器RNA提取方法的改进
RNA 提取是分子生物学研究中的一项常规操作,但是由于RNA 酶无处不在,获得完整的纯度高的RNA 并不容
易[1]。目前可从市场上获得各种RNA 提取试剂盒,且通常按照试剂盒说明书操作可以获得较为理想的结果,但对于一些样品尤其是代谢旺盛的组织,如肝脏、心脏、脾脏等使用RNA 提取试剂盒时,往往需要对操作步骤作一些摸索和改进[2]。笔者在提取猪脏器RNA 过程中利用TRIpure
Reagent RNA 提取试剂盒并对其操作说明作了相应的改进,还对改进前后RNA 在得率和纯度上的表现进行了比较。1
材料与方法
1.1材料
1.1.1脏器。4月龄健康大白公猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏,取样后立即放入液氮中保存以备用。
1.1.2试剂。TRIpure Reagent (百泰克生物技术有限公司生产),RevertAid TM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas),Taq DNA Polymerase (Fermentas),DL2000,β-actin (Sense 为5'ACTGCCGCATCCTCTTCCTC3',Antisense 为5'CTCCTGCT TGCTGATCCACATC3',产物长度为399bp )引物(上海生工合成)。
1.2操作程序按照试剂盒说明书进行,并对部分操作步骤做相应的改进。改进前:样品量为100mg ;加样后静置5min ;步骤3为4℃,10000×g 离心10min ,取上清液;步骤4和5为加氯仿离心取上层水相。改进后:样品量为10~20
mg ;加样后先上下温和振荡5min ,再静置10~15min ;步骤3同上,但重复2次;步骤4、5中,将取得的水再次离心取上清液。
1.3RNA 质量检测用琼脂糖凝胶电泳,紫外分光光度计和RT -PCR 扩增猪β-actin 基因检测RNA 质量。RNA 按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 说明书操作,合
成cDNA 第1链,扩增猪β-actin 基因,反应条件为:95℃10
min ,55.6℃1min ,95℃1min ,55.6℃1min ,72℃1min ,30
个循环,72℃10min ,4℃30min 。1.4数据处理用DPS v3.01专业版数据处理系统统计并
分析数据。
2结果与分析
2.1改进前后所提RNA 的完整性比较提取的RNA 经1%琼脂糖凝胶电泳后在紫外凝胶成像仪下照像,其结果见
图1。由图1可以看出,改进前猪脏器RNA 均有不同程度的降解,其中心脏组织样中的RNA 降解最为严重;改进后,1,2,3,4,5泳道在5,2,0.2kb 附近都可检测到3条清晰完整的28,18和5S 的rRNA 条带。这说明改进后提取的RNA 完整性好。
2.2
改进前后所提RNA 的纯度和得率比较改进前后猪
RNA 的纯度和得率见图2、3。在图3中,利用TRIpure Reagent 试剂盒提取RNA 的得率在5种脏器组织中的表现低于未改进的,且在0.01水平上有差异。但这并不表示操作方法的改进降低了试剂盒提取RNA 的得率,因为在图2中,操作方法的改进提高了RNA 的纯度,且与改进前在0.01水平上有差异。因此,图3中操作方法未改进时,计算得到如此高的RNA 提取量只是一种假象,这是因为样品中蛋白质和其他试剂污染造成样品的光密度增大所致。2.3改进后提取RNA 扩增猪茁蛳actin 基因的效果采用改进后的方法提取脏器总RNA ,RT -PCR 扩增猪β-actin 基因,其结果见图4。由图4可知,操作方法改进后提取的
作者简介贺江舟(1978-),男,陕西蓝田人,讲师,从事生物资源研究。收稿日期2006-06-15
脏器RNA 提取方法的改进
贺江舟
(塔里木大学生物研发中心,新疆阿拉尔843300)
摘要以猪脏器为材料,应用TRIpure Reagent 总RNA 提取试剂盒提取脏器总RNA ,发现直接按照试剂盒说明书操作提取的RNA 效果不理想。通过反复试验,改进了提取过程中的部分操作步骤。结果表明:改进后与改进前相比,提取RNA 的纯度和得率在0.01水平上有差异;改进后提取的RNA 经RT -PCR 扩增猪β-actin 基因,电泳结果显示,扩增条带清晰、特异,说明提取的RNA 完全满足后续分子生物学试验的要求。关键词脏器;RNA 提取;改进中图分类号Q593+.1文献标识码A 文章编号0517-6611(2006)20-5148-02Improvement of Extraction Method of Total RNA from Viscera HE Jiang 蛳zhou (Biological Technology Research &Development Center,Tarium University ,Alare,Xinjiang 843300)
Abstract In this study,commercial TRIpure Reagent Total RNA Extraction Kit was used in RNA extraction from porcine viscera samples.We found the result was not satisfied if the operation was followed according to the manufacturer's instruction completely.After repeated tests,some modifications were tentatively adopted.And the comparative experiment result showed the extracted RNA purity and yield were significantly improved (P <0.01)following the modified instruction.With these RNAs,β-actin was amplified and the electrophoresis result showed clear,specific and integral bands.This finding showed that the extracted RNA by modified method can meet the requirement of the molecular research.Key words Viscera;RNA extraction;Improvement
1
2
3
4
5
M
7
8
9
10
28S rRNA 18S rRNA 5S rRNA
注:1,2,3,4,5和6,7,8,9,10分别是改进后和改进前猪肝脏,脾脏,肺,心脏,肾组织提取的RNA ;M 是marker 。
图1改进前后提取RNA 的电泳结果
6
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2006,34(20):5148-5149责任编辑姜丽责任校对胡剑胜
0.501.001.502.002.500.00
注:**表示改进前后在0.01水平上有差异。图3同。
图2改进前后脏器组织RNA 的纯度
RNA 扩增β-actin 基因电泳条带明亮清晰,特异性强,可满
足后续相关的分子生物学操作要求。
3结论与讨论
脏器代谢旺盛,相对于其他组织而言,一方面其基因表
达丰度和蛋白含量较高;另一方面各种酶包括核糖核酸酶
的活性也高。因此有效的抑制核糖核酸酶活性和去除蛋白
质的污染是获得高质量脏器RNA 的关键[3]。由于脏器基因表达丰度高,试验中可适当减少样品量,在减少引入的内源RNA 酶和蛋白质含量的同时又能保证提取RNA 的得率。
提取过程中,温和震荡以及让裂解液和样品较长时间的接触有利于组织样的充分裂解和RNA 的完全释放,从而提高RNA 的提取量。重复离心有利于DNA 和蛋白质等杂质的分离去除,提高RNA 的纯度。通过对提取RNA 的得率、纯度和完整性的比较发现,对TRIpure Reagent 试剂盒操作作适当改进后,利用该试剂盒从猪脏器组织中获得的RNA ,其纯度和完整性都得到了显著的改善。此外,需要指出的是在评价RNA 提取质量时的得率、纯度、完整性这3个指标必须有机结合起来,否则不能得到准确的判断,如杂质污染引起OD 值增大会引起RNA 得率指标失真。
参考文献
[1]林明,张页,张沙,等.从血液中提取总RNA 的一种快速高效方法
[J].中国生物化学与分子生物学报,2002,18(6):786-787.
[2]房经贵,高志红,陶建敏.一种提取葡萄芽中总RNA 的方法[J].生物
技术,2003,13(2):24-25.
[3]付月君,张志云,柴宝峰,等.从棉铃虫体中提取总RNA 的一种有效
方法[J].生物技术通报,2003(5):40-42.
1
2
3
4
5
M
β-actin
图4茁蛳actin 基因的RT 蛳PCR 电泳图谱
注:M 为Marker ;1,2,3,4,5分别是肝,脾,肺,心,肾。
2.5005.0007.50012.5000.000
图3改进前后脏器组织RNA 的得率
贺江舟脏器RNA 提取方法的改进
3源卷20期
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