地塞米松对哮喘大鼠气道平滑肌细胞_省略_RK1_2mRNA表达水平的影响_徐妍
2009年5月第47卷第15期
支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，典型特征为可逆性气流受限和气道高反应性。然而许多研究表明，哮喘患者随着疾病的进展，其肺功能进行性恶化。说明哮喘气道持续性损伤导致了不可逆的气道结构改变，即发生了气道重塑[1]。其中，气道平滑肌细胞异常增殖在气道重塑中占有十分重要的地位。气道平滑肌细胞发生增生和肥大，造成气道壁的增厚，加重气道的狭窄，导致不可逆的气流受限及持续气道高反应，是哮喘治疗变得困难的因素之一。
丝裂原活化蛋白激酶（M APK）是与细胞增殖关系最为密切的一类细胞内信号转导蛋白酶，是细胞外信号与细胞核之间信
地塞米松对哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖及ERK1/2mRNA
表达水平的影响*
徐妍1#张焕萍2△
（1.山西医科大学；2.山西医科大学第一临床医学院呼吸内科，太原030001）
[摘要]目的探讨地塞米松对哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖及ASMCs上ERK1/2mRNA表达水平的影响。方法建立哮喘大鼠模型，取气道平滑肌细胞进行原代培养，实验分对照组、哮喘组、地塞米松干预组（终浓度为100nM）。采用流式细胞仪检测各组ASMCs增殖周期的变化。RT-PCR检测ASMCs上ERK1/2mRNA表达。结果与对照组相比，哮喘组S+G2/M期细胞所占比例明显增高，G0/G1期细胞所占比例明显减小（均P＜0.01）；与哮喘组相比，地塞米松干预组S+G2/M 期细胞所占比例明显降低，G0/G1期细胞所占比例明显增高（均P＜0.01）；干预组S+G2/M期细胞所占比例仍高于对照组（P＜0.01）。哮喘组ERK1/2mRNA表达量较对照组和干预组显著增加（均P＜0.01），干预组与对照组之间比较无差异（P＞
0.05）。结论哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖明显，ERK1/2mRNA表达上调，该结果提示细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）可
能参与了气道重塑中平滑肌细胞的增殖过程。地塞米松能下调哮喘大鼠ASMCs上ERK1/2mRNA的表达，能抑制气道重塑中平滑肌细胞的异常增殖。早期给予地塞米松干预可能延缓气道重塑的进程。
[关键词]地塞米松；细胞外信号调节蛋白激酶；气道平滑肌细胞；增殖
[中图分类号]R562.2[文献标识码]A[文章编号]1673-9701（2009）15-65-04
Effect of Dexamethasone on Airway Smooth Muscle Cells Proliferation and Expression of ERK1/2mRNA in Asthmatic Rats
XU Yan1ZHANG Huanping2
1.Shanxi Medical University；
2.Department of Respiration，The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan030001
[Abstract]Objective To investigate the effect of dexamethasone on airway smooth muscle cells proliferation and Expression of ERK1/2 mRNA in asthmatic rats.Methods After asthma model was made，Primary cultures of ASMCs were established for experiments，ASMCs were divided into3groups randomly：（1）control group；（2）asthmatic group；（3）dexamethasone intervened group（100nM）.proliferation of ASMCs were detected by flow cytometry.The expressions of ERK1/2mRNA were detected by RT-PCR.Results Compared with con-trol group，the percentage of cells at S+G2/M phase from asthmatic group was significantly increased，the percentage of cells at G0/G1phase was significantly decreased（P＜0.01）；compared with asthmatic group，the percentage of cells at S+G2/M phase from the dexamethasone intervened group was significantly decreased（P＜0.01），the percentage of cells at G0/G1phase was significantly increased（P＜0.01）；the percentage of cells at S+G2/M phase from the intervened group was higher than that in the control group（P＜0.01）.compared with the control group and the intervened group，the expression quantities of ERK1/2mRNA in asthmatic group was significantly increased （P＜0.01），the intervened group was not different from the control group（P＞0.05）.Conclusion The proliferation of ASMCs in chronic asthmatic rats was obvious，Expression of ERK1/2mRNA was up-regulated，ERK may take part in the process of airway smooth muscle cells proliferation in the airway remodeling of asthma.Dexamethasone may down-regulated Expression of ERK1/2mRNA in asthmatic air-way smooth muscle cells and inhibit airway smooth muscle cells abnormal proliferation.Early treatment with dexamethasone probably pre-vents the process of airway remodeling in asthma.
[Key Words]Dexamethasone；Extracellular signal-regulated kinase（ERK）；Airway smooth muscle cells（ASMCs）；Proliferation
*基金项目：山西省教育厅2005年山西省高校科技研究开发项目
（NO.20051001）
#山西医科大学硕士研究生
△通讯作者
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CHINA MODERN DOCTOR中国现代医生65
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号转导的共同通路。其中，细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）是M APK家族中的一个亚族，广泛参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生理病理过程，作为一个重要的第二信号转导通路影响ASM Cs 的增殖[2，3]。
糖皮质激素治疗是哮喘治疗指南推荐的方法，在哮喘治疗中的主要作用是抑制气道炎症反应。此外，许多研究表明，早期应用糖皮质激素可以防治气道重塑，有效地改善肺功能和气流受限。本课题在体实验表明，地塞米松能干预气道重塑中平滑肌的增殖过程，延缓气道重塑的进程[4]。地塞米松对体外原代培养的哮喘气道平滑肌细胞增殖及ASM Cs上ERK1/2mRNA表达的影响是本实验研究的重点内容。
1材料与方法
1.1主要材料和仪器
卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）、Ⅰ型胶原酶（collagenase）为美国Sigma公司产品；DM EM培养基（Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物所）；地塞米松针购自徐州莱恩药业有限公司；小鼠抗α平滑肌肌动蛋白（α-actin）单克隆抗体购自博士德公司；PCR引物、内参照三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物由上海生工生物工程公司合成，余为进口或国产试剂，分析纯。FACSort 型流式细胞仪（美国BD公司），PCR仪（M J Research CO，美国）。
1.2方法
1.2.1大鼠哮喘模型的建立健康雄性Wistar大鼠（合格证号：山医字第070101），体重约250g，由山西医科大学实验动物中心提供。适应性喂养1周后，第1天大鼠腹腔注射含100mg OVA 和200mg氢氧化铝的生理盐水1mL，同时腹腔注射百日咳杆菌疫苗1mL（约6×109个菌株）作为佐剂，第8天重复致敏1次，第15天开始激发，将大鼠置于特制玻璃容器内，用超声雾化器喷入2%OVA生理盐水50mL，激发30min，每天1次，激发2周。激发后大鼠出现烦躁、呛咳、呼吸加快及轻度紫绀等哮喘发作症状。对照组大鼠以等量生理盐水代替OVA注射，并雾化吸入生理盐水50mL2周。
1.2.2ASM Cs的分离、培养及鉴定参照Johnson等[5]的培养方法，上述大鼠腹腔注射25%乌拉坦（4mL/kg）麻醉后，开胸迅速取出肺脏置于预先冰浴的D-hanks’溶液，在解剖显微镜下仔细分离出叶支气管，并将支气管外膜剥离干净，刮除内皮，将获得的单层ASM在青霉素小瓶中剪成1mm×1mm的小块后，加入1g/L Ⅰ型胶原酶，37℃，5%CO2培养箱中消化1h后加入DM EM液，混匀后用金属滤网过滤，滤液置离心管内1000r/min离心6min。弃上清后，沉淀的细胞用含20%FBS、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL的DM EM培养液重悬，接种到培养瓶内，让细胞贴壁生长。原代培养的细胞生长约7～11d后融合0.25%胰蛋白酶消化传代，以含10%FBS、青霉素100U/mL、链霉素100U/mL的DM EM培养液传代培养，每3～5天换液1次，约4～5d细胞长满后传代，3～7代的细胞用于实验。小鼠平滑肌α-肌动蛋白（α-actin）免疫细胞化学染色鉴定ASM Cs。
1.2.3实验分组取第3～7代培养的大鼠气道平滑肌细胞，0.25%胰蛋白酶消化，台盼蓝染色法计数，细胞存活率大于97%。用含10%FBS的DM EM培养24h后，换无血清DM EM培养24h，使细胞生长同步于G0期，换用含10%FBS的DM EM液，随机分为3组：（1）对照组：培养的正常大鼠气道平滑肌细胞，每孔/瓶中不加任何干预；（2）哮喘组：培养的哮喘大鼠气道平滑肌细胞，每孔/瓶中不加任何干预；（3）地塞米松干预组：培养的哮喘大鼠气道平滑肌细胞，每孔/瓶中加入地塞米松（终浓度为100nM）[8]后，放入CO2培养箱中共培养12h。每4个复孔/瓶为一组，实验重复2次，数据为8孔/瓶的平均值。
1.2.4流式细胞仪分析ASM Cs细胞周期ASM Cs按106/mL的密度接种于100cm2的培养瓶中，培养、分组及加药如前述，收集的ASM Cs用PBS液配制成浓度为1×106个/mL的细胞悬液，用预冷的75%乙醇固定，加入RNA酶、碘化丙啶室温作用后，用流式细胞仪测定细胞周期变化。
1.2.5逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测ERK1/2mRNA表达水平（表1）
PCR反应条件：94℃预变性2min，94℃变性20s，56℃退火1min，72℃延伸30s，共进行32个循环，最后72℃延伸5min，扩增产物4℃保存。
扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，采用全自动图像分析仪对电泳结果进行分析：分别测定每一个目的基因及看家基因GAPDH的A值，取目的基因与GAPDH的A值的比值为目的基因的相对含量。
1.3统计学方法
应用统计分析软件包SPSS11.5进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（χ±s）表示。组间差异显著性检验采用方差分析，两两比较采用q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1细胞鉴定
在倒置显微镜下，经原代培养的ASM Cs呈梭形，有较长的突起，圆形的细胞核位于细胞中央，呈疏密相间、典型“峰和谷”生长状态。α-actin免疫细胞化学染色，反应产物呈棕黄色。97%细胞α-actin染色阳性，所培养的细胞为平滑肌细胞（图1）。
表1ERK1/2和GAPDH的引物序列、扩增产物片断
引物序列5′-3′产物片断（bp）ERK1/2
GAPDH
上游CTCAAGCCTTCCAACCTC
下游TTCCACGGCACCTTATTT
上游TGAACGGGAAGCTCACTGG
下游TCCACCACCCTGTTGCTGTA
380bp
307bp 图1大鼠气道平滑肌细胞α-actin免疫细胞化学染色法（250×）
·基础研究·
66中国现代医生CHINA MODERN DOCTOR
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2.2流式细胞仪分析ASMCs 细胞周期
与对照组ASM Cs 比较，哮喘组ASM Cs 的G 0/G 1期细胞所占比例明显减少（P ＜0.01），S+G 2/M 期细胞所占比例明显增高（P ＜0.01），处于有丝分裂期的细胞数目增多；地塞米松干预组的S+G 2/M 期细胞所占比例较哮喘组相比明显减少
（P ＜0.01），G 0/G 1期细胞所占比例明显增加（P ＜0.01）；干预组S+G 2/M 期细胞所占比例仍高于对照组（P ＜0.01），G 0/G 1期细胞所占比例两组之间比较无差异（P ＞0.05
），见表2和图2。2.3R T-PCR 检测ASMCs 的ER K1/2mR NA 表达量的变化
各组电泳图经扫描发现：哮喘组ERK1/2mRNA 表达量较对照组和干预组显著增加（均P ＜0.01），干预组与对照组之间比较无差异（P ＞0.05
），见表2、图3。3讨论
支气管哮喘是一种由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子
共同参与并相互作用的气道慢性炎症性疾病，其结果不仅导致气道炎症反复发作、持续性气道高反应性，还可引起气道重塑。主要表现为以下几个方面：（1）上皮损伤：气道慢性炎症反复存在导致上皮细胞损伤脱落，平滑肌层暴露；（2）基底膜增厚：可能与胶原Ⅰ、胶原Ⅲ及纤维粘连蛋白的沉积有关。严重的哮喘患者基底膜增厚为正常者的两倍；（3）平滑肌肥大与增生。其中气道
平滑肌细胞增殖在气道重塑中占有十分重要的地位，增殖的ASM Cs 使气道壁增厚，导致基础气道阻力增加和不可逆性气流受限的发生。
丝裂原活化蛋白激酶是广泛表达的丝氨酸和（或）苏氨酸蛋白激酶，是信号从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者。研究最多的哺乳动物细胞M APK 信号传导通路是ERK 通路，它是促进细胞增殖的一条重要的细胞信号传导途径[6]。细胞外的多种刺激均能激活ERK ，
ERK 被激活成p-ERK 后介导细胞生长、增殖、分化、凋亡等多种生理过程。研究发现ASM Cs 上存在ERK1/2mRNA 和蛋白的表达，ERK 信号通道参与大鼠ASM Cs
增殖的调控[7]。
糖皮质激素做为治疗哮喘的一线用药，不仅在抑制气道慢性炎症中发挥重要作用，而且早期使用糖皮质激素对防治气道重塑和改善肺功能是十分必要的。本实验通过建立大鼠哮喘模型，取气道平滑肌细胞进行原代培养，用地塞米松干预细胞生长，研究发现：与对照组相比，哮喘组G 0/G 1期细胞所占比例明显减少，S+G 2/M 期细胞所占比例明显增高，细胞内DNA 合成增加，处于有丝分裂期的细胞数目增多。与哮喘组相比，
地塞米松干预组的S+G 2/M 期细胞所占比例明显减少，细胞内DNA 合成减少，处于静止期和DNA 合成前期的细胞数目增多，
但干预组细胞增殖仍高于对照组。实验结果表明：地塞米松可使慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖减弱，处于增殖期的细胞数目减少。提示：地塞米松对体外培养的慢性哮喘气道平滑肌细胞有抑制增殖的作用。这与Stewart 的研究结果一致，地塞米松可抑制体外培养的气道平滑肌（ASM C ）增殖[8]。研究发现：ERK 通路是促进细胞增殖的一条重要的细胞信号转导途径，细胞外信号调节蛋白激酶作为这条通路的关键酶存在多种亚型，其中，ERK1/2主要分布在气道平滑肌细胞上[7]。本课题在体实验也表明ERK2mRNA 表达在
气道壁全层细胞胞浆均可见到，主要集中于支气管平滑肌细胞的胞浆。哮喘大鼠在变应原刺激下ERK2基因的转录水平及ERK1/2蛋白磷酸化水平皆升高，p-ERK1/2高表达进一步诱导其下游基因导致平滑肌的增殖，参与哮喘的气道重塑。本实验中RT-PCR 检测结果表明：哮喘组ERK1/2mRNA 表达量较对照组和干预组显著增加，干预组与对照组之间比较无统计学意义。提示：地塞米松下调哮喘气道平滑肌细胞上ERK1/2mRNA 表达。目前对糖皮质激素在气道重塑中的确切作用机制了解较少，地塞米松除了通过调节炎症反应间接的对气道重塑发生抑制作用外，还可以直接对在气道重塑中起重要作用的细胞、生长因子和细胞因子发生作用。地塞米松可能通过下调哮喘气道平滑肌细胞上ERK1/2mRNA 表达来降低ERK 的活性，从而抑制哮喘ASM Cs 的增殖。另外，地塞米松干预组S+G 2/M 期细胞所占比例仍高于对照组，提示ASM Cs 上还可能存在其它类型的促进细胞增殖的信号转导通道。
地塞米松下调哮喘大鼠气道平滑肌细胞上ERK1/2mRNA 的表达，抑制气道重塑中平滑肌细胞的增殖，早期给予地塞米松干预可能延缓气道重塑的进程。ERK 的活化在哮喘气道重塑中起着重要作用，抑制ERK 的活化可以阻止气道平滑肌增殖作
表2地塞米松对哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖及ERK1/2mRNA
表达的影响（χ±s ，n ＝8）
注：与哮喘组比较，#
P ＜0.01；与对照组比较，*P ＜0.01；与对照组比较，△
P ＞0.05
组别G 0/G 1（%）S+G 2/M （%）ERK1/2mRNA 对照组哮喘组干预组
F 值
73.27±2.20#45.12±1.81*71.34±1.62#△
551.898
26.74±2.20#54.64±1.57*28.66±1.62#*585.037
0.606±0.417#0.972±0.375*0.643±0.544#△
159.614
图3RT-PCR 检测大鼠气道平滑肌细胞中ERK1/2mRNA 表达
M ：marker ；A ：对照组；B ：哮喘组；C ：地塞米松干预组
（下转第７８页）
·基础研究·
图2流式细胞仪分析各组大鼠气道平滑肌细胞周期
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用，进一步研究ERK 在慢性哮喘发病机制中的作用，为临床防治哮喘气道重塑提供新的思路。
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（收稿日期：2009-03-02）
（上接第67页）
肽基因，在sf21细胞及甜菜夜蛾（Laphygmaexigua ）幼虫虫体中得到了抗菌活性。
4存在的问题
抗菌肽因其具有的广泛的生物学活性而显示了其在医学上
良好的应用前景，但由于抗菌肽在动物体内含量极微，从动物体内提取抗菌肽产量低、费时长、工艺复杂、费用昂贵，无法实现大规模生产，这成为制约抗菌肽进入实际应用的最大障碍。因此，化学合成和基因工程便成为获取抗菌肽的主要手段，但化学合成肽类成本较高，而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因，可能造成宿主的损伤而不能获得表达产物。以融合蛋白的形式表达抗菌肽基因虽然可以克服这一缺点，但仍有表达产物少的问题。因此，
如何提高抗菌肽的生产效率、降低成本是应用抗菌肽必须解决的问题。而且，与传统抗生素相比，抗菌肽的抗菌活性还不够理想。因而要获得高产量、高活力的抗菌肽就必须进一步研究抗菌肽的生产方式和抗菌肽分子的改造，从而使抗菌肽在医学领域有更好的发展前景。
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（收稿日期：2009-03-31）
·综述·
78中国现代医生CHINA MODERN DOCTOR
大鼠胰岛细胞原代培养
大鼠戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后,无菌取出胰腺,置于4℃Ｈａｎｋｓ液中,用眼科小剪刀将胰腺剪成1ｍｍ3大小的组织块,加入0.5ｇ·Ｌ-1胶原酶,37℃恒温水浴振荡消化15ｍｉｎ,将已消化至细颗粒状组织吸出,并用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化,余下未消化完全的组织加入少量37℃Ｈａｎｋｓ液,用粗口径吸管轻轻吹打,直至大部分组织被消化成细颗粒状,用大量4℃Ｈａｎｋｓ液终止消化。混合前后两部分的消化产物,用Ｈａｎｋｓ液低速离心洗涤3次后,将组织置于含100Ｕ·ｍｌ-1青霉素,100ｍｇ·Ｌ-1链霉素,11.1ｍｍｏｌ·Ｌ-1葡萄糖,10ｍｍｏｌ·Ｌ-1Ｈｅｐｅｓ和7%的胎牛血清的完全ＲＰＭＩ1640培养液中,用150目(108μｍ)尼龙筛网过滤,以除去未被消化的组织和结缔组织。将已分离好的胰岛细胞和细胞团,置于含上述培养液内的培养瓶内培养。24ｈ后,吸出未贴壁的细胞悬液,低速离心以收集细胞,显微镜下计数后,以每孔一定数量胰岛细胞团接种于24孔细胞培养板内,继续培养48ｈ后用于实验。 我分离胰岛细胞后,用DTZ染色,发现溶液中含有许多小颗粒,放入温箱中也未发生变化,镜下观察没有看到文献中所说的红染细胞。我是将100mg双硫腙粉末溶于10mlDMSO中，用滤纸过滤，用时用KRBB缓冲液稀释100倍。胰岛细胞分离是将成年大鼠胰腺用胶原Ⅴ酶消化后，过150目网取滤过液，再过400目网取网上细胞，加入L-DMEM培养。方法是我根据文献稍作改动后实施的。胰岛细胞分离和染色对于我都是第一次做，请高手指点一下。 溶液中如果有紫黑色小颗粒，那就是DTZ，过滤除的不净。没有红染的细胞就是没有胰岛啊。还有，我总觉得150目太密了，很多胰岛都滤不过去吧 大鼠胰岛细胞原代培养 一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15分钟，无菌取出胰脏，于冰冷无菌D-Hanks液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中，加入少量无菌D-Hanks液，用眼科剪剪成0.1-1.0mm3大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks液反复清洗8~10次，加入10倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05g胰蛋白酶(Sigma)，0.025g Ⅴ型胶原酶(Sigma，663U/mg)，0.05g葡萄糖，溶于100 mL无Ca2+、Mg2+的0.01mol/LPBS（pH值为7.4）溶液，用0.22μm微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10分钟后吸出上面酶液弃去，用无菌D-Hanks液将组织块清洗2~3次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤。此时组织块边缘模糊，再将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500rpm离心10分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks 悬浮，离心，重复1~2次，再用培养基洗2~3次，用培养基悬浮即得细胞悬液；将消化过的组织块重复消化5~6次至组织块消化完全，重复以上操作，合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24孔塑料培养板中，每孔1mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15小时后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。将新培养板中细胞培养48小时后，换新鲜配置的含有2.5ng/mL 的碘乙酸的培养基培养5小时，可除去绝大部分成纤维细胞，而胰岛细胞不受伤害，换不含碘乙酸的培养基洗2次，并换不含碘乙酸的培养基在37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养，每隔3天换培养液，获得单层胰岛细胞， 胰岛细胞移植的研究进展 人类至今已有100多年用移植方法治疗糖尿病的历史，胰岛细胞移植治疗糖尿病存在两个障碍：组织来源不足和免疫排斥反应。 一．胰岛细胞的来源
一氧化氮对气道平滑肌细胞钾通道的影响
·７０国外医学呼吸系统舒册２００２年第２２卷第２期 一氧化氮对气道平滑肌细胞钾通道的影响 Ｒ酤Ａ 华中科技大学同济医学院附属同济医院呼吸内科（武汉４３００３０）高亚东综述熊盛道徐永健审校 摘要一氧化氨可通过ｃＧＭＰ途径和ｃＧＭＰ非依赖性途径，作用于气道平滑肌上高电导钙依赖性钾通道的ａ亚单位，使通道蛋白磷酸化或共价修饰，开放概率增加。～氧化氨（ＮＯ）对其它钾通道也有类似作用。钾通道开放可使钾离子外流，细胞膜趋于复极化或超极化，从而降低平滑肌张力。深入了解ＮＯ开放钾通道的机制可能为哮喘的治疗提供新的途径。 关键词一氧化氮；气道平滑肌；钾通道 气道平滑肌（ＡＳＭ）是气道对外界刺激的主要效应器，ＡＳＭ细胞质量和数量的改变可能是气道高反应性的原因…。人类ＡＳＭ细胞膜上表达多种不同类型的钾通道，包括高电导钙依赖性钾通道（Ｂｋｅａ），４－氨基吡啶（４一ＡＰ）敏感的延迟整流钾通道（Ｋｄｒ）。ＡＴＰ敏感的钾通道（ＫＡｒｖ）等ＬｌＪ。这些通道参与ＡＳＭ细胞静息膜电位的形成，介导ＡＳＭ对舒张剂和收缩剂的反应。一氧化氮（ＮＯ）是一种主要的内皮依赖性舒张因子，参与多种生理、病理过程。除可调节ＡＳＭ张力外，还能抑制ＡＳＭ细胞的ＤＮＡ合成和细胞增殖，因而在质量和数量两方面影响ＡＳＭ的特性，在气道重塑中有重要意义＿２ｊ。ＮＯ通过多种细胞内信号转导途径降低气道平滑肌的张力，其中有两条途径涉及到激活钾通道１３』。本文就ＮＯ激活钾通道的特点及内在机制作一综述。 １ＮＯ对高电导钙依赖性钾通道的作用 １．１作用特点Ｎｏ可对多种不同组织和器官的平滑肌细胞钾通道产生作用。平滑肌细胞膜Ｂｋｃａ通道对膜电压和细胞内钙离子浓度变化敏感，膜去极化和细胞内钙离子浓度上升（钙火花）可激活钾通道，Ｋ＋短暂外流，使细胞膜复极化，从而抑制兴奋收缩耦联。因而，Ｂｋｃａ通道被看成是平滑肌张力的负反馈调节因子＿４一。ＮＯ主要影响ＡＳＭ细胞Ｂｋｃａ通道的开放概率，对单通道电导无影响Ｌ３，５Ｊ。Ｙａｍａｋａｇｅ等采用细胞吸附式膜片钳技术对急性分离的猪ＡｓＭ细胞研究发现，ＮＯ供体硝普钠可使Ｂｋ∞通道开放概率增加】３倍，单通道电流也有所增加，对电导无影响，其机制是使通道短开放事件增加，平均关闭时间下降；另一种ＮＯ供体ｓ亚硝基一Ｎ．乙酰青霉胺（ＳＮＡＰ）可显著松弛乙酰胆碱收缩后的人气管平精肌条，Ｂｋｃａ通道特异性抑制剂ＣｈＴＸ（ｃｈａｒｙｂｃｌｏｔｏｘｉｎ）和钾通道非特异性抑制剂四乙铵可显著削弱这种松弛作用，说明Ｎｏ对ＡＳＭ细胞的松弛反应是由钾通道介导的∞Ｊ。 除外源性ＮＯ外，内源性Ｎ０也可开放钾通道，这种作用可被一氧化氯合酶（Ｎｏｓ）抑制剂抑制。Ｅｌｌｉｓ等用组胺预先收缩豚鼠气管环，电场刺激下气管环内非肾上腺能非胆碱能神经元能释放Ｎｏ，松弛气管环；ＮＯＳ竞争性抑制剂Ｌ＿硝基一Ｎ一精氨酸（Ｌ—ＮＮＡ）可使实验组气管环最大松弛反应下降到对照组的（４１二９）％。／３ｋｃｍ通道特异性抑制剂ｉｂＴｘ（ｉｂｅｒｉｏｔｏｘｉｎ）下降到（２１ｉ８）％，联合应用Ｌ—ＮＮＡ和ｉｂＴｘ下降到（１ｉ１）％．说明内源性Ｎｏ部分通过Ｂｋｃａ通道发挥作用ＭＪ。在单通道水平，ＮＯＳ非竞争性抑制剂氮蓝四唑（ＮＢＴ）能可逆性抑制大鼠脑血管平滑肌细胞上Ｂｋｃａ通道的开放，其具体的作用机制尚不清楚‘“。目前还无Ｎｏｓ在单通道水平对气道平滑肌细胞Ｂｋｃａ通道作用的报道。 多种因素可影响ＮＯ对钾通道的开放作用。①胞外Ｋ＋浓度。狗股静脉平滑肌条分别用前列腺素Ｆ２ａ（ＰＧＦ２ａ）和氯化钾（６０ｎｖ－ｎ０１）收缩后，ＮＯ对氯化钾组的松弛作用明显低于ＰＧＦ２ａ组，说明ＮＯ的平滑肌松弛作用是通过钾通道起作用，降低细胞膜内外两侧的Ｋ＋浓度差可抑制钾通道活性【８Ｊ。②过氧化物的形成。ＮＯ在体内的半衰期很短，很快与超氧阴离子结合成过氧化理硝基，后者可逆性抑制平滑肌细胞的Ｂｋｃａ通道活性Ｌ９＿９。因此超氧化物歧化酶可能减少过氧化物的形成，延长ＮＯ半衰期，从而增强ＮＯ的钾通道开放作用。③温度也可能对ＮＯ的钾通道开放作用产生影响＿ｌ…。 Ｂｋｃａ通道在ＮＯ松弛ＡＳＭ中的地位还存在争议。Ａｂｄｅｒｒａｈｒｎａｎｅ等认为Ｂｋｃａ通道是ＡＳＭ细胞上最重要的一类钾通道，ＮＯ对ＡＳＭ的松弛作用５０％由Ｂｋｃａ介导…３。这与Ｅｌｌｉｓ等的研究是一致的。６Ｊ。而Ｃｏｒｏｒｎｐｔ等对人和豚鼠ＡＳＭ的研究却有不同发现２｜。ＣｈＴｘｌｌ００ｎＭ）、ｉｂＴｘ（１００、３００ｎＭ）和四乙铵（１ｍＭ）不影响或轻度抑制硝普钠对人支气管平滑肌的松弛作用，而ＣｈＴＸ（１００ｎＭ）和ｉｂＴｘ 万方数据
KATP通道开放剂对气道平滑肌细胞增殖表达及SOCS3／5免疫失衡的影响
KATP通道开放剂对气道平滑肌细胞增殖表达及SOCS3／5免疫失 衡的影响 目的研究ATP敏感性钾通道（KATP通道）开放剂对气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖过程的影响，以及细胞因子信号转导抑制蛋白3/5（SOCS3/5）表达变化与转化生长因子-β1（TGF-β1）分泌释放水平的关系。方法体外构建增殖型ASMCs原代培养细胞模型，分为ASMCs组、AngⅡ·ASMCs组、淋巴细胞（L）组、ASMCs+L组和AngⅡ·ASMCs+L组。Real-time PCR检测细胞中SOCS3 mRNA及SOCS5 mRNA表达的差异；ELISA法检测上清液中TGF-β1的释放水平。观察KATP通道开放剂尼可地尔（NCR）干预的影响。结果与ASMCs组比较，AngⅡ·ASMCs组TGF-β1的表达水平明显升高（P＜0.01）；NCR作用于细胞后各组ASMCs表达TGF-β1与格列本脲（GLI）比较明显减少（P＜0.05）。与ASMCs+L组比较，AngⅡ·ASMCs+L组SOCS3 mRNA表达增加，而SOCS5 mRNA表达减少（P＜0.05）。NCR可以下调SOCS3的表达，上调SOCS5的表达。结论KATP通道开放可以通过抑制ASMCs增殖而调控TGF-β1分泌表达；SOCS3和SOCS5可能是哮喘气道重塑的特异性免疫治疗中的重要靶点。 标签：KATP通道开放剂；气道平滑肌细胞；细胞因子信号转导抑制因子；哮喘 细胞因子信号转导抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）是近年来新发现的一类负向调节因子[1]，参与多种细胞因子信号转导过程，其中SOCS3和SOCS5作为SOCS家族的重要成员，可能与哮喘等免疫性疾病的发生、发展有关，并有望成为这类疾病的治疗靶点。有研究说明[2]，ATP敏感性钾通道（KATP通道）开放剂对哮喘的气道重塑可以产生有益的作用，其机制尚未见系统性的研究报道。本研究利用在体外原代培养的哮喘大鼠气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs），建立增殖型ASMCs模型，探索KATP 通道开放剂的作用是否与逆转气道平滑肌细胞增殖有关，以及对SOCS3/5免疫失衡的影响，为治疗哮喘等免疫失衡疾病建立新的方法提供理论基础。 1 材料与方法 1.1 实验材料 淋巴细胞分离液，购自碧云天；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记羊抗兔二抗，购自武汉博士德生物工程有限公司；α-肌动蛋白（α-SMA）单抗，购自Boster；SOCS3/5引物，上海生工；大鼠转化生长因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）ELISA试剂盒，购自伊莱瑞特生物科技有限公司；高糖DMEM培养基，购自美国Gbico BRL公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）注射液，浙江仙据制药股份有限公司；尼可地尔（nicorandil，NCR），日本Tohoku Nipro医药公司；血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）、Ⅰ型胶原酶（collagenase Ⅰ）、格列本脲（glibenclamide，GLI）均购自Sigma公司。
小鼠脑动脉血管平滑肌细胞使用说明
小鼠脑动脉血管平滑肌细胞 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞产品说明： 为使能尽快开展实验，派瑞金发货的原代细胞均处于对数生长期，且每次发货为汇合率达到70%的细胞，收到细胞后即可开展实验。 派瑞金提供的小鼠脑动脉血管平滑肌细胞取自新鲜的组织，按照标准操作流程分离培养。研发的小鼠脑动脉血管平滑肌细胞完全培养基能提供细胞最佳的生长条件，降低杂细胞污染，保证不同批次间细胞质量的稳定。 同时，派瑞金还建立了严格的细胞鉴定流程，所提供的原代细胞均需经过细胞类型特异性标记物、细胞形态学等检测，保证细胞纯度在90%以上；同时也需经过微生物检测，保证不含有HIV、HBV、HCV、支原体、真菌及其他类型的细菌。 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞注意事项： 1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和我们联系。 2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等。 3. 请用相同条件的培养基用于细胞培养。培养瓶内多余的培养基可收集备用，细胞传代时可以一定比例和自备的培养基混合，使细胞逐渐适应培养条件;建议使用派瑞金的完全培养基。 4. 建议收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态。 5. 该细胞只能用于科研，不得用于临床应用。 小鼠脑动脉血管平滑肌细胞其他相关小鼠原代细胞： 小鼠小肠粘膜上皮细胞小鼠大隐静脉平滑肌细胞 小鼠肺微血管内皮细胞小鼠冠状动脉平滑肌细胞 小鼠肺血管平滑肌细胞小鼠大隐静脉内皮细胞 小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞小鼠冠状动脉内皮细胞 小鼠气管上皮细胞小鼠骨细胞 小鼠气管平滑肌细胞小鼠滑膜细胞 小鼠肺成纤维细胞小鼠骨骼肌细胞 小鼠支气管上皮细胞小鼠表皮细胞 小鼠支气管成纤维细胞小鼠真皮成纤维细胞 小鼠肺大静脉平滑肌细胞小鼠破骨细胞 小鼠肺大动脉平滑肌细胞小鼠皮肤肥大细胞
PGE2对气道平滑肌细胞分泌和凋亡影响的研究
四论著四 D O I :10.3760/c m a .j .i s s n .1673-436X.2012.018.003基金项目:浙江自然科学基金立项课题(Y 2110862),金华市科技局立项重点课题(2011-3-019)作者单位:321007金华职业技术学院医学院分子生物中心实验室 通信作者:胡野,E m a i l :h u y e 2580@s i n a .c o m P G E 2对气道平滑肌细胞分泌和凋亡影响的研究应延风 陈浩浩 金耀建 屠平光 胡野 ?摘要? 目的 前列腺素E 2(p r o s t a g l a n d i nE 2,P G E 2)通过调控气道平滑肌细胞(a i r w a y s m o o t h m u s c l e c e l l s ,A S M C s )的迁移二分泌二增殖功能,对哮喘气道重塑有关键性影响三研究P G E 2对A S M C s 凋亡及其分泌白介素4(i n t e r l e u k i n4,I L -4)二白介素10(i n t e r l e u k i n10,I L -10)和γ-干扰素(i n t e r f e r o n -γ,I F N -γ)的影响,对阐明P G E 2通过调控A S M C s 分泌T h 1/T h 2细胞因子对气道炎症发挥作用机制有重要意义三方法 用大鼠气道平滑肌细胞株与终浓度为10-9~10-6的P G E 2共培养2 4h ,分6组,共4个浓度梯度三用A n n e x i nV -E G F P /P I 双染细胞凋亡检测试剂盒在流式细胞仪测定凋亡率,同时用I L -4二I L -10和I F N -γE L I S A 试剂盒在酶标仪检测其浓度三每4个复孔为1组, 实验重复2次,数据为8孔的平均值三结果 应用不同浓度的P G E 2后A S M C s 各组细胞凋亡率与对照组相比无明显变化三但I L 分泌与P G E 2有显著的量效关系,I L -4和I L -10随P G E 2浓度下降而分泌量显著下降,但I F N -γ随P G E 2浓度下降而分泌量呈升高趋势,两者呈分离现象(空白对照二阴性对照二10-9P G E 2二10-8P G E 2二10-7P G E 2二10-6P G E 2组, I L -4分别为6.77?1.58二9.24?2.45二38.17?11.33二29.27?11.12二26.05?9.49二21.11?7.21;I L -10为4.8?1.06二6.35?2.11二71.89?12.03二43.68?11.25二28.89?8.75二24.31?6.67;I F N -γ 为2.17?1.97二3.25?1.48二10.63?4.75二13.4?5.57二15.47?6.16二19.54?6.35)三结论 P G E 2能调 控A S M C s 分泌细胞因子,随着浓度梯度增加能促进T h 1型细胞因子I F N -γ分泌,同时抑制T h 2型细胞 因子I L -4二I L -10分泌,但对A S M C s 凋亡无显著影响三认为在正常状态下P G E 2的分泌与维持气道内 T h 1/T h 2的平衡有关三?关键词? 气道平滑肌细胞;前列腺素E 2;白介素;γ-干扰素;凋亡E f f e c t o fP G E 2o n s e c r e t i o n f u n c t i o na n d a p o p t o s i s o f a i r w a y s m o o t hm u s c l e c e l l s Y I N GY a n -f e n g ,C H E N H a o -h a o ,J I N Y a o -j i a n ,T U P i n g -g u a n g ,HU Y e .D e p a r t m e n t o f M o l e c u l a r B i o l o g y C e n t r a l L a b o r a t o r y ,J i n h u aC o l l e g e o f P r o f e s s i o n a l a n dT e c h n o l o g y ,J i n h u a 321007,C h i n a C o r r e s p o n d i n g a u t h o r :HUY e ,E m a i l :h u y e 2580@s i n a .c o m ?A b s t r a c t ? O b j e c t i v e A i r w a y r e m o d e l i n g i sc l o s e l y r e l a t e dt o m i g r a t i o n ,p r o l i f e r a t i o n ,s e c r e t i o n f u n c t i o no f a i r w a y s m o o t h m u s c l ec e l l s (A S M C s ).P r o s t a g l a n d i nE 2(P G E 2) h a v ear e g u l a t o r y r o l e i n t h e s e f u n c t i o n s .T oc u l t u r e w i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n g r a d i e n to fP G E 2a n d A S M C si nv i t r oa n dt o s t u d y A S M C s s e c r e t i o nf u n c t i o n so f i n t e r l e u k i n4(I L -4)a n di n t e r l e u k i n10(I L -10)a n dI n t e r f e r o n -γ(I F N -γ),a n d a p o p t o s i s o fA S M C s ,t h i s i s f a v o r a b l e t ou n d e r s t a n dA S M C s i mm u n e r e g u l a t i o nm e c h a n i s m i na s t h m a ,a n d t h e r e g u l a t i o nr o l eo fP G E 2.M e t h o d s T h e r a t a i r w a y s m o o t h m u s c l e c e l l s a n d t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o no f 10-9~10-6P G E 2w e r e c u l t u r e d f o r 24h o u r s ,d i v i d e d i n t o 6 g r o u p s ,a n d 4c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t .F l o w c y t o m e t r i c w e r e u s e d d e t e r m i n a t i o n o fa p o p t o s i s w i t h A n n e x i n V -E G F P /P I d o u b l e s t a i n i n g a p o p t o s i s d e t e c t i o nk i t ,U n i t e dS t a t e sB i o -R a d680e n z y m em a r k i n s t r u m e n tw e r eu s e dd e t e c t i o n o f i t s c o n c e n t r a t i o nw i t h I L -10,I L -4,I F N -γE L I S Ak i t .4c o m p l e xh o l e s i n t o1g r o u p s ,t h e e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d2t i m e s ,a v e r a g e d a t a f o r 8h o l e s .R e s u l t s T h e r ew e r e n o s i g n i f i c a n t c h a n g e s i nA S M C s c e l l a p o p t o s i s r a t e a f t e r a p p l i c a t i o no f t h e d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o fP G E 2c o m p a r e dw i t h t h e c o n t r o l g r o u p .B u t i n t e r l e u k i n s e c r e t i o n a n dP G E 2h a s s i g n i f i c a n t d o s e -e f f e c t r e l a t i o n s h i p .W h e nP G E 2c o n c e n t r a t i o nw e r e d e c r e a s e d ,t h e s e c r e t i o n o f I L -4a n d I L -10d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y ,b u t t h e I F N -γs e c r e t i o nw a s i n c r e a s e d .四 3731四国际呼吸杂志2012年9月第32卷第18期 I n t JR e s p i r ,S e p t e m b e r 2012,V o l .32,N o .18
肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程
肺动脉平滑肌细胞原代培养操作流程 1、健康雄性SD大鼠一只，4周大，重约200g。 2、 75％消毒用酒精2瓶，无菌0.01MPBS溶液500ml，DMEM培养基100ml（含20%胎 牛血清、20万IU/L青霉素、20万IU/L链霉素）。 3、解剖板1个（含4条固定用绳子），1L烧杯1个，培养皿2个，培养瓶1个，1ml吸管3根，弯头吹打管3根，眼科剪3把，眼科镊3把，解剖镊3把，止血钳4把，手术刀1把，刀片若干，吸头若干、棉签纱布若干，口罩帽子及无菌手套若干。 二、操作步骤 1、洗手，戴口罩帽子及手套。 2、酒精喷洒并擦拭生物安全柜1，放入培养皿1个（倒入PBS并盖好）、手术刀1把、组织剪1把、止血钳4把及纱布若干（均经蒸汽灭菌消毒）。 3、处死大鼠（断颈法），完全浸泡于盛有75%的1L烧杯中3min，换手套，取出大鼠，固定于解剖板上，放入生物安全柜1，打开紫灯消毒30min。 4、酒精喷洒并擦拭生物安全柜2，于左侧放培养瓶、吸管及弯头吸管，眼科剪3把，眼科镊3把，中间放培养皿4个（打开，共8个，其中5个倒入PBS），以上物品均经蒸汽消毒灭菌，除培养皿外均应装入消毒饭盒内防止污染。左侧放解剖镊1把（泡入酒精中，取吸管时用）。打开紫灯消毒30min。 5、打开生物安全柜1，开吹风机10min，再一次消毒老鼠。 6、换手套，用手术刀、止血钳、解剖镊、组织剪等开胸，取出完整的心肺组织放入培养皿内，盖好。 7、打开生物安全柜2，开吹风机10min，放入装有心肺培养皿。 8、换手套，用眼科剪眼科镊仔细分离出肺动脉。 9、将取出的肺动脉（长约0.5cm）放入无PBS的培养基中，去除纤维外膜，用眼科剪将其剖开，用PBS冲洗3次至无血迹，（原则上还应刮除肺动脉内皮细胞，但因组织太小不好操作，且内皮细胞在M199培养基中不易生长，故此操作可省略）。 10、在无PBS的培养皿中将肺动脉剪成1mm3大小的组织块（剪碎的组织块常粘在一起，故应用十分锋利的眼科剪才好操作）。 11、用弯头吹打管将剪好的组织块放入培养瓶的底部，分散成1cm2/块（注意培养瓶应干燥，事先不加入PBS或培养液）。 12、旋紧瓶盖，放入37度的孵箱中1.5到2小时。 13、取出培养瓶，翻转，使贴有组织的底面朝上，背面向下。于背面注入M199培养液5-7ml，再缓慢翻转培养瓶，使组织块浸入培养液中（此时会有一些组织块漂起来，故动作应十分轻柔，只要有一块组织贴壁，就有成功的希望）。 14、将培养瓶放入37度、5%CO2的孵箱中培养，3-5天换液一次。 15、一般7天左右可观察到细胞从组织块周围长出，如超过10天未见细胞生长则试验失败。 三、注意事项 1、应树立外科无菌术的观点，严格无菌操作，勤换手套，否则试验不易成功。 2、生物安全柜内严禁使用酒精灯，因其会干扰正常气流，反而不利于无菌操作，并有引发火灾的危险。 3、一只老鼠可作2-4个培养瓶。建议1天只做1只老鼠，连做3-4天，本人也是到了第3、4只老鼠才成功。 4、培养液应当选择比较好的。我用的是：M199培养基（美国Hyclone公司、液体、500ml/瓶），胎牛血清含量应为15%（Hyclone公司、原装进口、500ml/瓶，1680元，自己分装），青霉素、链霉素均为20万IU/L。
大鼠二型糖尿病造模方法
大鼠二型糖尿病造模方法 Prepared on 22 November 2020
大鼠2型糖尿病模型建立方法讨论 专业：药理班级：六班姓名：刘畅学号：150517 摘要：据国际糖尿病联合会（InternationalDiabetesFederation，IDF）估计，现在全球约%的成年人患有糖尿病。到2035年，该病患者人数预计会上升至亿。在2013年，全球约有亿成年人患有糖尿病，中国的糖尿病患者人数居全球之首，调查统计人数为亿。糖尿病导致约510万人死亡，平均大约每6秒钟就有1人死于糖尿病。2012年1月9日，中国健康教育中心公布的“中国慢病监测及糖尿病专题调查”结果显示，我国18岁及以上居民糖尿病患病率为2。6%，60岁以上老年人患病率高达%。因此，为治疗糖尿病建立简单、稳定、经济的动物模型非常重要。因2型糖尿病患者人数占糖尿病患病人数的90%以上，本文主要综合讨论高糖高脂饲料联合链脲佐菌素大鼠2型糖尿病模型的建立方法和注意事项。得出结果为：使用体重在190g~240g之间的雄性SD大鼠，通过连续两次腹腔注射小剂量链脲佐菌素并辅以去抗氧化剂处理，合理饲养并通过尾静脉采血方法建立的2型糖尿病模型较理想。 关键词：2型糖尿病，SD大鼠模型，链脲佐菌素STZ， 糖尿病（diabetes）是一种以胰岛素分泌缺陷和胰岛素作用不足所致的以高血糖为特征的葡萄糖、蛋白质、脂质代谢紊乱的综合征，基本治疗方案包括饮食治疗、运动治疗、药物治疗、糖尿病监测及糖尿病教育。病因主要有遗传因素、病毒感染、肥胖等，临床表现为“三多一少”即多尿、多饮、多食和体重减轻。长期的高血糖最终会引起很多严重的并发症，包括心脑血管疾病、糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变，糖尿病肾病、糖尿病足、感染、糖尿病酮症酸中毒、高渗性昏迷等[1]。 糖尿病分为1型糖尿病（Type1diabetes）和2型糖尿病 （Type2diabetes）两种，1型患者因自身免疫β细胞破坏所致，每日胰岛素分泌量非常少，空腹基值及糖刺激后峰值均明显低于正常值，表现为绝对分泌不足。2型糖尿病细分为两类：体重正常患者胰岛素分泌量低于正常人，糖刺激后峰值低并且延迟出现；肥胖糖尿病人胰岛素分泌量大于正常人，空腹基值和糖刺激后高峰明显高于正常人，但延迟出现，因此，表现为相对性胰岛素分泌不足且释放反应迟钝。胰岛素分泌不足的原因可能为：遗传因素、自身免疫、胰岛素拮抗。糖尿病患者中约有90%～95%属于2型糖尿病。 2型糖尿病，即非胰岛素依赖型糖尿病（non-insulin-dependentdiabetesmellitus，NIDDM），根据体重可分为肥胖和不出现肥胖两
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良解读
小鼠血管平滑肌细胞原代培养方法的改良 [ 08-10-30 13:48:00 ] 作者：吴建芳编辑：studa20 【摘要】目的建立一种简单方便但高效的血管平滑肌细胞原代培养方法。方法改良酶消化法。结果用该法培养细胞传代生长快，细胞纯度达98% 以上，足以满足各种细胞试验需求。结论与传统方法相比该法简单经济，试验成功率高，节省材料和时间，而且可获得更多纯度较高的细胞。吴建芳（1972～），女，汉族，青海籍，副教授，硕士 【关键词】小鼠动脉血管平滑肌细胞原代培养 Abstract Objective To create a simple and effective primary culture methods for mouse vascular smooth muscle cells (VSMC). Methods Reformed enzymatic digestion. Results VSMC was grown well and fast, the purity is more than 98% which can meet various cell tests. Conclusion Comparing with traditional methods , this approaches can save much time and more materials, also have better cell quantities and purity. Key words Mouse Aorta VSMC Primary cult 在心血管疾病的基础研究中，对血管平滑肌细胞生物特性的研究是极其重要的一部分，其对揭示血管病变机理至为关键。体外培养平滑肌细胞是常用试验模型，近年来随着细胞培养技术的发展，原代培养的成功率有所提高，但仍然存在许多问题，经验不足者往往要花费大量时间、精力去摸索，不但影响试验进程而且浪费材料，而有些组织材料是极为昂贵且很难获得的，所以为了提高平滑肌细胞原代培养的成功率，并在有限的材料下获得好的结果，我们大胆采用了酶消化法（常规采用组织块培养法），从取材方法及消化步骤等方面进行了改良，试验结果证实该法简单经济，成功率高，细胞生长快，纯度高，现介绍如下。 1 材料与试剂 1．1 组织来源：C57BL/6J小鼠(鼠龄8周以后)主动脉。 1．2 试剂：鼠抗SMC-α -actin ,Cy2 conjugated affinity purified anti-mouse IgG［H/L］，戊巴比妥钠注射液。 1．3 培养基：在DMEM 培养基中添加１５％胎牛血清、１％青霉素、链霉素、１％谷氨酰胺，过滤除菌备用（不要超过四4周）。 1．4 酶消化液：Collagenase TypeⅡ 7 mg 溶于5 ml DMEM 培养基中(无血清)，过滤除菌即用。
平滑肌细胞培养-文献版解读
01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养 1.1 细胞培养 1.1.1 培养液配制 DMEM(美国Gibco公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素 (100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,美国Hyclone)。 1.1.2 培养器皿 25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。1.1.3 大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。每次取材2~3只大鼠。贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。待有细胞从组织块周围游出后换液。 1.1.4 原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。将细胞悬液一分为二接种到新的培养瓶中,补足培养液(每瓶3~4ml)。未消失的组织块会随细胞换液、传代而除去。 1.3 培养细胞的鉴定 1.3.1 形态学用相差显微镜常规观察细胞生长形态及生长规律,并依常规制作电镜标本进行观察。 1.3.2 免疫组织化学鉴定特异性鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(福建迈新生物技术公司),采用SP法对细胞爬片进行免疫组织化学染色。（α-SM-actin免疫组织化学鉴定） 04协和中国动脉硬化杂志胰酶消化法培养平滑肌细胞 1.1 试剂和动物
大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良
大鼠胰岛细胞原代培养方法的改良 中国医科大学附属第一医院内分泌科(沈阳110001) 吴志香* 王玉霞△ 刘国良 摘 要 目的:探讨一种简单易行的大鼠胰岛细胞培养方法,获取尽可能多的高质量胰岛,并寻找进行体外实验研究的最佳时间和条件。方法:运用胶原酶 原位灌注法分离胰腺, F ico ll400纯化胰岛细胞,双硫腙(D T Z)染色鉴定胰岛,运用倒置显微镜观察细胞生活状态, 放免法检测胰岛素分泌考察胰岛功能。结果:每只大鼠可分离438±27个胰岛 胰腺,细胞存活率为92.3±2.3%,GS IS实验中胰岛素释放指数S I为3.25±0.26。结论:本分离纯化方法可获得数量多,质量高的胰岛细胞,为原代胰岛细胞的体外研究提供实验条件。 主题词 细胞培养 胰岛 生理学 胰岛 分离和提纯 大鼠 An i m provem en t m ethod of pr i m ary culture of w istar ra t pancrea tic islets D ep artm en t of Endocrino logy,the F irst A ffiliated Ho sp ital,Ch ina M edical U n iversity (Shenyang 110001)W u Zh ix iang W ang Yux ia L iu Guo liang ABSTRACT O b jective:To study the effects of iso lating and cu ltu ring the rat pancreatic islets in vitro.M ethods:A fter in traductal infu si on of8210m l co ld H ank’s balanced so lu ti on con tain ing1m g m l of type co llagenase,pancreas w ere su rgically p rocu red and digested at37℃fo r15220m in,and stopped digesti on by co ld H ank’s so lu ti on w hen the em u lsi on appeared.T he islets w ere pu rified by discon tinou s F ico ll den sity gradien t(25%,23%,20.5%and11%)cen trifugati on,and the degree of pu rity w as defined as dith izone stain ing.A n i m ati on of islets w as ob served and in su lin secreti on w as detected. R esu lts:438±27islets w ere p rocu red from one rat,and su rvival rate w as92.3±2.3%,Gluco se sti m u lated in su lin secreti on in vitro show ed the m ean value of in su lin in the low2gluco se m edium w as39.74±2.73mM ,w h ile that of h igh2gluco se m edium w as128.94±8.72mM,the S I w as3.25±0.26.Conclu si on:T h is m ethod cou ld ob tain large quan tities and h igh quality islets,w h ich offered better experi m en tal conditi on s fo r cell study. KEY WORD S Cell cu ltu re Istets of langerham s physi o logy Istets of langerham s iso lati on pu rificati on R ats 近年来许多有关糖尿病方面的研究均利用体外培养的胰岛细胞株作为研究对象,然而源自肿瘤细胞系的细胞株毕竟在基因表达功能上与正常细胞有差别,因此,本研究采用了培养的大鼠原代胰岛细胞作为研究对象,以期更接近在体研究的结果,同时又可避免在体研究很难避免的混杂因素。 材料与方法 1 实验材料 实验动物选择两月龄的健康W istar大鼠,体重250±23g,购自中国医科大学实验动物中心。主要试剂有 型胶原酶(co llagenase typ e ,Sigm a);R PM I1640及 *辽宁中医药大学附属第一医院 △中国医科大学附属第四医院DM E M培养基(G I BCO)、胎牛血清(FB S, H yclone)、青霉素、链霉素(华北制药厂)、F ico ll 400(Pharm acia)、H ank’s液,40目不锈钢网, H EPES(Sigm a)、D T Z(Sigm a)、(OA,北京华美)。胰岛素放免药盒(北京原子高科技核技术应用股份有限公司灵敏度:1.5m I U L;精密度:批内Cvv5%,批间Cvb10%) 2 实验方法 2.1胰岛细胞的分离纯化:胰腺的原位灌注:W istar大鼠禁食16h后,10%水合氯醛腹腔麻醉,常规消毒后经腹中线开腹。暴露胆管,寻找胆管穿过胰腺进入十二指肠处,320丝线穿过(暂不结扎),充分暴露胰尾,在肝门胆管分叉处逆行胆管插管,少量推入含冷却的胶原酶(1m g m l)
改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞解读
改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞 [ 11-03-31 14:28:00 ] 作者：吴海亚，戴元荣，尹娟编辑：studa20 【摘要】目的：改进大鼠气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)的培养方法，了解其生长特性，为研究气道疾病提供体外研究模型。方法：大鼠麻醉后迅速分离支气管树，去除内外膜并用0.2%I型胶原酶消化后，采用改良组织贴块法培养ASMCS，应用形态学和抗SMα-action免疫细 胞化学法鉴定平滑肌细胞。结果：采用改良组织贴块法培养2～6 d，细胞开始从组织块周围长出，5～8 d在组织块附近出现“谷-峰”结构，9～12 d可融合。传代细胞经SMα-action免疫组化SP法染色阳性率达95%以上。结论：改良组织贴块法培养大鼠气道平滑肌细胞具有简便、易行、产量高、纯度高的优点，为研究气道疾病提供良好的体外研究模型。 【关键词】气道;平滑肌;细胞培养;组织贴块法;大鼠 气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCS)是气道的重要结构细胞之一，具有重要的生理作用。ASMCS的异常是呼吸道疾病的重要病理特 征之一，其增生、肥大是气道重塑的关键[1]。Hirst等[2]认为应将平滑肌细 胞作为研究哮喘的标靶。体外培养ASMCS是研究细胞生物学行为、疾病发病机制及其防治手段的基础。本研究采用改良组织贴块法培养出ASMCS，报告如 下。 1 材料和方法 1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠购自上海实验动物中心，体重250～350 g。饲养于温州医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12/12 h。 1.2 主要仪器和试剂 倒置显微镜(NIKON TS100 日本尼康公司);5% CO2培养箱(美国Thermo);25 mL无菌培养瓶(美国Corning公司);RPMI 1640培养基(美国HyClone公司);优级胎牛血清(杭州四季青公司);0.25%胰蛋白酶、0.02% EDTA溶液(美国GIBCO 公司);青链霉素(北京索来宝生物科技有限公司);D-Hanks液(上海捷瑞生物有 限公司);I型胶原酶(美国Sigma公司);SMα-actin单克隆抗体(美国Sigma公司);小鼠免疫组化试剂盒(北京四正柏生物科技有限公司)。 1.3 细胞培养 1.3.1 原代培养：10%水合氯醛(500 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，在75%酒 精溶液中浸泡1 min消毒皮肤(避开口鼻)，取出大鼠并固定于洁净手术台上，